Tài liệu Khảo sát ảnh hưởng của chitosan, gibberellin, một số muối kim loại và dịch chiết tự nhiên lên sự tăng sinh plb và tạo chồi lan hồ điệp phalaenopsis amabilis

Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của Th.S. Trịnh Thị Lan Anh – giảng viên trường đại học Công Nghệ TP.HCM. Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM. Các số liệu, bảng trong bài là hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP.HCM, ngày 17, tháng 08, năm 2016 Sinh viên thực hiện Nguyễn Hoàng Cẩm Tú Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến các thầy cô hiện đang giảng dạy trong khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường cùng toàn thể quý thầy cô đang công tác của trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quãng thời gian học tập và bồi dưỡng tại trường. Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này em xin đặc biệt chân thành cảm ơn cô Th.S Trịnh Thị Lan Anh là người đã tận tình diều dắt, hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý cho em. Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn, các em trong phòng Công nghệ Sinh học Thực vật đã giúp đỡ nhiệt tình, hỗ trợ, đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình làm đồ án, giúp em có thể thực hiện tốt đề tài. Mặc dù em đã cố gắng để hoàn thiện đồ án này bằng tất cả sự nhiệt huyết và năng lực của mình, tuy nhiên không trách khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn. TP.HCM, Ngày 17, tháng 8, năm 2016 Sinh viên thực hiện Nguyễn Hoàng Cẩm Tú Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. v DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ ............................................................................................ vii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. viii LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................... 2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...................................................................... 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................................... 2 5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 3 6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ............................................ 3 7. Kết quả đạt được.................................................................................................. 3 8. Kết cấu của đề tài ................................................................................................. 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5 1.1. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy in vitro ............................................................. 5 1.1.1. Khái niệm ..................................................................................................... 5 1.1.2. Sơ lược quá trình phát triển nuôi cấy in vitro ở Việt Nam ......................... 5 1.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy in vitro ........................................................ 6 1.3. Các bước nhân giống in vitro .............................................................................. 7 1.4. Môi trường nuôi cấy in vitro ............................................................................... 7 1.5. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy in vitro ..................... 8 i Đồ án tốt nghiệp 1.5.1. Auxin ............................................................................................................ 8 1.5.2. Gibberellin (GA) ........................................................................................ 10 1.5.3. Cytokinin .................................................................................................... 11 1.5.4. Abscisic acid (ABA) .................................................................................. 13 1.5.5. Ethylene ..................................................................................................... 13 1.6. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro...................................... 14 1.7. Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và Việt Nam.............................. 16 1.7.1. Tình hình nghiên cứu hoa Lan trên thế giới .............................................. 16 1.7.2. Tình hình nghiên cứu hoa Lan tại Việt Nam............................................. 17 1.8. Sơ lược về chitosan ............................................................................................ 20 1.8.1. Giới thiệu ................................................................................................... 20 1.8.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của chitosan ...................................... 21 1.9. Sơ lược về các chất kháng ethylene ................................................................. 27 1.9.1. Ảnh hưởng của ethylene lên thực vật ........................................................ 27 1.9.2. Các chất kháng ethylene ............................................................................ 29 1.10. Dịch chiết xuất hữu cơ từ trái cây, củ quả ................................................... 30 1.11. Sự phát sinh hình thái thực vật...................................................................... 33 1.12. Sự hình thành và phát sinh hình thái của mô sẹo ........................................ 34 1.12.1. Sự hình thành mô sẹo............................................................................... 34 1.12.1.1. Nuôi cấy mô sẹo .................................................................................... 34 1.12.1.2. Vai trò loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo.. 37 1.12.1.3. Môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo........................................................... 38 1.12.2. Các hình thức phát sinh hình thái của mô sẹo ......................................... 39 1.12.3. Lịch sử nghiên cứu về mô sẹo ................................................................. 41 1.13. Giới thiệu về lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis ......................................... 42 ii Đồ án tốt nghiệp 1.13.1. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................. 42 1.13.2. Phân loại khoa học ................................................................................... 45 1.13.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 45 1.13.4. Điều kiện sinh thái của lan Hồ Điệp........................................................ 47 1.13.5. Các phương pháp nhân giống lan Hồ điệp .............................................. 49 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................... 52 2.1. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................... 52 2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................. 52 2.2.1. Nguồn mẫu ................................................................................................. 52 2.2.2. Môi trường nuôi cấy .................................................................................. 52 2.2.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 53 2.2.4. Điều kiện thí nghiệm.................................................................................. 53 2.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... 53 2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis ................................................ 53 2.3.2.Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis. .......................................... 54 2.3.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của bạc nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis ........................................... 55 2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của cobalt nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis. .................................. 56 2.3.5.Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis ........................................... 57 2.4. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu........................................................... 57 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 59 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis ..................................................... 59 iii Đồ án tốt nghiệp 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của gibberellin lên sự hình thành PLB và tạo chồi từ mô sẹo lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis. ................................... 67 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của bạc nitrate lên sự hình thành PLB và tạo chồi từ mô sẹo lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis..................................... 74 3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của cobalt nitrate lên sự hình thành PLB và tạo chồi từ mô sẹo lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis............................. 81 3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của dịch chiết lên sự hình thành PLB và tạo chồi từ mô sẹo lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis. ................................... 89 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 97 4.1. Kết luận .............................................................................................................. 97 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 99 PHỤ LỤC iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Absisic acid DNA : Deoxynucleotic acid IAA : 3- indoleacetic acid IBA : 3- indolebutyric acid GA3 : Gibberellic acid MS : Murashige và Skoog, 1962 NAA : Napthaleneaxetic acid PLB : Protocorm like body 2,4-D : 2,4-dichlopophenoxyacetic acid 2,4,5-T : 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis. ............................................................... 54 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis. ......................................................... 55 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis. ............................................................... 55 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của Co(NO3)2 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis. ......................................................... 56 Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis. ............................................................... 57 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis sau 8 tuần nuôi cấy.............................................. 60 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis sau 8 tuần nuôi cấy...................................... 68 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của bạc nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis sau 8 tuần nuôi cấy...................................... 75 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của cobalt nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis sau 8 tuần nuôi cấy...................................... 82 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis sau 8 tuần nuôi cấy.............................................. 90 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của chitosan lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ............................................ 61 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ....................................................................... 61 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của gibberellin lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ............................................ 69 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ....................................................................... 69 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của AgNO3 lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy................................................... 76 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy. ...................................................................... 76 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của Co(NO3)2 lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy. ........................................... 83 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của Co(NO3)2 lên sự tăng sinh PLBvà tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy. ...................................................................... 83 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy. ........................................... 91 Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy......................................................................................... 91 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. β-Indolaxetic Acid (IAA) ............................................................................. 9 Hình 1.2. Gibberellic Acid (GA3) ............................................................................. 11 Hình 1.3. 6-benzylaminopurine.................................................................................. 12 Hình 1.4. Absisic Acid (ABA) ................................................................................... 13 Hình 1.5. Ethylene ...................................................................................................... 14 Hình 1.6. Sự đa dạng về hình dáng và màu sắc của lan Hồ điệp .............................. 44 Hình 1.7. Lan Hồ điệp trắng (Phalaenopsis amabilis) .............................................. 45 Hình 3.1. Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy .................................................................................. 62 Hình 3.2. Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................................... 63 Hình 3.3. Ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ........................................................................... 70 Hình 3.4. Ảnh hưởng của gibberellin lên sự hình thành PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ........................................................................... 71 Hình 3.5. Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................................... 77 Hình 3.6. Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................................... 78 Hình 3.7. Ảnh hưởng của Co(NO3)2 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................................... 84 Hình 3.8. Ảnh hưởng của Co(NO3)2 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................................... 85 Hình 3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................................... 92 viii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10. Ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy ........................................................................... 93 ix Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lan Hồ điệp là một món quà của tạo hóa, nó không chỉ là một loài hoa đẹp có giá trị về mặt tinh thần mà còn có giá trị kinh tế cao, đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp hoa cắt cành cũng như hoa trồng chậu trên thế giới. Đã có nhiều nhà vườn mạnh dạn đầu tư chuyển đổi cơ cấu cây trồng từ lúa, hoa màu sang trồng lan và đạt hiệu quả kinh tế cao gấp 2 – 3 lần so với cây trồng khác. Tuy nhiên, ở Việt Nam, nghề trồng lan phát triển chậm hơn so với các nước khác rất nhiều, số lượng sản xuất cây lan hiện nay vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của thị trường. Việc trồng lan trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh lâu nay chủ yếu do tự phát nên diện tích trồng còn nhỏ, trình độ tay nghề nông dân chưa đồng đều, chưa chủ động được nguồn giống. Hơn nữa, lan Hồ điệp là loài sinh trưởng chậm và là một loài rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp trong điều kiện vườn ươm. Ngoài ra, lan Hồ điệp rất dễ xảy ra biến dị nên việc gieo hạt không thể tạo được một số lượng lớn cây con có tính đồng nhất. Để có được số lượng lớn cây giống chất lượng tốt cung cấp cho thị trường sản xuất còn gặp nhiều khó khăn. Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường là tạo ra được số lượng hoa lớn, nguồn hoa mới ổn định,… thì việc nghiên cứu để đạt hiệu quả nhân giống cao trên cây trồng rất đáng được quan tâm. Phương pháp nghiên cứu hình thành PLB từ mô sẹo lan Hồ điệp không những tạo ra được nguồn PLB lớn mà từ PLB có thể tạo cây hoàn chỉnh trong một thời gian ngắn góp phần nhân nhanh giống lan Hồ. Lan Hồ điệp với đặc tính là cây sinh trưởng chậm, khó nhân giống, tỷ lệ nảy mầm của hạt trong tự nhiên khá thấp thì việc thúc đẩy quá trình trao đổi chất để giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt hơn rất đáng được quan tâm. Các nghiên cứu trước đó cho thấy nguồn đạm và nguồn tinh bột có ảnh hưởng đặc biệt đến sự hình thành PLB từ mô sẹo. Các hợp chất hữu cơ được dùng phổ biến trong nuôi cấy in vitro như nước dừa, các loại tinh bột, peptone,… đều là những nhân 1 Đồ án tốt nghiệp tố đóng vai trò không kém phần quan trọng trong quá trình nhân giống lan Hồ điệp. Để tìm hiểu thêm về sự hình thành PLB từ mô sẹo và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống lan Hồ điệp, tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của chitosan, gibberellin, một số muối kim loại và dịch chiết tự nhiên lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi của lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis”. 2. Mục đích nghiên cứu Xác định ảnh hưởng của chitosan, gibberellin, một số muối kim loại và dịch chiết có nguồn gốc tự nhiên lên khả năng tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp nhằm thiết lập môi trường thích hợp cho sự hình thành PLB góp phần nhân nhanh giống lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là PLB lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis được sử dụng làm nguồn mẫu để nghiên cứu về ảnh hưởng của chitosan, gibberellin, bạc nitrate, cobalt nitrate và dịch chiết lên sự hình thành PLB. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi của lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis; - Khảo sát ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi của lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis; - Khảo sát ảnh hưởng của bạc nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi của lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis; - Khảo sát ảnh hưởng của cobalt nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi của lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis; - Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết (Khoai Tây, Cà Rốt, Chuối, Táo) lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi của lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis; 2 Đồ án tốt nghiệp 5. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần, ghi nhận kết quả trung bình. Các số liệu sau khi thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm Statistical Analysis Systems 9.0 (SAS) và chương trình MicroSoft Excel 2010®. 6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi của lan Hồ điệp sẽ giúp tạo ra nguồn PLB lớn trong một thời gian ngắn, giúp đạt hiệu quả nhân giống cao. Từ đó, góp phần phục vụ cho những ứng dụng thực tế quan trọng, giúp nâng cao chất lượng cây trồng, mang lại hiệu quả kinh tế. Ý nghĩa thực tiễn: Nghiên cứu sự tăng sinh PLB của lan Hồ điệp góp phần rất lớn trong công tác nhân nhanh giống cây trồng đồng thời mở ra triển vọng trong việc tạo được cây hoa lan Hồ điệp có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu. Từ đó, có thể tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng tốt, đồng thời làm giảm giá thành cây giống, góp phần giải quyết vấn đề thiếu hụt trầm trọng cây giống lan Hồ điệp chất lượng cao ở Việt Nam trong giai đoạn hiện nay. 7. Kết quả đạt được - Xác định được nồng độ chitosan thích hợp cho sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis; - Xác định được nồng độ gibberellin thích hợp cho sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis; - Xác định được nồng độ bạc nitrate thích hợp cho sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis; - Xác định được nồng độ cobalt nitrate thích hợp cho sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis; 3 Đồ án tốt nghiệp - Xác định được loại dịch chiết (Khoai Tây, Cà Rốt, Chuối, Táo) thích hợp cho sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis; 8. Kết cấu của đề tài Đề tài bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy in vitro 1.1.1. Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. 1.1.2. Sơ lược quá trình phát triển nuôi cấy in vitro ở Việt Nam Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm 1980. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô này và đã mang lại nhiều thành tựu nổi bậc. Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm để đưa ra sản xuất nhanh chóng hơn nhiều phương pháp cổ điển, nhờ vậy mà một người có thể sản xuất ra 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc Hồng. Ở miền Bắc, nhân bản vô tính ở thực vật được ứng dụng hầu hết các nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gốc quý như: Vù hương – loại gốc tiết tinh dầu dùng trong dược, mỹ phẩm, cây Đăng lấy gốc, chè Vang – một loại chè rất khó trồng. Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống lúa chịu hạn DR1, nhân bản nhiều loại khoai tây, mía,… Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa Học – Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch Đàn Europhylla. Trung tâm ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây Lô hội, một loài dược liệu quý ở địa phương. Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất phong lan lớn trong khu vực. Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây 5 Đồ án tốt nghiệp trồng Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng. Hiện nay 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô. Năm 2002, Lê Thị Kim Đào và Trung tâm ứng dụng khoa học kỹ thuật Bình Định đã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm Hương, Bạch Đàn Urophylla, cây Hồng, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho chất lượng cây giống tốt và hiệu quả kinh tế cao. Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, từ một số tế bào gốc của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu học viện Quân y đã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn bộ quy trình mất 10 đến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6 năm sâm mới cho thu hoạch. Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là loài lan Hài Hồng – loài lan duy nhất có hương thơm trên thế giới,… 1.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy in vitro Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học như Nguyễn Văn Uyển (1993) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận định: - Đó là tính toàn thể của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời. Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng. - Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (Cam, Quýt). - Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protôcm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (Khoai Tây), cây cảnh (Phong Lan), cây lâm nghiệp (Bạch Đàn,...). 6 Đồ án tốt nghiệp - Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi Quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm. - Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo. - Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen. - Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó khả năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống. - Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai. - Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mất tính toàn thể của tế bào. Đồng thời nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh tế. Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta là tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1995). 1.3. Các bước nhân giống in vitro - Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy; - Tạo thể nhân giống in vitro; - Nhân giống in vitro; - Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh; - Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm. 1.4. Môi trường nuôi cấy in vitro Công thức môi trường của Murashige và Skoog (1962) là thích hợp cho phần lớn các trường hợp nuôi cấy in vitro. Môi trường gồm các nhóm chất căn bản sau: 7 Đồ án tốt nghiệp • Các chất vô cơ đa lượng: N (NO3- và NH4+), P, K, S, Ca và Mg. • Các nguyên tố vi lượng: Fe, Mn, Zn, Br, Cu, Co và Mo • Các vitamin: nhiều loại (nicotinic acid, biotin,…) mà quan trọng nhất là thiamine (vitamin B1) dưới dạng thiamine -HCl. • Nguồn carbon: sucrose hoặc glucose. • Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: các auxin và cytokinin, kích thích sự phân bào, kiểm soát sự phân bào, kiểm soát sự biệt hóa tế bào và phát sinh hình thái. Các auxin thường dùng: 2,4-D (2,4 Dichlorophenoxyaceticacid), IAA (indole acetic acid), IBA (indole 3-butyric acid). Các cytokinin có BAP (6benzylaminopurine), zea (zeatin),… Ngoài ra còn có GA (gibberellic acid) và ABA (abscisic acid). • Agar sử dụng cho môi trường đặc. Hệ thống chiếu sáng hợp lý cần cho sự phát triển của tế bào thực vật. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy. Nhiều yếu tố của môi trường đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu như môi trường khoáng cơ bản, nồng độ và các loại đường, chất điều hòa sinh trưởng thực vật. 1.5. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy in vitro Chẩt sinh trưởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý nào đó ở thực vật, ở những nồng độ thấp. Chúng không phải là các chất dinh dưỡng hay các vitamin dùng trong thực vật. Hiện nay các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được chia thành 5 nhóm chính: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylene. 1.5.1. Auxin Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. 8 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1. β-Indolaxetic Acid (IAA) Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Ở thực vật bậc cao, auxin được tổng hợp chủ yếu ở đỉnh ngọn chồi và từ đó được vận chuyển xuống dưới (hướng gốc). Ngoài đỉnh ngọn, các cơ quan khác như lá non, quả non, phôi hạt đang sinh trưởng và cả tầng phát sinh cũng có khả năng tổng hợp auxin. Các có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ,… Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ,… Đối với nuôi cấy mô, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA, IAA (3-indoleacetic acid), NAA (napthaleneaxetic acid), 2,4-D và 2,4,5-T (trichlorophenoxyacetic acid). Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển mô sẹo. Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng. 9