Tài liệu Khảo sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ dịch chiết rong nâu sargassum duplicatum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ HẢI ÂU KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC DUNG MÔI CHIẾT LÊN HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ DỊCH CHIẾT RONG NÂU SARGASSUM DUPLICATUM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ HẢI ÂU KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC DUNG MÔI CHIẾT LÊN HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ DỊCH CHIẾT RONG NÂU SARGASSUM DUPLICATUM LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 60540104 Quyết định giao đề tài: 369/QĐ-ĐHNT ngày 5 tháng 5 năm 2016 Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: 24/08/2017 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. PHẠM ĐỨC THỊNH 2. TS. ĐẶNG XUÂN CƯỜNG Chủ tịch Hội đồng: Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này. Khánh Hòa, Ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hải Âu i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, Lãnh đạo và các Thầy Cô giáo trong Khoa Công nghệ Thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho học viên trong quá trình học tập nghiên cứu. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. NCVC Phạm Đức Thịnh – Phó Viện trưởng và TS. NCVC. Đặng Xuân Cường cùng các cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và đã tận tâm tận lực hướng dẫn học viên thực hiện đề tài. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, ủng hộ, động viên trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Khánh Hòa, ngày tháng năm 2017 Học viên thực hiện Nguyễn Thị Hải Âu ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN......................................................................................................................i LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................................vii DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................... viii MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................1 I. Đặt vấn đề ..............................................................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................................2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN...................................................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU ....................................................................................3 1.1.1. Giới thiệu Rong nâu Việt Nam ....................................................................................3 1.1.2. Đặc điểm rong nâu ........................................................................................................4 1.1.3. Thành phần hóa học có trong rong nâu ......................................................................5 1.2. TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN .....................................................................................6 1.2.1. Giới thiệu chung về fucoidan .......................................................................................6 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc của fucoidan ..................................................................................7 1.2.3. Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan trong các loài rong nâu .......... 11 1.2.4. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan......................................................... 13 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI ............................ 16 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM ................................................................................................................................................. 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 25 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 25 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................... 25 2.2.1. Phương pháp phân tích .............................................................................................. 25 2.2.2.1. Phương pháp định lượng fucoidan ........................................................................ 25 2.2.2.2. Phương pháp phân tích hàm lượng tổng carbohydrate ....................................... 26 iii 2.2.2.3. Phương pháp phân tích thành phần đường đơn ................................................... 26 2.2.2.4. Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate ........................................................... 27 2.2.2.5. Phương pháp phân tích hàm lượng axít uronic.................................................... 27 2.2.2.6. Phương pháp phổ hồng ngoại IR........................................................................... 27 2.2.2.7. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ............................................... 28 2.2.2.8. Phương pháp định lượng protein ........................................................................... 29 2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .............................................................................. 29 2.2.3. Phương pháp chiết tách fucoidan và phân đoạn fucoidan ..................................... 31 2.2.4. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết lên hàm lượng của fucoidan thô cùng các phân đoạn tinh chế của fucoidan trong dịch chiết rong Sargassum duplicatum.......................................................................................................... 30 2.2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết lên thành phần hóa học của fucoidan thô và các phân đoạn của fucoidan....................................................... 34 2.4. HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG ............................... 35 2.4.1. Hóa chất ....................................................................................................................... 35 2.4.2. Thiết bị chủ yếu đã sử dụng ...................................................................................... 35 2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU .......................................................................... 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 36 3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THU NHẬN FUCOIDAN TỪ DỊCH CHIẾT RONG MƠ SARGASSUM DUPLICATUM .................................................................................... 36 3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ DỊCH CHIẾT RONG MƠ SARGASSUM DUPLICATUM ....................................................................... 40 3.3. PHÂN ĐOẠN TINH CHẾ VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN ............................................................................................................. 46 3.4. XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CỦA FUCOIDAN VÀ ĐỘ TINH SẠCH CỦA FUCOIDAN TRONG SẢN PHẨM.................................................................................... 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 57 1. KẾT LUẬN........................................................................................................................ 57 2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 58 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BKC : Benzadelkonium Chlori C2 : Vị trí cacbon số 2 C3 : Vị trí cacbon số 3 C4 : Vị trí cacbon số 4 CS : Cộng sự CTAB : Cetyl trimethylamonium bromide Da : Dalton Dd : Dung dịch DEAE : Diethylaminoethanol EtOH : Cồn Gal : Galactose Glc : Glucose Gr (+) : Gram dương Gr (-) : Gram âm Fuc : Fucose F20 : Phân đoạn thứ 20 HIV : Human Immunodeficiency Virus HPLC : High Performance Liquid Chromatography IR : Infracted spectroscopy L.B.Nga : Liên Bang Nga LPO : peroxide lipid Man : Mannose MWCO : Moleculare Weight Cut Off v NMR : Nuclear Magnetic Resonance PTFE : Poly Tetra Fluorethylene S. : Sargassum SD : Standard Deviation SmF3 : Phân đoạn thứ 3 của fucoidan từ rong Sargassum mcclurei TCA : Axít triclorua acetic TFA : Trifluoroacetic US : United States VNĐ : Việt nam đồng Xyl : Xylose vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần hóa học (%) của một số loài rong nâu ............................................5 Bảng 1.2: Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan chiết từ một số loài rong khác nhau ..................................................................................................................................6 Bảng 1.3: Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan chiết từ một số loài rong khác nhau ................................................................................................................................ 11 Bảng 1.4. Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan thô từ bốn loài rong nâu ở Việt Nam ................................................................................................................................. 12 Bảng 1.5: Các phân số fucoidan thô thu được từ rong Undaria Pinnatifida ................ 12 Bảng 1.6: Hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan thô từ rong S. Swartzii .... 13 Bảng 2.1: Các đỉnh đặc trưng IR của fucoidan .................................................................. 28 Bảng 3.1: Hàm lượng và thành phần hóa học cơ bản của các loài rong nâu ở Việt Nam ................................................................................................................................................. 36 Bảng 3.2. Hàm lượng và thành phần monosaccharide của các phân đoạn fucoidan từ rong S. duplicatum khi sử dụng dung môi chiết là nước .................................................. 48 Bảng 3.3. Hàm lượng và thành phần monosaccharide của các phân đoạn fucoidan chiết từ rong S. duplicatum khi sử dụng dung môi chiết là dung dịch axít HCl pH 2 .......... 49 Bảng 3.4. Hàm lượng và thành phần monosaccharide của các phân đoạn fucoidan chiết từ rong S. duplicatum khi sử dụng dung môi chiết là dung dịch CaCl2 2%................... 51 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Phiến lá và phao rong nâu ......................................................................................4 Hình 1.2: Một số các công trình công bố có liên quan đến fucoidan từ năm 1980-2010 ....................................................................................................................................................7 Hình 1.3: Cấu trúc fucoidan từ Fucus vesiculosus mô tả vào năm 1950 ..........................8 Hình 1.4: Cấu trúc fucoidan từ Fucus distichus L ..............................................................8 Hình 1.5. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus ....................................................................8 Hình 1.6. Cấu trúc fucoidan từ Ascophyllum nodosum .......................................................9 Hình 1.7: Cấu trúc của fucoidan trong kết quả đo ESI-MS ion dương của một đoạn trong phân đoạn fucoidan F20 từ rong S. wartzii .............................................................. 10 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ....................................................................... 30 Hình 2.2. Qui trình chiết và tách phân đoạn fucoidan theo bản quyền WO 2005/014657 ................................................................................................................................................. 31 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng của fucoidan thô và các phân đoạn của fucoidan ................................................... 33 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của ba dung môi chiết lên thành phần hóa học của fucoidan thô và các phân đoạn của fucoidan............................ 34 Hình 3.1: Khối lượng fucoidan thô khi chiết bằng ba dung môi..................................... 37 Hình 3.2: Sự biến đổi hàm lượng fucoidan tinh khiết khi chiết bằng ba dung môi ...... 38 Hình 3.3: Dịch chiết rong nâu S. duplicatum chiết bằng ba dung môi ........................... 39 Hình 3.4: Fucoidan thô thu được khi chiết bằng ba dung môi ....................................... 39 Hình 3.5: Thành phần monosaccharide của fucoidan khi chiết bằng ba dung môi ...... 41 Hình 3.6: Sự biến đổi hàm lượng tổng carbohydrate của fucoidan khi chiết bằng ba dung môi ................................................................................................................................. 42 Hình 3.7: Sự biến đổi hàm lượng sulfate của fucoidan khi chiết bằng ba dung môi .... 43 Hình 3.8: Sự biến đổi hàm lượng axít uronic của fucoidan khi chiết bằng ba dung môi ................................................................................................................................................. 43 viii Hình 3.9: Sự biến đổi hàm lượng protein của fucoidan khi chiết bằng ba dung môi ... 44 Hình 3.10: Phân đoạn của fuccoidan chiết từ rong S. duplicatum sử dụng dung môi chiết là nước ........................................................................................................................... 46 Hình 3.11: Phân đoạn của fuccoidan chiết từ rong S. duplicatum sử dụng dung môi chiết là dung dịch axít HCl pH 2 ......................................................................................... 48 Hình 3.12: Phân đoạn của fuccoidan chiết từ rong S. duplicatum sử dụng dung môi chiết là dung dịch CaCl2 2% ................................................................................................ 49 Hình 3.13: Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum sử dụng dung môi chiết là nước ................................................................................................ 52 Hình 3.14: Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum sử dụng dung môi chiết là axít HCl pH 2 ................................................................................ 53 Hình 3.15: Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum sử dụng dung môi chiết là muối CaCl2 2 % ............................................................................ 53 Hình 3.16: Phổ 1H-NMR của fucoidan chiết từ rong nâu S. duplicatum sử dụng dung môi chiết là muối CaCl2 2 %................................................................................................ 55 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Khảo sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum Giới thiệu về đề tài Fucoidan là tên gọi chung cho các polysaccharide sulfate có nguồn gốc từ rong nâu, fucoidan được nghiên cứu lần đầu tiên bởi Kylin cách đây hơn 100 năm [27]. Fucoidan chứa các thành phần chính là fucose và sulfate và một số loại đường đơn khác như galactose, glucose, xylose, mannose, rhamnose và đôi khi là cả các gốc axetyl. Nhờ sự đa dạng về cấu trúc mà fucoidan sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng ung thư, kháng viêm, điều hòa miễn dịch, kháng đông tụ máu, kháng virút,...với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung, mỹ phẩm và dược phẩm. Vì vậy, fucoidan đã và đang được quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Fucoidan từ rong nâu Việt Nam bắt đầu được nghiên cứu khoảng hơn 10 năm trở lại đây và số các công trình công bố về fucoidan của rong nâu Việt Nam vẫn còn ít, đặc biệt là thông tin về thành phần hóa học và các nghiên cứu về quy trình chiết tách của fucoidan. Trong khi đó thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan biến đổi phụ thuộc vào loài rong cũng như các phương pháp chiết tách, các dung môi chiết tách. Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng của các dung môi chiết tách lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ chế biến để phát triển chúng thành các sản phẩm hữu ích đối với sức khỏe con người. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài nghiên cứu: “Khảo sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum” được thực hiện. Mục tiêu của đề tài (1) Xác định được hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan cũng như các phân đoạn tinh chế của fucoidan từ dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum. (2) Đánh giá ảnh hưởng của các dung môi chiết tách lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan cũng như các phân đoạn tinh chế từ dịch chiết rong nâu. x Phương pháp nghiên cứu Rong nâu S. duplicatum sử dụng nghiên cứu có đặc điểm sau: rong có màu nâu đặc trưng, rong đã trưởng thành và không bị dập nát. Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các dung môi chiết (nước, dd axít HCl pH 2, dd CaCl2 2 %) lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan trong dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum. Sản phẩm fucoidan thu được đem phân tích hàm lượng fucoidan, hàm lượng tổng carbohydrate, hàm lượng sulfate, hàm lượng axít uronic, hàm lượng protein và thành phần đường. Sau đó, tiến hành tách phân đoạn tinh chế fucoidan từ 3 mẫu fucoidan thô đã thu ở trên và đem phân tích hàm lượng và thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan, từ đó đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần của các phân đoạn thu được từ fucoidan thô. Dữ liệu thực nghiệm được phân tích trên phần mềm SPSS 16.0 với kiểm định LSD để kiểm tra sự khác biệt giữa các giá trị trung bình với mức ý nghĩa α = 0,05. Kết quả thu được 1. Hàm lượng fucoidan thu nhận từ rong nâu Sargassum duplicatum khi chiết với 3 dung môi: khi chiết dd CaCl2 2 % là cao nhất 2,77 %, khi chiết dd axít pH 2 là 2,28 %, khi chiết nước % là 2,15 %. 2. Phân tích thành phần các gốc đường cho thấy fucoidan thu nhận từ rong nâu Sargassum duplicatum khi chiết bằng 3 dung môi đều có thành phần đường fucose, mannose, galactose, xylose và glucose. Trong đó thành phần fucose và galactose có hàm lượng lớn hơn các thành phần đường còn lại. 3. Phổ hồng ngoại IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR cho thấy fucoidan thu nhận từ rong Sargassum duplicatum thuộc nhóm galactofucan sulfate hóa có nhóm sunfate nằm ở vị trí C4 của vòng fucopyranosse. 4. Fucoidan từ rong nâu Sargassum duplicatum chiết bằng ba dung môi đã được tách phân đoạn và phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn thu được. Chiết fucoidan bằng nước tách được 3 phân đoạn fucoidan, khi chiết bằng dd axít HCl pH 2 tách được 2 phân đoạn fucoidan, khi chiết bằng dd CaCl2 2 % tách ra được 2 phân đoạn fucoidan. Khánh Hòa, ngày .... tháng .... năm 2016 xi MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề Rong nâu Sargassum (Lớp Phaeophyceae) – nguồn tài nguyên sẵn có và dồi dào trong đại dương với hơn 400 loài đã được mô tả. Ở Việt Nam có trữ lượng rong nâu tự nhiên khá lớn vào khoảng 10.000 tấn khô/năm, với hơn 120 loài. Rong nâu là loài rong biển có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, trong đó có một số hoạt chất sinh học đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm và các sản phẩm chức năng [47]. Fucoidan là tên gọi chung cho các polysaccharide sulfate có nguồn gốc từ rong nâu, fucoidan được nghiên cứu lần đầu tiên bởi Kylin cách đây hơn 100 năm [29]. Fucoidan từ rong nâu có cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng và khả năng phân nhánh của chúng với các vị trí sulfate được xếp đặt không theo qui luật. Fucoidan chứa các thành phần chính là fucose và sulfate và một số loại đường đơn khác như galactose, glucose, xylose, mannose, rhamnose và đôi khi là cả các gốc axetyl. Nhờ sự đa dạng về cấu trúc mà fucoidan sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng ung thư, kháng viêm, điều hòa miễn dịch, kháng đông tụ máu, kháng virút,...với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung, mỹ phẩm và dược phẩm. Vì vậy, fucoidan đã và đang được quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Fucoidan từ rong nâu Việt Nam bắt đầu được nghiên cứu khoảng hơn 10 năm trở lại đây và số các công trình công bố về fucoidan của rong nâu Việt Nam vẫn còn ít, đặc biệt là thông tin về thành phần hóa học và các nghiên cứu về quy trình chiết tách của fucoidan. Trong khi đó thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan biến đổi phụ thuộc vào loài rong cũng như các phương pháp chiết tách, các dung môi chiết tách. Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng của các dung môi chiết tách lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ chế biến để phát triển chúng thành các sản phẩm hữu ích đối với sức khỏe con người. Sargassum duplicatum là loài rong nâu phân bố rộng và có thể khai thác trong các vùng ven biển miền Nam Việt Nam. Đây là loài được cho là có tiềm năng về hoạt tính sinh học cao. Tuy nhiên, thông tin về ảnh 1 hưởng các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan trên loài rong Sargassum hiện nay rất hạn chế. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài nghiên cứu: “Khảo sát ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum” được thực hiện. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan cũng như các phân đoạn tinh chế của fucoidan từ dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum. Đánh giá ảnh hưởng của các dung môi chiết tách lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan cũng như các phân đoạn tinh chế từ dịch chiết rong nâu Sargassum duplicatum. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thu nhận fucoidan từ rong nâu S. duplicatum theo các dung môi chiết tách khác nhau (chiết bằng nước, chiết bằng dung dịch axít HCl pH=2, chiết bằng dung dịch CaCl2 2 %). - Phân tích hàm lượng và thành phần hóa học của các sản phẩm fucoidan thu được. - Tách phân đoạn và phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan. - Đánh giá ảnh hưởng của các dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan và các phân đoạn tinh chế của fucoidan., 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài Các kết quả của đề tài là cơ sở cho việc sản xuất fucoidan tự nhiên chất lượng tốt từ rong nâu, đáp ứng nhu cầu nâng cao sức khỏe cộng đồng cũng như giá trị kinh tế của nguồn tài nguyên rong nâu ở Nha Trang. 5. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Luận văn là cơ sở để thu nhận fucoidan từ rong nâu tại Khánh Hòa là cơ sở cho việc sản xuất thực phẩm chức năng chứa fucoidan, hỗ trợ chữa bệnh cho con người. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU 1.1.1. Giới thiệu rong nâu Việt Nam Năm 1837 cuộc thám hiểm bờ biển Việt Nam được thực hiện trên tàu “La Bonite”, Gaudichaud đã thu được một loài Turbinaria và 4 loài Sargassum, sau đó Busseuil thu thêm 4 loài nữa. Mãi đến năm 1954 Dawson đến làm việc tại Viện Hải Dương Học Nha Trang có mô tả thêm 2 loài. Toàn bộ các mẫu vật đó hiện nay đều không còn lưu giữ tại Việt Nam. Giáo sư Phạm Hoàng Hộ năm 1961 trong luận án đã mô tả 15 loài, đến năm 1967 mô tả được 41 loài ở Miền bắc, Nguyễn Hữu Dinh trong luận án năm 1972 mô tả được 22 loài, nếu so với rong Miền nam đã bổ sung được 9 loài cho hệ rong mơ Việt Nam. Năm 1992 Nguyễn Hữu Đại trong luận án đã mô tả 52 loài và trong “Rong mơ Việt Nam nguồn lợi và sử dụng” 1997 đã mô tả 68 loài [8]. Hầu hết các loài rong nâu sinh trưởng và phát triển ở dạng sống bám với hình thức sinh sản chủ yếu là hữu tính, thích hợp với điều kiện sinh thái môi trường có độ mặn cao, nước trong và có sóng. Vì vậy rong nâu phân bố phổ biến ở các bãi triều đáy cứng (đá tảng, đá, san hô chết, các rạn ngầm...) ven biển và các đảo. Do đặc điểm của địa hình có nhiều núi ở ven biển hoặc lấn ra sát biển, tạo thành nhiều mũi và bãi triều đáy đá cứng và có nhiều rạn san hô chết kéo dài, độ muối ổn định và cao quanh năm, các dòng sông ngắn và có nhiều đảo, nên vùng biển Đà Nẵng (chân đèo Hải Vân, bán đảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao Chàm, Núi Thành), Quảng Ngãi (Bình Châu, đảo Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình Định (Phù Mỹ, Qui Nhơn), Phú Yên (vịnh Xuân Đài, Cù Mông), Khánh Hòa (vịnh Văn Phong, Hòn Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh Phước) có nhiều rong nâu. Còn vùng bờ biển từ Bình Thuận đến Bà Rịa-Vũng Tàu, ven biển có nhiều bãi triều đáy cát, chỉ có một ít mũi bãi triều đáy đá ở mũi Né, Long Hương (Bình Thuận), Long Hải, Vũng Tàu (Bà Rịa - Vũng Tàu) nên rong nâu không nhiều. Đoạn bờ biển Tây Nam Bộ thuộc tỉnh Kiên Giang chỉ từ Hòn Chông, Hòn Trẹm (xã Bình An) đến thị xã Hà Tiên, Mỹ Đức, giáp biên giới Campuchia, xuất hiện nhiều bãi triều đáy đá và các đảo, độ muối cao và ổn định mới có rong nâu phát triển. Nhìn một cách tổng quan vùng ven biển và đảo từ 3 Đà Nẵng đến Vũng Tàu và huyện Hà Tiên (từ xã Bình An đến Mỹ Đức Hà Tiên) là hai khu vực ở ven biển phía Nam Việt Nam rong nâu phân bố tập trung. 1.1.2. Đặc điểm rong nâu Rong nâu là loài rong to mọc thành bụi, có nhánh mang nhiều phiến dạng của lá, phiến có răng mịn giống như lá mơ do đó có tên là rong lá mơ hay gọi tắt là rong mơ. Các loài rong nâu đều có phao, phao nhiều hay ít to nhỏ khác nhau, hình dạng của phao là hình cầu trái xoan, đường kính của phao nhỏ khoảng 0,5:0,8 mm, phao lớn khoảng 5:10 mm, phao có thể mang cánh hoặc không. Nhờ có hệ thống phao rong luôn giữ được vị trí thẳng đứng môi trường biển [4]. Hình 1.1: Phiến lá và phao rong nâu Sargassum duplicatum Rong nâu mọc trên tất cả các loài vật bám cứng, trên các thành vách đá dốc đứng, các bãi đá tảng, các vùng có đá ngầm hay san hô ngầm, nhưng thích nghi nhất là trên vật bám đá san hô. Trên vùng san hô chết, chúng mọc thành quần thể dày, phân bố thành quần thể dày, phân bố tương đối đều, mật độ khi rong trưởng thành có thể đạt 10 cá thể/dm2, cho nên vào mùa phát triển của chúng rất ít các loài rong biển khác có thể mọc chen được vào trong quần thể rong này [4]. Mùa vụ rong nâu có sự sai khác chút ít tùy thuộc từng loài, nơi phân bố, tùy các điều kiện môi trường sống,... nhưng nhìn chung quy luật về mùa vụ khá rõ rệt. Chúng tăng trưởng rất mạnh từ tháng 2 đến tháng 3, đa số các loài có kích thước tối đa vào tháng 3, 4 và hình thành các cơ quan sinh sản, sau đó sẽ bị sóng nhổ tấp vào bờ và tàn lụi. Đến tháng 7 các bãi rong đều trơ trụi. Một số loài như S. mcclurei, S. kjellmanianum, S. polycystum phát triển và tàn lụi sớm (tháng 4). Trong khi đó các loài ở vùng dưới triều như S. binderi, S. microcystum,... mọc chậm hơn, đến tháng 6, 7 đôi nơi vẫn còn quần thể rong này. Một vài loài rong 4 thích nghi trong các vùng vịnh yên sóng có thể tồn tại và phát triển tốt vào tháng 7 như S. polycystum và S. longicaulis [4]. Trong luận văn này, loài rong Sargassum duplicatum là loài mới và cũng có sản lượng ở Khánh Hòa, hiện ở Việt Nam chưa có công bố cụ thể nào về ảnh hưởng của các dung môi chiết đến fucoidan của một loài rong nâu cụ thể. Do vậy chọn loài rong S. duplicatum làm nguyên liệu để đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết lên hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ rong nâu. Từ đó lựa chọn loại dung môi tối ưu với mục đích sử dụng khác nhau của fucoidan. 1.1.3. Thành phần hóa học có trong rong nâu Rong nâu có chứa đa dạng các thành phần hóa học, chúng đều là các thành phần có giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như dược liệu bao gồm: các axít amin, các axít béo nhiều nối đôi, các vitamin và khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminaran, alginate và fucoidan (Bảng 1.1). Trong số các hợp chất polysaccharide của rong nâu thì fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do chúng sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị (kháng u, kháng đông tụ máu, kháng virút, kháng viêm, chống oxi hóa,...) với tiềm năng ứng dụng rất lớn để làm dược liệu [31,65]. Bảng 1.1: Thành phần hóa học (%) của một số loài rong nâu [5] Loài Ascophyllum nodossum Laminaria digitata Alaria esculenta Nước 70-85 73-90 73-86 Tro 15-25 73-90 73-86 Alginic acid 15-30 20-45 21-42 0 0 0 Laminaran 0-10 0-18 0-34 Mannitol 5-10 4-16 4-13 Fucoidan 4-10 2-4 Nd Floridosid 0 0 0 Protein 5-10 8-15 9-18 Chất béo 2-7 1-2 1-2 Tamin 2-10 0,1 0,5-6,0 Xylan 5 Kali 2-3 1,3-3,8 Nd Natri 3-4 0,9-2,2 Nd Magie 0,5-0,9 0,5-0,8 Nd Iốt 0,01-0,1 0,3-1,1 0,05 1.2. TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN 1.2.1. Giới thiệu chung về fucoidan Fucoidan là một anion polysaccharide sulfate hóa nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này được phân lập và mô tả lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 [29], khi đó nó có tên là “fucoidin” theo tên gọi của gốc đường fucose là thành phần chính tạo nên polysaccharide này. Các polysaccharide rong nâu thực tế có thành phần phức tạp hơn nhiều. Ngoài fucose và sulfate, chúng còn có thể chứa nhiều các monosaccharide khác như: galactose, xylose, manose, axít glucuronic,... đồng thời có thể bị acetyl hóa một phần. Nhờ sự đa dạng về thành phần và cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virút, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogentic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, v.v... [31]. Nhờ vậy, fucoidan đã trở thành đối tượng thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng, dược liệu. Cùng với số đó các công trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng 10 năm trở lại đây (Hình 1.2) [38]. 6 Hình 1.2: Một số các công trình công bố có liên quan đến fucoidan từ năm 19802010 [38] 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc của fucoidan Fucoidan là một polysaccharide sulfate được tách chiết từ rong nâu, có cấu tạo gồm mạch chính có mặt α-L-Fucose sulfate, ngoài ra có thể có D-galactose, Dmannose, D-xylose, L-rhamnose, D-glucose, axít D-uronic và có thể có phân bố ngẫu nhiên của các gốc acetyl [54]. Cấu trúc của fucoidan có trong rong nâu là vô cùng phức tạp và không đồng nhất với những thay đổi về mô hình liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfate cũng như các gốc đường [11]. Vì vậy, việc phân tích cấu trúc của fucoidan vẫn còn là vấn đề nan giải, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật phổ NMR phân giải cao mới nhất. Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan được công bố, nhưng chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan. Dưới đây là một số ví dụ về cấu trúc của fucoidan được phân lập từ rong biển: Percival và Ross (1950) đã mô tả cấu trúc fucoidan từ rong Fucus vesiculosus là một polysaccharide có bộ khung mạch chính là α-L-fucose(1→2), vị trí mạch nhánh là gốc đường α-L-fucose(1→3) và nhóm sulfate chủ yếu gắn ở vị trí C4 của gốc đường L-fucospynanose (Hình 1.3) [54]. 7