Tài liệu Khai thác dữ liệu est

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP K H A I T H Á C DỮ L I Ệ U E S T (E x p r es s ed Se q ue n ce T a g s ) N H Ằ M P H Á T HI Ệ N M I C R O S AT E L L I T E P H ỤC V Ụ C H O C Ô N G T Á C P HÂ N T Í C H V À S O S Á N H Đ Ặ C ĐI Ể M D I T R U YỀ N C ỦA ON G M ẬT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002-2006 Sinh viên thực hiện: TRẦN NGỌC VIỆT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ K H A I T H Á C DỮ L I Ệ U E S T (E x p r es s ed Se q ue n ce T a g s ) N H Ằ M P H Á T HI Ệ N M I C R O S AT E L L I T E P H ỤC V Ụ C H O C Ô N G T Á C P HÂ N T Í C H V À S O S Á N H Đ Ặ C ĐI Ể M D I T R U YỀ N C ỦA ON G M ẬT Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ TRẦN NGỌC VIỆT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 2 LỜI CẢM TẠ Cảm ơn công lao nuôi dƣỡng, dạy dỗ của cha mẹ Xin chân thành cảm tạ Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh Học cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Chân thành cảm ơn TS. Bùi Minh Trí đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. Xin cảm ơn CN. Lƣu Phúc Lợi đã giúp đỡ, hỗ trợ tài liệu chuyên môn. Cảm ơn các anh chị tại phòng Sinh Hóa đã tạo điều kiện tốt cho tôi khi tiến hành thực hiện công việc tại Trung Tâm. Xin cảm ơn bạn bè thân yêu của lớp DH02SH đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Tp. Hồ Chí Minh tháng 08 năm 2006 Sinh viên thực hiện Trần Ngọc Việt iii TÓM TẮT TRẦN NGỌC VIỆT, Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “KHAI THÁC DỮ LIỆU EST (Expressed Sequence Tags) NHẰM PHÁT HIỆN MICROSATELLITE PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ONG MẬT” Giảng viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2006 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Phân tích Thí Nghiệm - trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh Ở Việt Nam, nghề nuôi ong mật đã hình thành rất lâu và hiện nay các sản phẩm của ong mật hầu hết là đƣợc xuất khẩu. Hiệu quả kinh tế mang về từ nghề nuôi là khá cao. Tuy nhiên, việc nuôi ong chỉ tập trung chủ yếu ở một số vùng nhất định nhƣ Tây Nguyên (Đak Lak), miền Đông Nam Bộ, chƣa tận dụng đƣợc hết nguồn tài nguyên có sẵn. Sự hạn chế này là do chƣa xác định đƣợc loài ong cho mật nào phù hợp với từng vùng địa lý cụ thể tại Việt Nam. Chính vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu về việc thiết lập nên primer chạy phản ứng PCR dựa vào chỉ thị microsatellite của các loài ong cho mật để làm cơ sở cho những bƣớc nghiên cứu định danh và xác định đặc điểm di truyền của ong mật phục vụ cho việc mở rộng nghề nuôi ong mật ở các vùng ở Việt Nam. Những kết quả đã đạt đƣợc: ۰ Chúng tôi đã chọn đƣợc một nguồn dữ liệu (EST) tốt cho nghiên cứu ۰ Thiết lập đƣợc phƣơng pháp để tìm kiếm microsatellite từ nguồn EST ۰ Thiết kế đƣợc những cặp primer dựa vào vùng bảo tồn hai bên những loại microsatellite tìm đƣợc Kết luận: Sự thành công của việc thiết kế primer đã làm cơ sở cho những bƣớc nghiên cứu xa hơn về đặc điểm di truyền của các loài ong cho mật. Thành công này mở ra một triển vọng cho việc ứng dụng lĩnh vực Bioinformatic hỗ trợ cho nghiên cứu thực nghiệm, làm giảm đáng kể chi phí và đẩy nhanh tốc độ nghiên cứu thực nghiệm tại Trung Tâm. iv MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ……………………………………………………………………………..iii Tóm tắt …………………………………...………….………………………………..iv Mục lục …………………………………………………………………………..…….v Danh sách các chữ viết tắt............................................................................................viii Danh sách các bảng .......................................................................................................ix Danh sách các hình .........................................................................................................x 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề...........................................................................................................1 1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu........................................................................2 1.2.1. Mục đích nghiên cứu .................................................................................2 1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu ...................................................................................2 1.3. Giới hạn .............................................................................................................2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................................3 2.1. Giới thiệu chung về ong mật .............................................................................3 2.1.1. Cấu tạo cơ thể của ong mật........................................................................3 2.1.1.1. Hình thái cơ thể ................................................................................3 2.1.1.2. Các cơ quan bên trong ......................................................................6 2.1.2. Tổ chức của đàn ong ..................................................................................6 2.1.3. Yêu cầu dinh dƣỡng của ong .....................................................................7 2.1.4. Các sản phẩm của ong ...............................................................................7 2.1.4.1. Mật ong .............................................................................................7 2.1.4.2. Phấn hoa .................................................................................................7 2.1.4.3. Sữa ong chúa ..........................................................................................7 2.1.4.4. Sáp ong ..................................................................................................8 2.2. Nguồn gốc EST (Expressed Sequence Tags) ....................................................8 2.2.1. EST là gì? ..................................................................................................8 2.2.2. Phƣơng pháp tạo EST ................................................................................8 v 2.3. Microsatellite là gì? .........................................................................................10 2.3.1. Các dạng microsatellite ...........................................................................10 2.3.2. Cơ chế hình thành microsatellite .............................................................11 2.3.3. Ứng dụng của microsatellite ....................................................................12 2.3.4. Marker phân tử (molecular markers) .......................................................13 2.3.5. Vì sao chọn marker microsatellite? .........................................................14 2.4. Ngôn ngữ lập trình Perl (Practical Extraction and Reporting Language) .............15 2.4.1. Nguồn gốc của Perl ......................................................................................15 2.4.2. Cấu trúc của Perl ..........................................................................................16 2.4.2.1. Dữ liệu vô hƣớng (scala data) ..............................................................16 2.4.2.2. Cấu trúc điều khiển ...............................................................................16 2.4.2.3. Các List, Array và Hash .......................................................................19 2.4.2.4. Dòng chƣơng trình và các thƣờng trình con .........................................19 2.4.2.5. Package và Module ..............................................................................20 2.5. Giới thiệu về mồi (primer) ....................................................................................21 2.5.1. Khái quát về mồi ..........................................................................................21 2.5.2. Đặc điểm của mồi .........................................................................................21 2.5.2.1. Tính chuyên biệt ...................................................................................21 2.5.2.2. Tính ổn định .........................................................................................22 2.5.2.3. Tính tƣơng thích ...................................................................................23 2.6. Tin sinh học ...........................................................................................................24 2.6.1. Khái niệm tin sinh học ..................................................................................24 2.6.2. Các lĩnh vực nghiên cứu chính của tin sinh học ...........................................24 2.6.2.1. Genomics - Hệ gen học ........................................................................24 2.6.2.2. Sinh học tiến hóa ..................................................................................26 2.6.2.3. Phân tích chức năng gen .......................................................................26 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................................29 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu ...................................................29 3.1.1. Thời gian nghiên cứu ...............................................................................29 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu ...............................................................................29 3.2. Vật liệu và công cụ nghiên cứu .......................................................................29 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................29 vi 3.2.2. Công cụ nghiên cứu .................................................................................29 3.3. Phƣơng pháp tiến hành nghiên cứu .................................................................30 3.3.1. Quy trình nghiên cứu tổng quát ...............................................................30 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .........................................................................31 3.3.2.1. Sơ đồ các bƣớc tiến hành nghiên cứu .............................................31 3.3.2.2. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu chi tiết ..........................................32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................42 4.1. Kết quả tìm kiếm và tải trình tự EST về máy tính cá nhân .............................42 4.1.1. Kết quả tìm kiếm EST .............................................................................42 4.1.2. Kết quả tải trình tự EST về máy tính cá nhân .........................................43 4.2. Kết quả tìm và phân loại microsatellite ...........................................................44 4.2.1. Kết quả tìm microsatellite qua xử lý của EST_TRIMMER ....................44 4.2.2 Kết quả xử lý qua MISA ..........................................................................45 4.3. Kết quả thiết kế primer ....................................................................................49 4.3.1. Kết quả thiết kế primer qua 6 Script Perl ................................................49 4.3.2. Kết quả so sánh và chọn lọc primer đƣợc thiết kế ...................................56 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................................59 5.1. Kết luận ...........................................................................................................59 5.1.1. Sơ đồ phƣơng pháp thực hiện ..................................................................59 5.1.2. Kết quả đạt đƣợc .....................................................................................60 5.2. Đề nghị ............................................................................................................60 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................61 7. PHỤ LỤC .................................................................................................................64 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ALP Amplified Length Polymorphism AP-PCR Arbitrary Primer –Polymerase Chain Reaction BLAST Basic Local Alignment Search Tools CEB Computional Evolution Biology DAF DNA Amplification Fringerprinting DDBJ DNA Data Bank of Japan EMBL the European Molecular Biology Laborary EST Expressed Sequence Tags NCBI the National Center for Biotechnology Information MPSS Massively Parllel Signatur Sequencing PCR Polymerase Chain Reaction PDA Primer Design Assitant PERL Practical Extraction and Reporting Language RAPD Radom Aplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single Nucleotide Polymorphism SSCP Single Strand Conformation Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats STS Sequence Tagged Sites viii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Tên gọi một số marker DNA ..................................................................13 Bảng 4.1. Kết quả xử lý qua MISA ........................................................................47 Bảng 4.2. Thành phần của các dạng microsatellite .................................................47 Bảng 4.3. Tỷ lệ phần trăm các dạng microsatellite .................................................48 Bảng 4.4. Phần trăm các loại microsatellite chiếm tỷ lệ cao ..................................48 Bảng 4.5. Kết quả primer của dạng dinucleotide SSR ............................................54 Bảng 4.6. Kết quả primer của dạng trinucleotide SSR ...........................................55 Bảng 4.7. Kết quả primer của dạng tetranucleotide SSR .......................................56 Bảng 4.8. Kết quả primer sau cùng của dạng dinucleotide SSR ............................57 Bảng 4.9. Kết Quả primer sau cùng của dạng tri/tetra-nucleotide SSR ..................57 Bảng 4.10. Trình bày loại SSR và mã số truy cập của EST ...................................58 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái các loài ong cho mật .......................................................................3 Hình 2.2. Thể hiện ba phần chính của ong .....................................................................4 Hình 2.3. Hình thái phần đầu của con ong .....................................................................4 Hình 2.4. Hình thái phần ngực của con ong ...................................................................5 Hình 2.5. Hình thái phần bụng của con ong ...................................................................5 Hình 2.6. Sơ đồ nguồn gốc của EST ..............................................................................9 Hình 2.7. Cách thức tạo nên EST .................................................................................10 Hình 2.8. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân ............................................................11 Hình 2.9. Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã ........................................................12 Hình 3.1. Trình bày qui trình nghiên cứu tổng quát .....................................................30 Hình 3.2. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu chính ..........................................................31 Hình 3.3. Giao diện trên trang NCBI với từ khóa honeybee ........................................32 Hình 3.4. Cú pháp thực thi của EST_TRIMMER ........................................................35 Hình 3.5. Cú pháp thực thi của MISA ..........................................................................36 Hình 3.6. Giao diện của Primer3 ..................................................................................38 Hình 3.7. Giao diện của PrimerQuest ...........................................................................40 Hình 3.8. Giao diện của PDA .......................................................................................40 Hình 3.9. Giao diện của DNAClub ..............................................................................41 Hình 4.1. Kết quả tìm thấy EST trên NCBI .................................................................42 Hình 4.2. Kết quả download với tùy chọn có sẵn của NCBI .......................................43 Hình 4.3. Kết quả thực thi 4 tác vụ của EST_TRIMMER ...........................................45 Hình 4.4. File chứa kết quả trình tự EST đƣợc chọn ....................................................45 Hình 4.5. File định dạng FASTA .................................................................................45 Hình 4.6. Thể hiện kết quả thực thi của MISA ............................................................46 Hình 4.7. Kết quả của file new_ids170404 ..................................................................49 Hình 4.8. Kết quả trình diễn của ssrout170404 ............................................................50 Hình 4.9. Kết quả trình diễn của labdbout170404 ........................................................50 Hình 4.10. Xuất kết quả các thông số thiết lập từ script ..............................................51 Hình 4.11. Trình bày primer đƣợc thiết kế ...................................................................51 x Hình 4.12. Trình diễn của rescreened170404 ...............................................................52 Hình 4.13. Kết quả màn hình xử lý qua 4_ssr_blast ....................................................52 Hình 4.14. Thể hiện EST và primer sau cùng ..............................................................53 Hình 4.15. Trình bày primer đạt đƣợc sau cùng ...........................................................53 Hình 5.1. Qui trình nghiên cứu thiết kế primer ............................................................59 xi 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong thế giới động vật, ong mật là loài thuộc lớp côn trùng. Chúng xuất hiện cách đây 40 triệu năm vào thời kỳ Eocene. Ong mật có ở khắp nơi trên thế giới gồm nhiều loài khác nhau. Mỗi loài có điều kiện môi trƣờng phát triển khác nhau và hiệu quả sản xuất cũng khác nhau. Sản phẩm đƣợc làm ra bởi ong mật nhƣ phấn hoa, mật ong, sáp ong, sữa ong chúa, keo ong, nọc ong là các loại thực phẩm dƣợc liệu độc đáo có giá trị kinh tế cao. Ngoài ra, ong mật còn có tác động hữu ích đến nhiều loài động vật và đặc biệt là tác động rất cần thiết trên thực vật đó là thụ phấn hoa. Sự đa dạng và giá trị di truyền học của ong mật cần phải có phƣơng pháp để định danh chính xác từng loài và dƣới loài (thứ). Điều này rất cần thiết, nó có tác động quyết định đến hiệu quả kinh tế trong nghề nuôi ong nói riêng và ý nghĩa về bảo vệ đa dang sinh học nói chung. Công việc này sẽ phục vụ đắc lực trong việc tuyển chọn đƣợc loài ong phù hợp nhất cho nghề nuôi ong ở từng vùng địa lý riêng (nhƣ nguồn mật hoa, thời tiết…), đảm bảo bảo vệ “thuần khiết” đặc điểm di truyền ban đầu của mỗi loài ong. Hiện nay, marker microsatellite là một chọn lựa tốt trong việc phân tích sự đa dạng di truyền, lập bản đồ di truyền, nhận biết giữa các loài và các cá thể trong một loài. Dựa trên nguồn dữ liệu EST (Expressed Sequence Tags) chúng ta có thể tìm ra đƣơc những vị trí microsatellite có ở trên các EST một cách nhanh chóng nhờ vào lĩnh vực nghiên cứu gọi là tin sinh học (bioinformatics). Việc ứng dụng bioinformatic sẽ làm cho công việc nghiên cứu trở nên dễ dàng và chính xác hơn rất nhiều. Bioinformatic là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ của các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê và khoa học máy tính để giải quyết các vấn đề sinh học. Trên cơ sở đó tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khai thác dữ liệu EST (Expressed Sequence Tags) nhằm phát hiện microsatellite phục vụ cho công tác so sánh và phân tích đặc điểm di truyền của ong mật” 2 Đề tài đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Bùi Minh Trí. Đối tƣợng nghiên cứu là các loài ong cho mật. 1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu 1.2.1. Mục đích nghiên cứu - Xây dựng đƣợc phƣơng pháp nhận diện marker microsatellite từ dữ liệu EST có tìm thấy microsatellite của các loài ong cho mật. - Thiết kế đƣợc primer từ hai vùng bảo tồn của microsatellite cho việc chạy phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) khuếch đại trình tự microsatellite đặc trƣng nhất. - So sánh lựa chọn, thiết kế đƣợc các công cụ tin học phù hợp nhất cho công việc nghiên cứu. 1.2.2. Yêu cầu - Tập hợp đƣợc toàn bộ và nhanh nhất dữ liệu EST hiện có của các loài ong mật để cho xác suất tìm thấy microsatellite là lớn nhất. - Phải có phƣơng pháp nhanh nhất trong việc xác định và phân loại microsatellite có trong các EST. - Xây dựng đƣợc một qui trình trong nghiên cứu về thiết kế mồi (primer) để thực hiện phản ứng PCR khuyếch đại microsatellite đặc trƣng có trong EST. - Mồi đƣợc thiết kế phải đảm bảo nghiêm ngặt về tiêu chuẩn các thông số kỹ thuật và tính đại diện cao, đảm bảo cho việc chạy phản ứng PCR có đƣợc kết quả tốt. 1.3. Giới hạn - Đề tài chỉ thực hiện trên loài ong mật. - Chỉ tiến hành thiết kế mồi và khảo sát toàn bộ qui trình trên lý thuyết mà chƣa đƣợc tiến hành kiểm tra lại bằng thực nghiệm. - Năng lực và thời gian có giới hạn nên việc nghiên cứu sẽ có những hạn chế nhất định. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về ong mật Trong thế giới động vật, ong mật thuộc ngành chân đốt (Athropoda), lớp côn trùng (Insecta), bộ cánh màng (Hymenoptera), họ ong mật (Apisdae), giống ong mật (Apis). Ong mật xuất hiện cách đây khoảng 40 triệu năm đƣợc tìm thấy trong mẫu hóa thạch vào thời kỳ Eocene (Mark L. Winston, 1987). Trên thế giới có 7 loài ong cho mật, ở Việt Nam có 4 loài chính: 1. Apis mellifera: Ong Ý 2. Apis cerena: Ong ruồi 3. Apis dorsata: Ong khoái hay ong gác kèo 4. Apis florae: Ong muỗi Trong đó hai loài Apis mellifera và Apis cerena có giá trị kinh tế cao, đang đƣợc nuôi rộng rãi. Hai loài còn lại chỉ đƣợc khai thác tự nhiên. 2.1.1. Cấu tạo cơ thể của ong mật 2.1.1.1. Hình thái cơ thể Hình 2.1. Hình thái các loài ong cho mật Ong có bộ vỏ bao ngoài đƣợc cấu tạo bởi chất chitin có vai trò nhƣ khung xƣơng ngoài nâng đỡ các cơ quan bên trong và chống lại các nhân tố bất lợi bên ngoài. Cơ thể ong gồm ba phần khớp động với nhau: đầu, ngực và bụng. Trong quá trình phát triển cơ thể ong phải trải qua những lần lột xác. 4 Hình 2.2. Thể hiện 3 phần chính của ong Phần đầu Hình 2.3. Hình thái phần đầu của con ong Đầu con ong có cấu tạo hình hộp, trên đầu có hai mắt kép. Đỉnh đầu có ba mắt đơn phân bố dạng tam giác. Trƣớc đầu có một đôi râu có nhiều đốt (râu ong đực có 12 đốt, râu ong chúa và ong thợ có 11 đốt), râu của ong là cơ quan xúc giác rất nhạy. Miệng và vòi ong có đặc điểm khác với những loài côn trùng khác có chức năng cắn, nghiền, hút. Ong dùng hàm trên cắn vật cứng, nghiền phấn hoa… Vòi hút của ong đặc trƣng cho từng giống, ong dùng vòi hút để hút mật hoa, sirô, nƣớc. Phần ngực Ngực gồm 3 đốt: đốt ngực trƣớc, đốt ngực giữa và đốt ngực sau. Phần ngực mang các cơ quan vận động là cánh và chân ong. Các đốt ngực đƣợc chia ra nửa lƣng và nửa bụng. Ngực gồm 3 đốt: đốt ngực trƣớc, đốt ngực giữa và đốt ngực sau. Phần ngực mang các cơ quan vận động là cánh và chân ong. Các đốt ngực đƣợc chia ra nửa lƣng và nửa bụng. 5 Hình 2.4. Hình thái phần ngực của con ong Nửa lƣng có 2 đôi cánh: đôi cánh trƣớc lớn hơn đôi cánh sau, khi ong bay đôi cánh trƣớc móc lại với đôi cánh sau thông qua hệ thống móc cánh. Nửa bụng của phần ngực có 3 đôi chân gắn vào 3 đốt ngực tƣơng ứng. Phần bụng Hình 2.5. Hình thái phần bụng của con ong Bụng ong có 6 đốt và nối với phần ngực qua đốt chuyển tiếp. Mỗi đốt gồm hai nửa: nửa lƣng và nửa bụng, các đốt bụng nối với nhau bằng màng kitin mỏng và đàn hồi (nhờ màng này ong có thể thay đổi thể tích bụng), hai bên mỗi đốt bụng có lỗ thở. Ở phần bụng của 4 đốt bụng cuối cùng có cơ quan tiết sáp, cuối bụng có ngòi đốt (ong đực không có ngòi đốt, ong chúa trƣởng thành thì ngòi đốt có tác dụng nhƣ một máng đẻ trứng và là một vũ khi đánh nhau với các con ong chúa khác). Giữa đốt bụng thứ 5 và thứ 6 của ong có tuyến Naxonop tiết ra mùi đặc trƣng cho đàn ong (ở ong chúa tuyến này phát triển mạnh và tiết ra mùi đặc trƣng gọi là chất chúa để điều khiển hoạt động bìng thƣờng của đàn ong). 6 2.1.1.2. Các cơ quan bên trong Cơ quan tiêu hóa Ong mật thuộc vào các côn trùng ding dƣỡng chuyên tính, cơ quan tiêu hóa còn là nơi dự trữ tạm thời mật khi thu và chuyển về tổ. Cơ quan hô hấp Gồm hai lỗ thở, hệ thống khí quản phân nhiều nhánh, các túi khí và hệ thống mao quản trao đổi khí với các tế bào, mô trong cơ thể. Cơ quan tuần hoàn Hệ thống tuần hoàn của ong là hệ thống mở, tim gồm 5 ngăn, hai bên sƣờn của mỗi ngăn có các cửa để máu lƣu thông. Cơ quan thần kinh Cơ quan thần kinh của ong mật phát triển cao, bảo đảm mối liên hệ của đàn ong với môi trƣờng xung quanh, điều khiển mọi hoạt động thống nhất trong cơ thể ong. Cơ quan thần kinh của ong chia làm ba phần: thần kinh trung ƣơng, thần kinh ngoại biên, thần kinh thực vật. Cơ quan sinh dục Cơ quan sinh dục của ong chúa gồm hai buồn trứng hình quả lê, mỗi buồn trứng có rất nhiều ống dẫn trứng nằm song song với nhau. Cơ quan sinh dục của ong thợ về cấu tạo giống nhƣ cơ quan sinh dục của ong chúa, nhƣng không đƣợc phát triển hoàn chỉnh, hai buồn trứng ong thợ có dạng dải. Cơ quan sinh dục của ong đực gồm hai đôi dịch hoàn: ống dẫn tinh, tuyến phụ và bộ phận giao phối. 2.1.2. Tổ chức của đàn ong Đàn ong là một tổ chức phức tạp gồm hàng nghìn con liên kết với nhau thành một đơn vị thống nhất bằng quá trình trao đổi chất. Nhờ có sự thống nhất giữa các cá thể, đàn ong có thể giữ đƣợc nhiệt độ tối ƣu trong tổ, thu đƣợc nhiều mật và phấn hoa, bảo vệ tổ chống kẻ thù và phát triển. Mỗi đàn ong có những đặc điểm cá thể riêng: mùi đặc thù, khả năng khai thác mật và tiết sáp, khả năng chia đàn, sức chống bệnh truyền nhiễm… 7 Đàn ong chỉ sống và phát triển khi có đủ các thành phần. Mỗi cá thể trong đàn (ong chúa, ong thợ, ong đực) thực hiện một chức năng nhất định theo hƣớng bảo tồn và kéo dài cuộc sống của cả đàn. Ong chúa: ong chúa làm nhiệm vụ đẻ trứng Ong thợ: ong thợ làm nhiệm vụ nuôi ấu trùng, lấy mật và phấn hoa, xây bánh tổ, điều chỉnh nhiệt độ, làm sạch tổ, bảo vệ tổ, chăm sóc ong chúa… Ong đực: nhiệm vụ của ong đực là giao phối với ong chúa tơ 2.1.3. Yêu cầu dinh dƣỡng của ong Khẩu phần ăn tự nhiên của ong mật trƣởng thành phải có: protein (amino acid), carbonhydrate (đƣờng), lipid (acid béo, sterol), vitamin, chất khoáng (muối), nƣớc. Những nguồn dinh dƣỡng này trong khẩu phần ăn phải đƣợc xác định rõ tỉ lệ về số lƣợng và chất lƣợng để đạt đƣợc mức dinh dƣỡng cao nhất. 2.1.4. Các sản phẩm của ong mật 2.1.4.1. Mật ong Thành phần mật ong có trên 65% dạng đƣờng khử gồm glucose và fructose, còn saccharose ít, chỉ có khoảng 5%. Ngoài ra trong quá trình luyện mật hoa, con ong còn tiết ra một số acid hữu cơ có tác dụng làm cho đƣờng trong mật ong không bị lên men. 2.1.4.2. Phấn hoa Phấn hoa là sản phẩm giàu dinh dƣỡng đƣợc ong thu từ nhị hoa của các loài hoa khác nhau để làm thức ăn cho chúng. Phấn hoa chứa 30 – 35% protein, trong đó 10% là acid amin tự do, các enzyme, vitamin… (phấn hoa chứa 21 acid amin cần thiết cho cơ thể, trong đó có 10 acid amin không thay thế). Dùng phấn hoa có tác dụng tốt cho cơ thể, tăng cƣờng sức khỏe vì phấn hoa có nhiều chất dinh dƣỡng dễ hấp thụ… 2.1.4.3. Sữa ong chúa Sữa ong chúa (tên gọi có nguồn gốc lịch sử) là nguồn dinh dƣỡng cao cấp, là sản phẩm đặc biệt. Nó là nguồn thức ăn duy nhất để nuôi ong chúa và ấu 8 trùng của ong chúa do ong thợ non tiết ra. Sữa ong chúa có thành phần dinh dƣỡng nhƣ sau: protein (18%), lipid (6,46%), các vitamin, chất khô (39,95%), tro (0,83%). Sữa ong chúa kích thích quá trình trao đổi lipid và protein giúp cơ thể khỏe mạnh. Sữa ong chúa giàu hormon, vitamin E có tác dụng kích thích sinh lý, tái tạo tế bào, chống sự già cỗi của các hệ thống tế bào. Sữa ong chúa dùng để chữa các bệnh đƣờng tiêu hóa, gan, thận, nâng cao sức đề kháng với các bệnh truyền nhiễm. 2.1.4.4. Sáp ong Sáp ong là dẫn xuất của acid béo no và không no có phân tử lƣợng lớn, các acid tự do và rƣợu gồm 50 hợp chất, 75% là este, carbonhydrate 12 – 15%, acid béo tự do 13 – 15%. Ngoài ra còn có nọc ong và keo ong là những sản phẩm dƣợc liệu thiên nhiên có giá trị cao do ong mật tạo ra. 2.2. Nguồn gốc EST (Expressed Sequence Tags) 2.2.1. EST là gì? EST là một phần nhỏ của trình tự DNA (thƣờng dài từ 200 – 500 nucleotide) đƣợc tạo ra từ một hoặc cả hai đầu của một gen biểu hiện (từ đầu 5‟ hay 3‟ của cDNA). Gồm có 5‟EST và 3‟EST 5‟ EST đƣợc tạo ra từ một phần đầu 5‟ của cDNA, có khuynh hƣớng bảo tồn giữa các loài và không thay đổi nhiều trong một họ gen. 3‟ EST đƣợc tạo ra từ một phần đầu 3‟ của cDNA, dạng này có thể sẽ rơi vào vùng không mã hoá (non-coding) hay vùng không dịch mã (Untranslated Regions, UTRs). Do đó khuynh hƣớng bảo tồn giữa các loài thấp hơn những trình tự mã hóa. Một Expressed Sequence Tag (EST) có thể sử dụng giúp cho việc xác đinh những gen chƣa biết và lập bản đồ của chúng trong một bộ gen (genome). 9 2.2.2 Phƣơng pháp tạo EST Sơ đồ nguồn gốc của EST Hình 2.6. Sơ đồ nguồn gốc của EST Sử dụng mRNA để tạo cDNA cDNA là gì? cDNA là một dạng của DNA đƣợc tạo ra trong các phòng thí nghiệm, sử dụng một loại enzyme gọi là reverse transcriptase. Tạo cDNA đi ngƣợc với tiến trình bình thƣờng của sự sao mã trong tế bào. Bởi vì, ngƣời sản xuất sử dụng mRNA làm khuôn (template) chứ không phải DNA. Không giống nhƣ DNA của bộ gen, cDNA chỉ chứa exon hay gen biểu hiện. mRNA là một chìa khóa để tìm thấy những gen biểu hiện trong bộ gen. Tuy nhiên, mRNA không bền vững ở bên ngoài tế bào. Do đó, các nhà khoa học đã sử dụng một loại enzyme đặc biệt để biến đổi nó thành dạng DNA (cDNA) bổ sung (complementary DNA). cDNA có cấu tạo bền vững hơn rất nhiều so với mRNA. Vì đƣợc tạo ra từ mRNA, các intron đã đƣợc bị loại bỏ nên cDNA chỉ đại diện cho những trình tự DNA biểu hiện. Từ cDNA đến EST Một cDNA đại diện cho một gen biểu hiện đƣợc phân lập, sau đó các nhà khoa học có thể giải trình tự từ hai đầu của phân tử này thƣờng khoảng 100 đến vài trăm nucleotide (khoảng 500 nucleotide) để tạo ra hai loại EST. Đó có thể là 5‟EST và 3‟EST.