Tài liệu Hoàn thiện và phát triển các bộ kit sinh học phân tử chẩn đoán các bệnh do hbv (hepatitis b virus), hcv (hepatitis c virus), hpv (human papillomavirus)

SÔÛ KHOA HOÏC VAØ COÂNG NGHEÄ TP HOÀ CHÍ MINH BAÙO CAÙO TOÅNG KEÁT (ñaõ chænh söûa) DÖÏ AÙN SAÛN XUAÁT THÖÛ NGHIEÄM HOAØN THIEÄN VAØ PHAÙT TRIEÅN CAÙC BOÄ KIT SINH HOÏC PHAÂN TÖÛ CHAÅN ÑOAÙN CAÙC BEÄNH DO HBV (HEPATITIS B VIRUS), HCV (HEPATITIS C VIRUS), HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS) Chuû nhieäm döï aùn : PGS TS Hoà Huyønh Thuøy Döông Cô quan chuû trì : Coâng ty TNHH CNSH KHOA THÖÔNG Naêm 2008 1 MUÏC LUÏC TOÅNG QUAN Trang 1 PHÖÔNG PHAÙP TIEÁN HAØNH 8 NOÄI DUNG – KEÁT QUAÛ 1. Hoøan thieän caùc quy trình 1.1. Kit HBV ñònh tính 1.2. Kit HCV ñònh tính 1.3. Kit HPV ñònh tính 1.4. Kit HBV ñònh löôïng 1.5. Kit HCV ñònh löôïng 1.6. Kit HPV phaân nhoùm 2. Trieån khai saûn xuaát thöû nghieäm 11 11 11 14 17 19 29 39 44 KEÁT LUAÄN 46 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 47 PHUÏ LUÏC Phuï luïc 1. Kit HBV ñònh tính Phuï luïc 2. Kit HCV ñònh tính Phuï luïc 3. Kit HPV ñònh tính Phuï luïc 4. Kit HBV ñònh löôïng Phuï luïc 5. Kit HCV ñònh löôïng Phuï luïc 6. Kit HPV phaân group Phuï luïc 7. Moâ taû saûn phaåm – Thaønh phaàn caùc kit vaø Höôùng daãn söû duïng Phuï luïc 8. Quy trình saûn xuaát vaø kieåm tra chaát löôïng Phuï luïc 9. Phaân tích hieäu quaû kinh teá 2 48 51 54 57 62 67 82 120 129 TOÅNG QUAN Theo Toå chöùc Y Teá Theá giôùi (WHO), beänh truyeàn nhieãm noùi chung vaø beänh nhieãm khuaån noùi rieâng ñang coù khuynh höôùng gia taêng vaø laø moái ñe doïa chung treân phaïm vi toaøn caàu. Moät soá beänh nhö vieâm maøng naõo, dòch taû, soát vaøng, … sau nhieàu naêm suy giaûm ñaõ gia taêng trôû laïi taïi nhieàu quoác gia. Nhieàu loaïi beänh môùi naûy sinh vôùi toác ñoä nhanh chöa töøng coù. Beänh Suy ñöôøng hoâ haáp caáp (SARS) buøng noå taïi nhieàu quoác gia chaâu AÙ vöøa qua laø moät ví du.ï Tröôùc tình hình ñoù, nhu caàu veà nhöõng bieän phaùp hieäu quaû ñeå phoøng ngöøa, chaån ñoaùn vaø ñieàu trò beänh nhieãm trôû neân caáp thieát hôn bao giôø heát. 1. MOÄT SOÁ VAÁN ÑEÀ VEÀ CAÙC BEÄNH NHIEÃM : VIEÂM GAN SIEÂU VI B VAØ C, NHIEÃM HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS 1.1. Vieâm gan sieâu vi B vaø C Vieâm gan sieâu vi laø caùc beänh nhieãm truøng do nhieàu loaïi sieâu vi coù aùi tính vôùi teá baøo gan gaây ra, daãn ñeán vieâm vaø hoaïi töû teá baøo gan. Caùc beänh naøy tuy coù trieäu chöùng töông töï nhau nhöng laïi raát khaùc nhau veà nguyeân nhaân, dòch teã, lòch söû töï nhieân vaø tieân löôïng. Trong soá caùc sieâu vi gaây vieâm gan tìm thaáy ñöôïc cho ñeán nay bao goàm sieâu vi vieâm gan A, B, C, D vaø E, sieâu vi B (HBV) vaø C (HCV) coù yù nghóa quan troïng do söï phaân boá ñòa dö roäng, tyû leä nhieãm cao ôû moät soá vuøng treân theá giôùi vaø coù nguy cô cao daãn ñeán tình traïng nhieãm maïn tính vaø ung thö. Caùc chaån ñoaùn vieâm gan sieâu vi hieän nay chuû yeáu döïa vaøo bieåu hieän laâm saøng, sinh thieát gan, xeùt nghieäm sinh hoaù vaø phaûn öùng huyeát thanh. Caùc bieän phaùp naøy trong nhieàu tröôøng hôïp khoâng cho pheùp xaùc ñònh chính xaùc taùc nhaân gaây beänh vaø nhaát laø khoâng cho bieát veà traïng thaùi toàn taïi cuûa caùc taùc nhaân naøy ôû beänh nhaân. Vieâm gan sieâu vi B Beänh vieâm gan sieâu vi do HBV coù thôøi gian uû beänh bieán ñoäng trong khoaûng 60-110 ngaøy. Tæ leä nhieãm HBV maõn tính ôû Baéc Myõ thaáp hôn 2% soá ngöôøi bò nhieãm. Tæ leä naøy cao hôn nhieàu ôû chaâu AÙ, Phi, caùc ñaûo Thaùi Bình Döông vaø ôû ngöôøi Eskimo. Ñaây laø moät vaán naïn y teá lôùn - ngöôøi ta öôùc chöøng coù khoaûng 300 trieäu ngöôøi mang maàm beänh maõn tính treân theá giôùi, vaø khoaûng 3,5 tyû ngöôøi soáng trong nhöõng vuøng beänh löu haønh ôû möùc ñoä trung bình hoaëc cao. Treân 122 trieäu em beù ra ñôøi moãi naêm ôû nhöõng vuøng naøy vaø coù nguy cô raát cao trôû thaønh nhöõng ngöôøi mang maàm beänh ; khoaûng 25%-30% nhöõng ngöôøi mang maàm beänh bò nhieãm trong thôøi nieân thieáu seõ cheát do caùc beänh gan maõn tính hay ung thö gan. Khoaûng 1 tyû ñeán 1 tyû röôõi ngöôøi nhieãm HBV cheát moãi naêm. HBV gaây ra ñeán 80% caùc tröôøng hôïp ung thö gan, laø taùc nhaân gaây ung thö chæ ñöùng thöù hai sau thuoác laù (WHO, 2000). 3 HBV thuoäc hoï Hepadnaviridae, coù vaät lieäu di truyeàn laø moät maïch ñoâi DNA khoâng hoaøn toaøn coù kích thöôùc khoaûng 3,2 kb ñöôïc bao bôûi nucleocapsid coù chöùa khaùng nguyeân loõi HBcAg, beân ngoaøi laø khaùng nguyeân beà maët HBsAg. Virus hoaøn chænh laø moät tieåu theå hình caàu coù ñöôøng kính 42-47 nm, ñöôïc goïi laø haït töû Dane. Do trieäu chöùng laâm saøng cuûa tình traïng nhieãm HBV khoâng phaân bieät ñöôïc vôùi caùc daïng vieâm gan sieâu vi khaùc neân vieäc phaùt hieän beänh chuû yeáu döïa treân caùc chaån ñoaùn huyeát thanh hoïc. Tình traïng nhieãm HBV caáp tính ñöôïc ñaëc tröng bôûi söï hieän dieän cuûa HBsAg vaø IgM anti-HBc trong huyeát thanh. Caùc phöông phaùp huyeát thanh hoïc cho pheùp phaùt hieän caùc thaønh phaàn vöøa neâu bao goàm phöông phaùp khueách taùn mieãn dòch, thöû nghieäm keát dính hoàng caàu vaø nhöõng thöû nghieäm coù ñoä nhaïy cao hôn nhö mieãn dòch enzyme (EIA) vaø mieãn dòch phoùng xaï (RIA) coù theå phaùt hieän ñeán 0,1 ng/ml HBsAg. Gaàn ñaây ngöôøi ta phaùt trieån caùc chaån ñoaùn phaân töû coù ñoä nhaïy cao hôn nhö lai phaân töû (slot hoaëc dot blot) coù theå phaùt hieän DNA HBV ñeán haøm löôïng 5pg/ml (töông öùng 1,5 x 106 baûn sao/ml). Moät thöû nghieäm lai trong pha loûng ñaõ thöông maïi hoaù (Abbott) phaùt hieän ñöôïc 1,5 pg/ml DNA HBV coøn thöû nghieäm bDNA (Chiron) phaùt hieän 2,5 pg/ml DNA HBV. PCR coù ñoä nhaïy coøn cao hôn nhieàu, coù theå phaùt hieän ñöôïc 10-3 pg/ml (töông öùng khoaûng 100-1000 boä gene) [1] Vieâm gan sieâu vi C Sieâu vi vieâm gan C (HCV), ñöôïc xeáp vaøo hoï Flaviviridae, coù vaät lieäu di truyeàn laø moät RNA maïch ñôn (+), kích thöôùc khoaûng 9,5 kb. Virus naøy khoâng theå nuoâi caáy ñöôïc vaø ñöôïc xem laø nguyeân nhaân cuûa phaàn lôùn caùc tröôøng hôïp vieâm gan "khoâng A khoâng B". Maëc duø HCV khoâng gaén cheøn vaøo boä gene kyù chuû nhöng laïi coù khaû naêng toàn taïi ñaëc bieät dai daúng ôû ngöôøi bò nhieãm. Söï nhieãm HCV daãn ñeán tình traïng beänh maõn tính trong 50-70% tröôøng hôïp. Nhieãm caáp tính HCV thöôøng ít coù hoaëc coù trieäu chöùng nheï, khoù nhaän bieát. Chæ khoaûng 10% ngöôøi nhieãm thaûi loaïi hoaøn toaøn virus, soá coøn laïi chuyeån sang tình traïng maõn tính. Trong soá sau naøy, ít nhaát 60% phaùt trieån vieâm gan maïn. Khoaûng 20% beänh nhaân vieâm gan maïn seõ bò xô gan vaø moät soá cheát do maát chöùc naêng gan hoaëc do ung thö gan. Rieâng ôû thaønh phoá Hoà Chí Minh, ung thö gan nguyeân phaùt chieám vò trí thöù ba trong caùc daïng ung thö vaø vò trí thöù nhaát ôû beänh nhaân nam. Moät coâng trình nghieân cöùu dòch teã hoïc söï nhieãm HCV cho thaáy tæ leä löu haønh HCV ôû ngöôøi bình thöôøng laø 1,8%, vaø cao hôn nhieàu ôû caùc nhoùm ngöôøi coù nguy cô, töø 50% ôû ngöôøi nhaän truyeàn maùu cho ñeán 96,2% ôû ngöôøi nghieän [2]. Vieäc phaùt hieän HCV trong maùu ngöôøi bò nhieãm vöøa coù yù nghóa cho chaån ñoaùn vaø theo doõi ñieàu trò, vöøa coù taàm quan troïng ñaëc bieät trong vieäc saøng loïc ñeå ñaûm baûo an toaøn truyeàn maùu vaø caùc saûn phaåm töø maùu. Bieän phaùp chaån ñoaùn HCV ñaàu tieân laø ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) söû duïng khaùng nguyeân c100 taïo doøng töø boä gene HCV (Chiron/Ortho Diagnostic Systems). Moät loaït caùc chaån ñoaùn söû duïng theâm nhieàu khaùng nguyeân taùi toå hôïp khaùc cuûa HCV ra ñôøi sau ñoù, vôùi ñoä nhaïy vaø ñoä ñaëc hieäu ngaøy caøng cao nhö ELISA theá heä thöù hai, RIBA (Recombinant Immunoblot 4 Assay) theá heä thöù nhaát, thöù hai, thöù ba. Tuy nhieân caùc phöông phaùp xeùt nghieäm mieãn dòch naøy coù moät soá nhöôïc ñieåm nhö khoâng phaùt hieän ñöôïc söï nhieãm ôû giai ñoaïn sôùm hoaëc khoâng cho keát quaû ôû ngöôøi maø heä thoáng mieãn dòch khoâng hoaït ñoäng (immunosuppressed). Caùc boä kit döïa treân kyõ thuaät PCR ñöôïc phaùt trieån cho pheùp phaùt hieän tröïc tieáp HCV ngay trong thôøi kyø viremia vôùi ñoä nhaïy cao, ñeán khoaûng 2.000 baûn sao/ml huyeát thanh. Theá maïnh cuûa kyõ thuaät naøy ñöôïc keå laø : chaån ñoaùn sôùm vaø chính xaùc ôû ngöôøi coù nguy cô cao, phaùt hieän HCV ôû ngöôøi mang khoâng trieäu chöùng, ôû ngöôøi coù haøm löôïng ALT cao, ôû ngöôøi coù heä thoáng mieãn dòch khoâng hoaït ñoäng, khaúng ñònh keát quaû ELISA döông tính vaø theo doõi ñieàu trò. Amplicor HCV (Roche Diagnostic Systems) laø moät boä kit döïa treân kyõ thuaät PCR ñaõ ñöôïc thöông maïi hoùa. ÔÛ Vieät Nam, ñaõ coù moät soá coâng trình nghieân cöùu söû duïng caùc bieän phaùp vöøa keå. Kyõ thuaät bDNA ñònh löôïng HBV cuõng ñaõ ñöôïc aùp duïng taïi Trung Taâm Chaån Ñoaùn Y Khoa Hoøa Haûo Tp HCM. 1.2. Human papillomavirus (HPV) Ung thö coå töû cung laø moät trong nhöõng beänh thuoäc haøng ñaàu vaø laø nguyeân nhaân lôùn thöù hai gaây neân caùi cheát cho phuï nöõ treân toaøn theá giôùi. Haøng naêm coù 440.000 ca beänh môùi chieám tæ leä 5,8% trong caùc beänh ung thö [3]. ÔÛ Vieät Nam, ung thö coå töû cung cuõng laø beänh haøng ñaàu ôû phuï nöõ mieàn Nam vaø thöù tö ôû phuï nöõ mieàn Baéc. Theo thoáng keâ veà ghi nhaän ung thö quaàn theå ôû thaønh phoá Hoà Chí Minh (1998) thì thaønh phoá coù theâm 28,6 ngöôøi treân 100.000 phuï nöõ maéc beänh naøy moãi naêm. Khoaûng töø 90-99,7% tröôøng hôïp beänh ung thö coå töû cung ñöôïc phaùt hieän coù daáu hieäu cuûa söï nhieãm moät hay nhieàu loaïi HPV (human papillomavirus) gaây ung thö. Human Papillomavirus (HPV) laø moät trong nhöõng virus laây truyeàn qua ñöôøng tình duïc phoå bieán, gaây ra nhieàu loaïi beänh khaùc nhau ôû ngöôøi nhö muïn coùc, u nang bieåu moâ… vaø lieân quan ñeán nhieàu loaïi ung thö trong ñoù ñaùng chuù yù nhaát laø ung thö coå töû cung ôû phuï nöõ. Ñaây laø virus nhoû coù ñöôøng kính khoaûng 55nm vôùi boä gene DNA voøng maïch keùp goàm töø 7.200-8.000 caëp base vôùi khoaûng 10 khung ñoïc môû. Hieän nay hôn 77 kieåu gene (genotype) khaùc nhau cuûa virus naøy ñaõ ñöôïc xaùc ñònh ôû ngöôøi ñaõ ñöôïc giaûi trình töï. Ngöôøi ta chia HPV sinh duïc - nhoùm caùc HPV xaâm nhieãm chuû yeáu beà maët nieâm maïc, thöôøng thaáy ôû ñöôøng sinh duïc - thaønh hai loaïi döïa treân khaû naêng gaây ung thö. Ñoù laø nhoùm "nguy cô thaáp" (low risk), ít coù khaû naêng gaây ung thö vaø nhoùm "nguy cô cao" (high risk), coù khaû naêng gaây ung thö cao. Gene HPVE6 vaø HPVE7 cuûa virus coù khaû naêng gaén xen vaøo boä gene, phieân maõ taïo ra oncoprotein E6 vaø E7. Caùc protein E6 vaø E7 cuûa caùc HPV "nguy cô cao" coù khaû naêng gaén keát cao vôùi caùc protein p53 (coù chöùc naêng tieâu dieät teá baøo toån thöông trong giai ñoaïn G1 cuûa quaù trình phaân baøo) vaø pRB (coù chöùc naêng ñieàu hoaø quaù trình phaân baøo). Phöùc hôïp E6/p53 laøm maát hoaït tính cuûa p53 khieán cho teá baøo khoâng bò tieâu dieät khi bò toån thöông vaø daãn ñeán tình traïng khoâng oån ñònh di truyeàn cuûa teá baøo. Söï gaén keát cuûa E7 vaø pRB giaûi phoùng taùc nhaân phieân 5 maõ laø E2F laøm taêng söï phieân maõ, hoaït hoaù quaù trình phaân baøo. Gene E6 vaø E7 ñöôïc tìm thaáy trong caùc teá baøo ung thö HPV döông tính [3]. Phöông phaùp chaån ñoaùn teá baøo hoïc do Papanicolaou phaùt minh naêm 1949, thöôøng ñöôïc goïi laø PAP test (Pap smear), ñaõ laøm giaûm ñaùng keå soá töû vong do ung thö coå töû cung vaø ñaõ trôû neân bieän phaùp phaùt hieän sôùm ung thö coå töû cung raát thoâng duïng. Tuy nhieân, bieän phaùp naøy khoâng chính xaùc, deã cho keát quaû aâm tính vaø döông tính giaû, vaø caàn ñöôïc keát hôïp vôùi moät soá kieåm tra khaùc. Moät soá kyõ thuaät phaân töû nhö PCR, lai taïi choã (in situ hybridization) ñöôïc phaùt trieån gaàn ñaây ñeå phaùt hieän söï hieän dieän cuûa DNA HPV trong teá baøo coå töû cung. Caùc kyõ thuaät phaân töû naøy coøn cho pheùp xaùc ñònh ñöôïc caùc type vaø phaân bieät caùc thöông toån coå töû cung khoâng lieân quan ñeán HPV. Phöông phaùp lai trong pha loûng ñaõ ñöôïc phaùt trieån thaønh caùc boä kit (Hybrid Capture Tube (HCT), Hybrid Capture II) (Digene Corporation) vaø ñöôïc pheùp söû duïng trong chaån ñoaùn giuùp xaùc ñònh nhoùm HPV "nguy cô cao" vaø "nguy cô thaáp". Ñaëc bieät kyõ thuaät PCR, vôùi ñoä nhaïy vaø ñoä ñaëc hieäu cao, ñöôïc phaùt trieån vôùi hai heä thoáng primer thoâng duïng laø heä MY09MY11 [4] vaø heä GP5+-GP6+ [5]. Caùc heä primer naøy ñöôïc thieát keá döïa treân trình töï gene L1, cho pheùp phaùt hieän söï hieän dieän cuûa nhieàu type HPV trong beänh phaåm. 1. MOÄT SOÁ VAÁN ÑEÀ VEÀ CHAÅN ÑOAÙN BEÄNH NHIEÃM Cho ñeán nay, caùc phöông phaùp chaån ñoaùn beänh nhieãm chuû yeáu döïa treân bieåu hieän laâm saøng, keát quaû soi, caáy vi truøng vaø caùc xeùt nghieäm sinh hoaù, mieãn dòch coå ñieån. Tuy vaãn ñöôïc söû duïng phoå bieán, caùc bieän phaùp neâu treân ñeàu coù nhöõng nhöôïc ñieåm rieâng. Chaån ñoaùn döïa treân bieåu hieän laâm saøng chæ tieán haønh ñöôïc khi ñaõ xuaát hieän trieäu chöùng, khoâng ñaëc hieäu cho beänh, khoù cho pheùp phaân bieät moät soá beänh nhieãm truøng ôû giai ñoaïn sôùm. Kyõ thuaät nuoâi caáy vaø ñònh danh coù ñoä nhaïy thaáp, ñoøi hoûi moät löôïng vi sinh vaät cao trong beänh phaåm ; khoù tieán haønh ôû moät soá vi sinh vaät nuoâi caáy khoâng ñöôïc hay phaùt trieån raát chaäm vaø khoù khaên do ñaëc tính töï nhieân ; vaø ñaëc bieät khoâng coù hieäu quaû khi beänh nhaân ñaõ söû duïng khaùng sinh tröôùc ñoù. Caùc phöông phaùp sinh hoùa vaø mieãn dòch laø nhöõng phöông phaùp phaùt hieän giaùn tieáp thoâng qua ñaùp öùng cuûa beänh nhaân neân thöôøng khoù cho keát quaû chính xaùc ôû giai ñoaïn sôùm cuûa beänh. Caùc phöông phaùp naøy khoâng coù ñoä ñaëc hieäu cao (tröø phi söû duïng khaùng theå ñôn doøng trong xeùt nghieäm mieãn dòch, voán ñaét tieàn vaø khoù saûn xuaát). Toùm laïi, caùc bieän phaùp vöøa keå, duø söû duïng rieâng leû hay keát hôïp, thöôøng ít cho keát quaû nhö yù do ñoä ñaëc hieäu vaø ñoä nhaïy khoâng cao, hoaëc do thôøi gian chôø ñôïi keát quaû raát daøi ; do ñoù coù yù nghóa haïn cheá cho phuïc vuï ñieàu trò. Caùc phöông phaùp sinh hoïc phaân töû ngaøy caøng ñöôïc phaùt trieån ñeå söû duïng nhö nhöõng coâng cuï chaån ñoaùn, ñieàu trò, nghieân cöùu dòch teã hoïc vaø kieåm tra dòch beänh trong lónh vöïc beänh nhieãm. Caùc öu ñieåm chính cuûa chaån ñoaùn phaân töû laø : 6 (1) ñoä ñaëc hieäu gaàn nhö tuyeät ñoái vì phaùt hieän tröïc tieáp vaät lieäu di truyeàn cuûa vi sinh vaät gaây beänh, (2) ñoä nhaïy raát cao, nhaát laø ñoái vôùi kyõ thuaät PCR, cho pheùp phaùt hieän moät löôïng vi sinh vaät raát nhoû, (3) thôøi gian cho keát quaû nhanh, (4) coù theå ñöôïc töï ñoäng hoùa vaø "kit" hoaù. Tuy nhieân, chaån ñoaùn phaân töû cuõng bao haøm moät soá nhöôïc ñieåm : giaù xeùt nghieäm cao, thieát bò ñaét tieàn, quy trình chaån ñoaùn khoâng phaûi luùc naøo cuõng ñöôïc chuaån hoùa, kyõ thuaät vieân phaûi ñöôïc ñaøo taïo kyõ. Maëc duø vaäy, treân theá giôùi ngaøy caøng phaùt trieån xu höôùng söû duïng moät caùch choïn loïc vaø coù kieåm soaùt caùc kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû ñeå boå sung, hoã trôï cho caùc chaån ñoaùn coå ñieån. Caùc boä kit thöông maïi hoùa duøng ñeå phaùt hieän caùc taùc nhaân gaây beänh ñöôïc öa chuoäng vì chuùng deã söû duïng, traùnh ñöôïc ngoïai nhieãm do khaâu chuaån bò, söû duïng caùc hoùa chaát, sinh phaåm vaø ñieàu kieän kieåm tra ñaõ ñöôïc chuaån hoùa. Tuy vaäy, nhieàu taùc giaû khuyeán caùo neân phaùt trieån nhöõng phöông phaùp "töï cheá" ñeå ñaùp öùng vôùi caùc nhu caàu thöïc teá naûy sinh vaø ñeå phuø hôïp vôùi tuùi tieàn cuûa ngöôøi beänh ôû caùc nöôùc ñang phaùt trieån. Caùc chaån ñoaùn phaân töû chuû yeáu döïa treân kyõ thuaät lai phaân töû vaø PCR (Polymerase Chain Reaction - Phaûn öùng toång hôïp daây chuyeàn). Caùc test kits söû duïng maãu doø (lai phaân töû) ñeå phaùt hieän taùc nhaân gaây beänh ñöôïc thöông maïi hoùa sôùm vaø hieän vaãn ñang ñöôïc söû duïng roäng raõi, ñieån hình nhö heä thoáng PACE2 (Gen-Probe) nhaèm phaùt hieän ñoàng thôøi Neisseria gonorrhoeae vaø Chlamydia trachomatis hay heä thoáng Hybrid capture (Digene, Murex) ñeå phaùt hieän HPV (Human Papillomavirus), HSV (Herpes Simplex Virus), CMV (Cytomegalovirus). Caùc phöông phaùp vöøa keå raát nhanh vaø ñôn giaûn nhöng coù ñoä nhaïy keùm, chæ thaät söï coù hieäu quaû khi soá löôïng baûn sao boä gene cuûa taùc nhaân gaây beänh trong beänh phaåm ñaït 104 baûn sao/ml. Caùc phöông phaùp söû duïng maãu doø coù keát hôïp khueách ñaïi tín hieäu nhö bDNA (branched DNA probe) (Chiron) hay QB replicase (Gene-Trak) ñöôïc phaùt trieån ñeå caûi tieán ñoä nhaïy cuûa phaûn öùng ñeán khoaûng 500 baûn sao boä gene/ml. Tuy nhieân, caùc kyõ thuaät nhaân baûn trình töï ñích, thoâng duïng nhaát laø kyõ thuaät PCR, ngaøy caøng chieám öu theá do ñoä nhaïy khoâng gì saùnh ñöôïc. Beân caïnh ngaøy caøng nhieàu boä kit PCR ñöôïc caùc haõng lôùn thöông maïi hoùa laø voâ soá caùc boä kit vaø phöông phaùp ñöôïc phaùt trieån ngay taïi caùc phoøng thí nghieäm laâm saøng ñeå phuïc vuï nhu caàu taïi choã. Trong caùc boä kit naøy, kyõ thuaät PCR keát hôïp vôùi ñieän di, lai phaân töû, söû duïng enzyme caét giôùi haïn, … cho pheùp phaùt hieän caùc taùc nhaân gaây beänh vôùi haøm löôïng raát thaáp, thôøi gian xeùt nghieäm nhanh vaø hoaøn toaøn ñaëc hieäu. Moät vaøi boä kit PCR ñieån hình ñaõ ñöôïc FDA (Food and Drug Administration) coâng nhaän ñeå ñöa vaøo söû duïng nhö : caùc boä kit phaùt hieän Chamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, ñònh löôïng HIV (Roche Diagnostic System). YÙ nghóa kinh teá xaõ hoäi cuûa vieäc söû duïng caùc phöông phaùp chaån ñoaùn phaân töû cuõng ñöôïc thaûo luaän nhieàu. Beân caïnh vieäc caûi thieän khaû naêng chaån ñoaùn, ñieàu trò vaø phoøng ngöøa cho ngöôøi beänh, lôïi ích kinh teá cuûa ñieàu naøy theå hieän ôû vieäc 7 giaûm thieåu caùc xeùt nghieäm ít ñaëc hieäu vaø ít nhaïy hôn, giaûm thieåu caùc quy trình chaån ñoaùn vaø ñieàu trò khoâng caàn thieát cuõng nhö giuùp loaïi boû tình traïng nhieãm truøng beänh vieän. Beân caïnh ñoù, caùc chöông trình y teá nhaèm saøng loïc vaø kieåm soaùt taùc nhaân gaây beänh nhö HPV, Chlamydia, caùc taùc nhaân gaây beänh hieän dieän trong maùu, … ôû möùc ñoä phaân töû ñoái vôùi caù nhaân hoaëc taäp theå nhöõng ngöôøi coù nguy cô cao cuõng cuõng coù yù nghóa kinh teá xaõ hoäi quan troïng. Chi phí boû ra ñeå ñoåi laáy lôïi ích cuûa chaån ñoaùn vaø ñieàu trò sôùm ôû caù nhaân, kieåm soaùt söï laây lan trong quaàn theå vaø caùc vaán ñeà khaùc cuûa y teá coäng ñoàng laø coù theå chaáp nhaän ñöôïc. ÔÛ nöôùc ngoaøi, chuû yeáu döïa treân caùc kyõ thuaät lai phaân töû vaø PCR, nhieàu boä thöû nghieäm (kit) chaån ñoaùn phaân töû ñaõ ñöôïc thöông maïi hoùa vaø söû duïng cho chaån ñoaùn thöôøng quy. Caùc boä kit naøy haàu nhö ñöôïc cung caáp cho kyõ thuaät vieân xeùt nghieäm döôùi daïng “saün saøng cho söû duïng” giuùp giaûm thieåu caùc khaâu chuaån bò coù theå daãn ñeán ngoaïi nhieãm; ngoaøi ra, caùc hoùa chaát, sinh phaåm vaø quy trình ñaõ ñöôïc kieåm tra vaø chuaån hoùa ñaûm baûo tính oån ñònh vaø ñoä tin caäy cuûa xeùt nghieäm. ÔÛ nöôùc ta vaø ôû Thaønh phoá Hoà Chí Minh noùi rieâng, ñaõ coù moät soá nghieân cöùu phaùt trieån vaø thöông maïi hoùa caùc boä kit duøng trong chaån ñoaùn phaân töû moät soá beänh truyeàn nhieãm do caùc sieâu vi gaây vieâm gan (HBV, HCV), Mycobacterium tuberculosis, … , nhö Coâng ty Nam Khoa. Soá löôïng vaø chaát löôïng caùc boä kit phaùt trieån trong nöôùc cho ñeán nay chöa ñaùp öùng heát nhu caàu thöïc teá. Hieän nay moät soá beänh vieän vaø trung taâm y teá lôùn cuõng ñaõ baét ñaàu thöû nghieäm caùc boä kit naøy cuõng nhö moät soá boä kit nhaäp nhö Trung taâm Chaån ñoaùn Y khoa Hoaø Haûo, caùc phoøng xeùt nghieäm cuûa Beänh vieän Ñaïi hoïc Y Döôïc, Beänh vieän Phaïm Ngoïc Thaïch, Beänh vieän Chôï Raãy, Beänh vieän Hoaøn Myõ, … Vaán ñeà ñaët ra hieän nay ñoái vôùi caùc boä kit nhaäp laø chi phí cho moät xeùt nghieäm raát lôùn, ví duï nhö moät xeùt nghieäm phaùt hieän HCV söû duïng heä thoáng Amplicor (Roche) coù giaù laø 1,5 trieäu ñoàng cho moät maãu thöû. Coøn ñoái vôùi caùc kit phaùt trieån trong nöôùc vaán ñeà lôùn laø möùc ñoä chuaån hoùa thaáp, daãn ñeán söï khoâng thoáng nhaát lôùn giöõa caùc cô sôû xeùt nghieäm, keát quaû khoâng coù ñoä tin caäy cao. Vaán ñeà veà nhaân vieân kyõ thuaät ñöôïc ñaøo taïo baøi baûn cuõng phaûi ñöôïc giaûi quyeát ñeå ñaûm baûo ñoä chính xaùc cuûa phaûn öùng. Phoøng thí nghieäm Sinh hoïc Phaân töû – boä moân Di Truyeàn – tröôøng ÑH Khoa Hoïc Töï Nhieân – ÑHQG Tp HCM ñaõ tieán haønh nghieân cöùu vaø nghieäm thu caùc ñeà taøi coù lieân quan ñeán döï aùn bao goàm : 1. Nghieân cöùu öùng duïng kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû trong vieäc chaån ñoaùn moät soá beänh nhieät ñôùi (Soát xuaát huyeát Dengue, Vieâm gan sieâu vi B vaø C, Vieâm naõo Nhaät baûn, nhieãm HPV (Human Papillomavirus) – ñeà taøi NCKH troïng ñieåm ÑHQG Tp HCM, nghieäm thu 2004. 2. Xaây döïng quy trình phaùt hieän HPV (Human papillomavirus) phuïc vuï nghieân cöùu vaø chaån ñoaùn – ñeà taøi Vöôøn öôm saùng taïo KHKT treû – Sôû KH & CN Tp HCM, nghieäm thu 2004. 3. Xaây döïng quy trình ñònh löôïng virus vieâm gan B trong maùu beänh nhaân baèng kyõ thuaät real-time PCR – ñeà taøi NCKH troïng ñieåm ÑHQG, nghieäm thu 2005 8 4. Xaây döïng quy trình ñònh löôïng virus vieâm gan C baèng kyõ thuaät real-time RTPCR phuïc vuï cho vieäc nghieân cöùu vaø ñieàu trò beänh vieâm gan sieâu vi C – ñeà taøi Sôû KH & CN Tp HCM, nghieäm thu 2005. Töø caùc keát quaû nghieäm thu treân, chuùng toâi tieáp tuïc hoaøn thieän caùc kit HBV vaø HCV ñònh tính, HBV vaø HCV ñònh löôïng vaø ñöa thöû nghieäm taïi caùc cô sôû y teá coù quan heä hôïp taùc vaø nhu caàu söû duïng thoâng qua vieäc chuyeån giao coâng ngheä cho Coâng ty TNHH CNSH Khoa Thöông. MUÏC TIEÂU ÑEÀ TAØI Tieán haønh trieån khai caùc quy trình vaø caùc boä kit duøng cho chaån ñoaùn phaân töû ñoái vôùi caùc taùc nhaân virus bao goàm HCV, HBV, HPV töø caùc keát quaû nghieân cöùu cô baûn ñaït ñöôïc vaø töø caùc thaønh töïu ñaõ coâng boá treân theá giôùi 9 PHÖÔNG PHAÙP TIEÁN HAØNH 1. HOAØN THIEÄN CAÙC QUY TRÌNH D Beänh phaåm Caùc maãu huyeát thanh nghi nhieãm HCV, HBV do Beänh vieän ÑH Y Döôïc, DIAG Center vaø Trung taâm Chaån Ñoaùn Y Khoa Hoøa Haûo (Medic) cung caáp trong thôøi gian töø thaùng 9/2005 ñeán thaùng 4/2006. Caùc maãu dòch pheát coå töû cung do Beänh vieän Huøng Vöông Tp HCM cung caáp trong thôøi gian töø thaùng 9/2005 ñeán thaùng 4/2006. D Caùc ñôn vò tham gia : - Phoøng Xeùt nghieäm – Beänh vieän ÑH Y Döôïc Tp HCM (BV ÑH Y Döôïc) - Phoøng PCR – DIAG Center (DIAG Center) - Phoøng PCR – BV Huøng Vöông Tp HCM (BV Huøng Vöông) - Phoøng thí nghieäm Sinh hoïc Phaân töû – tröôøng ÑH Khoa Hoïc Töï Nhieân (ÑH KHTN). 1.1. Ñoä ñuùng (Accuracy) Ñôn vò chòu traùch nhieäm laø ÑH KHTN. Thieát bò söû duïng : - PCR ñònh tính : Techne TC-312 - PCR ñònh löôïng : iCycler 584BR Ñoä ñuùng ñöôïc ñònh nghóa laø ñoä truøng hôïp giöõa giaù trò trung bình cuûa thöû nghieäm vôùi giaù trò ñöôïc coâng nhaän laø chuaån. [6] Ñoä ñuùng cuûa caùc quy trình ñöôïc xaùc ñònh vôùi hai caùch tieáp caän : W So saùnh keát quaû thu ñöôïc töø caùc quy trình thöû nghieäm vôùi keát quaû ñaõ bieát treân 10 beänh phaåm. Cuï theå, keát quaû cuûa quy trình phaùt hieän vaø ñònh löôïng HBV cuõng nhö quy trình phaùt hieän vaø ñònh löôïng HCV ñöôïc so saùnh vôùi keát quaû bDNA vaø vôùi haøm löôïng DNA HBV vaø HCV ñaõ bieát ; keát quaû quy trình phaùt hieän vaø phaân nhoùm HPV thì ñöôïc so saùnh vôùi keát quaû giaûi trình töï. Thao taùc vieân nhaän 10 beänh phaåm töø tröôûng nhoùm khoâng keøm thoâng tin gì veà beänh phaåm. Ñoái vôùi moãi beänh phaåm, thao taùc vieân tieán haønh taùch chieát DNA/RNA vaø ñaët 03 phaûn öùng PCR/RT-PCR ñoäc laäp, söû duïng cuøng boä duïng cuï, cuøng loâ hoùa chaát vaø cuøng maùy PCR. W Söû duïng caùc huyeát thanh coù haøm löôïng HBV (5.105 IU/ml) vaø HCV (5.104 IU/ml) ñaõ bieát do WHO cung caáp ñeå kieåm tra ñoä chính xaùc cuûa hai quy trình ñònh löôïng HBV vaø HCV. Caùc huyeát thanh WHO ñöôïc söû duïng ñeå kieåm tra ñoä chính xaùc cuûa ñöôøng cong chuaån do chuùng toâi xaây döïng. Caùc huyeát thanh WHO ñöôïc pha loaõng baäc 10 thaønh ba noàng ñoä duøng ñeå xaây döïng ñöôøng cong chuaån WHO. Ñöôøng chuaån WHO vaø ñöôøng chuaån töø amplicon do chuùng toâi xaây döïng ñöôïc söû duïng ñeå ñònh löôïng DNA HBV vaø RNA HCV cuûa 5 beänh phaåm. Caùc keát quaû töø hai phaûn öùng ñònh löôïng ñöôïc so saùnh ñeå ruùt ra keát luaän. 10 1.2. Ñoä laëp laïi : Caùc ñôn vò tham gia nghieân cöùu bao goàm : Quy trình Ñôn vò tham gia Phaùt hieän HBV Ñònh löôïng HBV 1) BV ÑH Y Döôïc Phaùt hieän HCV 2) DIAG Center Ñònh löôïng HCV Phaùt hieän HPV 1) BV ÑH Y Döôïc Ñònh nhoùm HPV 2) BV Huøng Vöông Thieát bò söû duïng : - BV ÑH Y Döôïc : iCycler 584BR - DIAG Center : iCycler 582BR iQ5 - BV Huøng Vöông : Master Cycler 22331(Eppendorf) Ñoä laëp laïi cuûa quy trình ñöôïc ñònh nghóa laø möùc ñoä gioáng nhau giöõa caùc laàn laëp laïi khi tieán haønh quy trình trong cuøng ñieàu kieän vaø trong nhöõng ñieàu kieän khaùc nhau. [6] Ñoä laëp laïi cuûa caùc quy trình ñöôïc khaûo saùt treân 10 beänh phaåm ñaõ ñöôïc kieåm tra döông tính nhö neâu ôû muïc 1.1. Caùc beänh phaåm naøy ñöôïc phaân laøm ba phaàn, moät phaàn löu taïi ÑH KHTN, hai phaàn coøn laïi ñöôïc chuyeån ngay ñeán caùc ñôn vò tham gia nghieân cöùu. Ñoái vôùi moãi maãu, hai kyõ thuaät vieân taïi ÑH KHTN seõ tieán haønh laëp laïi 03 laàn. Taïi moãi cô sôû y teá tham gia nghieân cöùu, moät kyõ thuaät vieân tieán haønh taùch chieát DNA/RNA vaø ñaët phaûn öùng PCR/RT-PCR theo quy trình do ÑH KHTN cung caáp. 1.3. Xaùc ñònh ngöôõng phaùt hieän ñoái vôùi hai quy trình ñònh löôïng HBV vaø HCV : Ñôn vò chòu traùch nhieäm : ÑH KHTN Thieát bò söû duïng : iCycler 584BR Caùc amplicon HBV vaø HCV duøng ñeå xaây döïng ñöôøng chuaån ñònh löôïng vôùi noàng ñoä 1014 baûn sao/ml ñöôïc pha loaõng baäc 10 ñi töø 100 ñeán 109. Moãi quy trình ñònh löôïng ñöôïc tieán haønh ba laàn treân töøng noàng ñoä pha loaõng. 1.4. So saùnh keát quaû cuûa quy trình vôùi keát quaû khi söû duïng nhöõng phöông phaùp khaùc treân 20 beänh phaåm moãi loaïi Kit Phöông phaùp so saùnh Phaùt hieän HBV Versant™ HBV DNA 3.0 assay (bDNA) Ñònh löôïng HBV (Bayer) Phaùt hieän HCV Versant™ HCV RNA 3.0 assay (bDNA) Ñònh löôïng HCV (Bayer) Phaùt hieän HPV kit Takara Phaân nhoùm HPV 11 Caùc keát quaû töø phöông phaùp bDNA do Trung taâm Chaån ñoaùn Y khoa Hoøa Haûo cung caáp. 1.5. Tính oån ñònh theo thôøi gian cuûa saûn phaåm : Tính oån ñònh cuûa caùc kit thöû nghieäm ñöôïc kieåm tra lieân tuïc sau 14, 30, 60, 90, 120, 150, 180 ngaøy. ÔÛ moãi ñôït kieåm tra, loâ saûn phaåm ñaõ qua caùc thôøi gian baûo quaûn ôû -20°C vaø loâ saûn phaåm môùi pha seõ ñöôïc söû duïng song song treân 01 maãu aâm tính vaø 01 maãu döông tính vôùi taùc nhaân caàn kieåm tra. 1.6. Ñoä ñaëc hieäu vaø ñoä nhaïy laâm saøng Xaùc ñònh tæ leä ngöôøi maéc beänh vaø khoâng maéc beänh thöïc teá döïa treân toå hôïp nhieàu phöông phaùp vaø so saùnh vôùi keát quaû thu ñöôïc vôùi caùc kit thöû nghieäm. Keát quaû phaùt hieän HBV, HCV ñöôïc so saùnh vôùi toå hôïp keát quaû sinh hoùa vaø mieãn dòch; keát quaû phaùt hieän HPV ñöôïc so saùnh vôùi keát quaû Pap test. 2. TRIEÅN KHAI SAÛN XUAÁT THÖÛ NGHIEÄM 2.1. Chuyeån giao kyõ thuaät Tröôùc khi caùc kit ñöôïc ñöa thöû nghieäm taïi caùc cô sôû y teá tham gia nghieân cöùu, chuùng toâi toå chöùc huaán luyeän kyõ thuaät thao taùc cho caùc kyõ thuaät vieân veà taát caû caùc coâng ñoaïn cuûa quy trình trong thôøi gian 1-2 tuaàn 2.2. Toå chöùc saûn xuaát vaø cung caáp kit cho caùc cô sôû y teá tham gia nghieân cöùu 2.2.1. Ñaët haøng 2.2.2. Kieåm tra chaát löôïng nguyeân lieäu 2.2.3. Pha cheá caùc hoãn hôïp taùch chieát DNA/RNA, PCR, RT/PCR ñònh tính, PCR/RT-PCR ñònh löôïng 2.2.4. Kieåm tra chaát löôïng caùc kit 2.2.5. Giao haøng 2.3. Giaûi quyeát caùc vaán ñeà “haäu maõi” 12 NOÄI DUNG - KEÁT QUAÛ 1. HOAØN THIEÄN CAÙC QUY TRÌNH 1.1. Quy trình phaùt hieän HBV 1.1.1. Ñoä ñuùng Keát quaû phaùt hieän HBV vôùi kit HBV ñònh tính treân 10 beänh phaåm laëp laïi ba laàn cuûa hai ngöôøi thao taùc ñöôïc trình baøy trong baûng 1. Keát quaû ñaày ñuû ñöôïc trình baøy trong phuï luïc 1. Keát quaû ñöôïc tính laø döông hay aâm tính khi caû 03 laàn laëp laïi cho cuøng keát quaû. Caùc keát quaû döông/aâm tính ñöôïc ñaùnh giaù döïa treân söï phuø hôïp vôùi keát quaû bDNA HBV. Baûng 1 : Keát quaû 03 laàn laëp laïi treân 10 beänh phaåm cuûa 02 ngöôøi thao taùc Beänh phaåm Keát quaû 03 laàn laëp Keát quaû 03 laàn laëp Keát quaû ñònh löôïng baèng laïi cuûa ngöôøi I laïi cuûa ngöôøi II bDNA (baûn sao/ml) 1 + + 1.423.039 130.419 2 + + 6.628.213 3 + + 2.721.019 4 + + 275.022 5 + + 526.399 6 + + 364.103 7 + + 689.795 8 + + 1.157.341 9 + + 2.554.745 10 + + <2.000 11 Trong soá caùc beänh phaåm thöû nghieäm coù 01 beänh phaåm aâm tính vôùi HBV vaø 10 beänh phaåm coù chöùa caùc haøm löôïng virus khaùc nhau ñi töø 130.419 baûn sao/ml ñeán 6.628.213 baûn sao/ml. Keát quaû treân cho thaáy quy trình phaùt hieän HBV phuø hôïp 100% vôùi keát quaû ñònh löôïng baèng phöông phaùp bDNA. 1.1.2. Ñoä laëp laïi Keát quaû phaùt hieän HBV vôùi kit HBV ñònh tính töø 02 cô sôû y teá laø BV ÑH Y Döôïc vaø DIAG Center ñöôïc trình baøy trong baûng 2. Baûng 2 : Keát quaû 03 laàn laëp laïi treân 10 beänh phaåm ôû 02 cô sôû y teá Beänh Keát quaû 03 laàn laëp laïi Keát quaû 03 laàn laëp Keát quaû bDNA phaåm taïi BV ÑH Y Döôïc laïi taïi DIAG Center (baûn sao/ml) 1 + + 275.022 2 + + >100.000.000 3 + + 32.772 4 + + >100.000.000 13 5 6 7 8 9 10 + + 9.103.353 + + >100.000.000 + + >100.000.000 + + >100.000.000 + + 1.157.341 + + 2.554.745 Keát quaû baûng 2 cho thaáy ñoä laëp laïi cuûa quy trình phaùt hieän HBV laø 100% treân 10 maãu thöû nghieäm ôû 02 cô sôû y teá. Caùc maãu naøy laø huyeát thanh aâm vaø döông tính coù chöùa haøm löôïng HBV töø 32.772 ñeán > 100.000.000 baûn sao/ml. 1.1.3. So saùnh keát quaû söû duïng kit HBV ñònh tính vôùi keát quaû söû duïng kit Versant (Bayer) treân 20 beänh phaåm Baûng 3. Keát quaû thu ñöôïc vôùi kit HBV ñònh tính vaø kit Versant (Bayer) Beänh phaåm Kit Versant (baûn sao/ml) Kit HBV ñònh tính 1 123.192 ++ 2 >100.000.000 ++++ 3 151.346 +++ 4 6.628.213 ++++ 5 10.526.708 ++++ 6 8.490.049 ++++ 7 63.507.092 ++++ 8 689.795 ++++ 9 582.386 +++ 10 >100.000.000 ++++ 11 304.528 +++ 12 <2.000 13 + 3.261 14 100.000.000 ++++ 15 9.103.353 ++++ 16 89.412.936 ++++ 17 >100.000.000 ++++ 18 >100.000.000 ++++ 19 1.423.039 +++ 20 >100.000.000 ++++ 21 <2.000 Ghi chuù : + € ++++ : Cöôøng ñoä tín hieäu döông tính öôùc löôïng qua maét thöôøng so vôùi moät maãu coù haøm löôïng DNA HBV ñaõ bieát. Keát quaû (baûng 3) cho thaáy : - 19 maãu döông tính vôùi kit HBV ñònh tính coù haøm löôïng HBV töø 3.261 baûn sao/ml ñeán > 108 baûn sao/ml ; ñieàu naøy phuø hôïp vôùi ngöôõng phaùt hieän cuûa kit HBV ñònh tính laø 103 baûn sao/ml. 14 - 2 maãu aâm tính coù haøm löôïng HBV thaáp döôùi ngöôõng phaùt hieän cuûa kit Versant HBV DNA. 1.1.4. Tính oån ñònh cuûa saûn phaåm theo thôøi gian baûo quaûn Tính oån ñònh naøy ñöôïc ñaùnh giaù moät caùch töông ñoái döïa treân keát quaû döông/aâm tính vaø vieäc so saùnh cöôøng ñoä tín hieäu quan saùt baèng maét thöôøng giöõa caùc phaûn öùng söû duïng loâ saûn phaåm baûo quaûn vaø loâ saûn phaåm môùi treân cuøng moät beänh phaåm. Beänh phaåm söû duïng laø beänh phaåm thu nhaän ngay tröôùc khi tieán haønh thí nghieäm ; loâ môùi ñöôïc chuaån bò ngay tröôùc khi tieán haønh thí nghieäm Baûng 4. Keát quaû khaûo saùt ñoä oån ñònh cuûa kit HBV ñònh Thôøi gian (ngaøy) Loâ baûo quaûn Maãu (-) Maãu (+) 14 ++ 30 +++ 60 +++ 90 +++ 120 +++ 150 + 180 ++ (A) (B) (C) 1 (E) 1 2 3 4 1 2 2 3 4 (F) 1 2 3 4 3 4 ( 1 2 3 4 1 2 3 4 tính theo thôøi gian Loâ môùi Maãu (+) ++ +++ ++ +++ ++ ++ ++ (D) 1 2 3 4 Hình 1 : Keát quaû PCR vôùi loâ saûn phaåm ñaõ qua baûo quaûn vaø vôùi loâ môùi cuûa kit HBV ñònh tính 1 : Thang 485 bp; 2, 3 : maãu (-) vaø (+) thöïc hieän vôùi loâ saûn phaåm ñaõ qua baûo quaûn – A-G : thôøi gian baûo quaûn 14, 30, 60, 90, 120, 150, 180 ngaøy ; 4 : maãu (+) thöïc hieän treân loâ saûn phaåm môùi. Keát quaû cho thaáy kit HBV ñònh tính giöõ nguyeân hieäu quaû trong thôøi gian 180 ngaøy trong ñieàu kieän baûo quaûn phuø hôïp. 15 1.2. Kit HCV ñònh tính 1.2.1. Ñoä ñuùng Keát quaû phaùt hieän HCV vôùi kit HCV ñònh tính treân 10 beänh phaåm laëp laïi ba laàn cuûa hai ngöôøi thao taùc ñöôïc trình baøy trong baûng 5. Keát quaû ñaày ñuû ñöôïc trình baøy trong phuï luïc 2. Töông töï nhö ñoái vôùi kit HBV ñònh tính, keát quaû ñöôïc tính laø döông hay aâm tính khi caû 03 laàn laëp laïi cho cuøng keát quaû vaø ñöôïc ñaùnh giaù döïa treân söï phuø hôïp vôùi keát quaû bDNA HCV. Baûng 5 : Keát quaû 03 laàn laëp laïi treân 10 beänh phaåm cuûa 02 ngöôøi thao taùc Beänh phaåm Keát quaû 03 laàn laëp Keát quaû 03 laàn laëp Keát quaû bDNA laïi cuûa ngöôøi I laïi cuûa ngöôøi II (baûn sao/ml) 1 + + 1.293.496 2 + + 782.861 3 + + 580.151 4 + + 1.660.823 5 + + 3.068.264 6 + + 566.565 7 + + 3.917.415 8 + + 6.090.000 9 + + 4.030 10 + + 1.260.000 Caùc beänh phaåm döông tính vôùi HCV coù chöùa caùc haøm löôïng virus ñi töø 4.030 ñeán 6.090.000 baûn sao/ml. Keát quaû treân cho thaáy quy trình phaùt hieän HCV ñaït ñoä chính xaùc 100% treân caùc maãu coù haøm löôïng HCV naèm trong ngöôõng treân. 1.2.2. Ñoä laëp laïi Keát quaû phaùt hieän HCV vôùi kit HCV ñònh tính töø 02 cô sôû y teá laø BV ÑH Y Döôïc vaø DIAG Center ñöôïc trình baøy trong baûng 6 Baûng 6 : Keát quaû 03 laàn laëp laïi treân 10 beänh phaåm ôû 02 cô sôû y teá Beänh Keát quaû 03 laàn laëp laïi Keát quaû 03 laàn laëp Keát quaû ñònh phaåm taïi BV ÑH Y Döôïc laïi taïi DIAG Center löôïng baèng bDNA 1 + + 380.494 2 + + 23.055 3 + + 4.107.441 4 + + 4.280.137 5 + + 38.366 6 + + 99.577 7 + + 1.060.000 8 + + 157.000 9 + + 1.130.000 10 + + 782.861 16 Keát quaû baûng 6 cho thaáy ñoä laëp laïi cuûa quy trình phaùt hieän HCV laø 100% treân 10 maãu thöû nghieäm ôû 02 cô sôû y teá. Caùc maãu naøy laø huyeát thanh aâm vaø döông tính coù chöùa haøm löôïng HCV töø 23.055 ñeán 4.280.137 baûn sao/ml ñöôïc xaùc ñònh baèng kit Versant (Bayer) 1.2.3. So saùnh keát quaû söû duïng kit HCV ñònh tính vôùi keát quaû söû duïng kit Versant (Bayer) treân 20 beänh phaåm Baûng 7. Keát quaû so saùnh giöõa kit HCV ñònh tính vôùi kit Versant HCV treân 20 beänh phaåm nghi nhieãm HCV Beänh phaåm Kit Versant (baûn sao/ml) Kit HCV ñònh tính (baûn sao/ml) 1 12.921.664 ++++ 2 571.580 +++ 3 505.799 +++ 4 2.793.335 ++++ 5 3.214.227 ++++ 6 467.278 +++ 7 13.257.142 ++++ 8 2.357.943 ++++ 9 4.756.803 +++ 10 610.046 +++ 11 147.029 ++ 12 999.677 +++ 13 682.133 +++ 14 3.228.902 ++++ 15 19.245.820 ++++ 16 3.316.638 ++++ 17 1.832.821 +++ 18 4.115.851 +++ 19 <3.200 20 <3.200 Ghi chuù : + € ++++ : Cöôøng ñoä tín hieäu döông tính öôùc löôïng qua maét thöôøng so vôùi moät maãu coù haøm löôïng DNA HBV ñaõ bieát Keát quaû (baûng 7) cho thaáy : - 18 maãu döông tính vôùi kit HCV ñònh tính coù haøm löôïng HCV töø 147.029 ñeán 19.245.820 baûn sao/ml ; ñieàu naøy phuø hôïp vôùi ngöôõng phaùt hieän cuûa kit HCV ñònh tính laø 103 baûn sao/ml - 2 maãu aâm tính vôùi kit HCV ñònh tính coù haøm löôïng HCV thaáp döôùi ngöôõng phaùt hieän cuûa kit Versant HCV RNA Nhìn chung, keát quaû phaùt hieän HCV baèng kit HCV ñònh tính phuø hôïp vôùi keát quaû ñònh löôïng HCV baèng kyõ thuaät bDNA 17 1.2.4. Tính oån ñònh cuûa kit HCV ñònh tính theo thôøi gian baûo quaûn Tính oån ñònh cuûa kit HCV ñònh tính ñöôïc ñaùnh giaù töông töï nhö ñoái vôùi kit HBV ñònh tính : ñoïc keát quaû döông/aâm tính vaø so saùnh cöôøng ñoä tín hieäu quan saùt baèng maét thöôøng giöõa caùc phaûn öùng söû duïng loâ saûn phaåm baûo quaûn vaø loâ saûn phaåm môùi treân cuøng moät beänh phaåm. Beänh phaåm söû duïng laø beänh phaåm thu nhaän ngay tröôùc khi tieán haønh thí nghieäm ; loâ môùi ñöôïc chuaån bò ngay tröôùc khi tieán haønh thí nghieäm. Baûng 8. Keát quaû khaûo saùt ñoä oån ñònh cuûa kit HCV ñònh Thôøi gian (ngaøy) Loâ qua baûo quaûn Maãu (-) Maãu (+) 14 + 30 ++ 60 + 90 + 120 +++ 150 +++ 180 +++ (A) 1 2 (E) 1 3 2 3 4 4 (B) 1 2 (F) 1 2 3 3 (C) 4 1 2 (G) 1 4 2 3 3 4 tính theo thôøi gian Loâ môùi + ++ + + +++ +++ +++ (D) 1 2 3 4 4 Hình 2 : Keát quaû PCR vôùi loâ saûn phaåm ñaõ qua baûo quaûn vaø vôùi loâ môùi cuûa kit HCV ñònh tính 1 : Thang 192 bp; 2, 3 : maãu (-) vaø (+) thöïc hieän vôùi loâ saûn phaåm ñaõ qua baûo quaûn – A-G : thôøi gian baûo quaûn 14, 30, 60, 90, 120, 150, 180 ngaøy ; 4 : maãu (+) thöïc hieän treân loâ saûn phaåm môùi. Keát quaû phaùt hieän HCV vôùi loâ kit ñaõ qua caùc thôøi gian baûo quaûn vaø vôùi loâ kit chuaån bò ngay tröôùc khi tieán haønh phaûn öùng cho thaáy kit HCV ñònh tính giöõ nguyeân hieäu quaû sau 180 ngaøy baûo quaûn ôû ñieàu kieän phuø hôïp. 18 1.3. Kit HPV ñònh tính 1.3.1. Ñoä ñuùng Keát quaû phaùt hieän HPV vôùi kit HPV ñònh tính treân 10 beänh phaåm ñaõ ñöôïc xaùc ñònh laø döông tính vôùi hai ngöôøi thao taùc ñöôïc trình baøy trong baûng 9. Caùc soá lieäu chi tieát ñöôïc trình baøy trong phuï luïc 3. Baûng 9 : Keát quaû 03 laàn laëp laïi treân 10 beänh phaåm cuûa 02 ngöôøi thao taùc Beänh phaåm Keát quaû 03 laàn laëp Keát quaû 03 laàn laëp Keát quaû giaûi trình töï laïi cuûa ngöôøi I laïi cuûa ngöôøi II 1 + + HPV 18 HPV 18 2 + + HPV 58 3 + + HPV 11 4 + + HPV 18 5 + + HPV 16 6 + + HPV 58 7 + + HPV 18 8 + + HPV 18 9 + + HPV 6 10 + + Keát quaû (baûng 9) cho thaáy coù söï phuø hôïp 100 % giöõa keát quaû phaùt hieän HPV baèng kit HPV ñònh tính vôùi keát quaû giaûi trình töï. 1.3.2. Ñoä laëp laïi Keát quaû phaùt hieän HPV vôùi kit HPV ñònh tính töø 02 cô sôû y teá laø BV Huøng Vöông vaø BV ÑH Y Döôïc ñöôïc trình baøy trong baûng 10. Baûng 10 : Keát quaû 03 laàn laëp laïi treân 10 beänh phaåm ôû 02 cô sôû y teá Beänh Keát quaû 03 laàn laëp laïi Keát quaû 03 laàn laëp Keát quaû giaûi trình töï phaåm taïi BV ÑH Y Döôïc laïi taïi DIAG Center HPV 18 1 + + HPV 16 2 + + HPV 6 3 + + HPV 18 4 + + HPV 42 5 + + HPV 18 6 + + HPV 58 7 + + HPV 18 8 + + HPV 11 9 + + HPV 16 10 + + Keát quaû phaùt hieän HPV töø 02 ñôn vò baèng kit HPV ñònh tính coù söï phuø hôïp 100%. 19 1.3.3. Tính oån ñònh cuûa kit HPV ñònh tính theo thôøi gian baûo quaûn Tính oån ñònh cuûa kit HPV ñònh tính ñöôïc ñaùnh giaù töông töï nhö ñoái vôùi kit HBV ñònh tính : ñoïc keát quaû döông/aâm tính vaø so saùnh cöôøng ñoä tín hieäu quan saùt baèng maét thöôøng giöõa caùc phaûn öùng söû duïng loâ saûn phaåm baûo quaûn vaø loâ saûn phaåm môùi treân cuøng moät beänh phaåm. Beänh phaåm söû duïng laø beänh phaåm thu nhaän ngay tröôùc khi tieán haønh thí nghieäm ; loâ kit môùi ñöôïc chuaån bò ngay tröôùc khi tieán haønh thí nghieäm. Baûng 11. Keát quaû khaûo saùt ñoä oån ñònh cuûa kit HPV ñònh tính theo thôøi gian Thôøi gian (ngaøy) Loâ baûo quaûn Loâ môùi Maãu (-) Maãu (+) Maãu (+) 14 ++ ++ 30 +++ ++ 60 + + 90 +++ +++ 120 +++ +++ 150 + ++ 180 ++ ++ (A) (B) (C) (D) 1 2 3 4 1 2 (E) 1 2 3 4 (F) 1 2 3 4 3 4 1 (G) 1 2 3 2 4 3 1 2 3 4 4 Hình 3 : Keát quaû PCR vôùi loâ saûn phaåm ñaõ qua baûo quaûn vaø vôùi loâ môùi cuûa kit HPV ñònh tính 1 : Thang 450 bp; 2, 3 : maãu (-) vaø (+) thöïc hieän vôùi loâ saûn phaåm ñaõ qua baûo quaûn – A-G : thôøi gian baûo quaûn 14, 30, 60, 90, 120, 150, 180 ngaøy ; 4 : maãu (+) thöïc hieän treân loâ saûn phaåm môùi. Keát quaû cho thaáy khoâng coù söï khaùc bieät giöõa loâ ñaõ qua caùc thôøi gian baûo quaûn khaùc nhau vôùi moät loâ chuaån bò môùi. Nhö vaäy kit HPV ñònh tính coù theå baûo quaûn ít nhaát 180 ngaøy trong ñieàu kieän phuø hôïp. 20