Tài liệu Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens hb

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN Serratia marcescens HB Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực hiện : HỒ TRUNG LỘC MSSV: 1411100591 Lớp: 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN Serratia marcescens HB CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành: Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực hiện : HỒ TRUNG LỘC MSSV: 1411100591 Lớp: 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, năm 2018 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài Hƣơng (Giảng viên Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM). Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của mình. TP.HCM, ngày 27 tháng 7 năm 2018 Sinh viên thực hiện HỒ TRUNG LỘC Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã nuôi nấng dạy dỗ con trong 22 năm qua, ngƣời đã cùng con trải qua biết bao nhiêu khó khăn trong cuộc sống và luôn quan tâm con, chăm sóc con, luôn bên cạnh con lúc khó khăn nhất. Con xin cảm ơn gia đình ông bà nội ngoại. Đặc biệt là bà nội, bà ngoại, ba, cô bảy và cậu mợ mƣời trong suốt những năm qua đã tạo điều kiện thuận lợi tốt nhất để con đƣợc bƣớc vào giảng đƣờng đại học với tâm thế thoải mái. Em xin cảm ơn quý thấy cô trong Viện Khoa học Ứng Dụng HUTECH và những thầy cô giảng viên của trƣờng đã tận tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời thầy đầy nhiệt huyết, luôn định hƣớng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em xuyên suốt quá trình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai, ngƣời đã cho em lời khuyên trong quá trình nuôi sâu khoang thí nghiệm và cung cấp trứng sâu cho em. Em xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Minh Nhựt, chị Huỳnh Ngọc Nhi đã cho em vật liệu thử nghiệm để em tiến hành các thí nghiệm khảo sát. Em xin chân thành biết ơn anh Trƣơng Hoài Nguyên, anh Nguyễn Phƣớc Sinh, anh Phạm Hoàng Nhân, chị Cao Thị Thanh Thúy đã truyền đạt cho em những kinh nghiệm, lời khuyên bổ ích trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Và em xin cảm ơn tất cả các bạn đồng nghiệp Lê Đình Nhân, Nguyễn Mộng Trâm, Đặng Thị Kim Tuyền, Đào Đặng Phƣơng Dung, Đinh Ngọc Phƣơng Trinh, Võ Lan Hƣơng, Võ Thành Lâm cùng hai em Võ Đình Chiến và Nguyễn Đăng Thùy Dƣơng đã đồng hành giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2018 HỒ TRUNG LỘC Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................. vii DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................. i MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................. 1 2. Mục đích nghiên cứu: ................................................................................. 1 3. Nhiệm vụ nghiên cứu:................................................................................. 1 4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 2 5. Kết quả cần đạt đƣợc .................................................................................. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học .......................................................... 3 1.1.1. Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học ........................................................ 3 1.1.2. Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trƣờng hiện nay. ...........................................................................................................3 1.1.3. Những ƣu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học ....................... 4 1.2. Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens ................................................... 5 1.2.1. Lịch sử phát hiện .................................................................................. 5 1.2.2. Phân loại ............................................................................................... 6 1.2.3. Đặc điểm của Serratia marcescens ...................................................... 6 1.2.3 .Đặc điểm sinh lí ................................................................................... 7 Đồ án tốt nghiệp 1.2.4. Đặc điểm sinh hóa ............................................................................... 7 1.2.5. Đặc điểm phân bố ................................................................................ 9 1.3. Giới thiệu về Prodigiosin ......................................................................... 10 1.3.1 Khái niệm vê Prodigiosin ................................................................ 10 1.3.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin ............................................... 10 1.3.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin .................................................... 13 1.3.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens ............. 13 1.4. Enzyme ..................................................................................................... 17 1.5.Yếu tố độc lực của Serratia marcescens ................................................... 17 1.6. Khả năng diệt sâu của vi khuẩn Serratia marcescens ............................. 18 1.7. Một số nghiên cứu trên thế giới ............................................................... 20 1.7.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens ....................................... 20 1.7.2. Tình hình nghiên cứu Prodigiosin ................................................... 21 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................... 22 2.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ............................................................... 22 2.1.1. Thời gian ............................................................................................ 22 2.1.2. Địa điểm ............................................................................................. 22 2.2. Vật liệu, hóa chất, thiết bị ........................................................................ 22 2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens ................................................ 22 2.2.2. Nguồn nấm ......................................................................................... 22 2.2.3. Nguồn sâu khoang Spodoptera litura ................................................ 22 2.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất ......................................................22 2.2.5. Dụng cụ, thiết bị ................................................................................. 23 ii Đồ án tốt nghiệp 2.3. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 24 2.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 24 2.5. Phƣơng pháp thí nghiệm .......................................................................... 24 2.5.1. Phƣơng pháp luận .............................................................................. 24 2.5.2. Bố trí thí nghiệm ................................................................................ 27 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu bố trí thí nghiệm ...........................................29 2.6.1. Phƣơng pháp chọn lọc chủng seratia marcescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào Protease mạnh nhất. ........................ 30 2.6.1.1. Phƣơng pháp định tính enzyme ................................................... 30 2.6.1.2. Phƣơng pháp trích ly thu Prodigiosin .......................................... 31 2.6.2. Khảo sát phƣơng pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu quả ................................................................................................................ 33 2.6.2.1. Phƣơng pháp xử lý tế bào bằng acid............................................ 33 2.6.2.2. Phƣơng pháp xử lý nhiệt .............................................................. 33 2.6.2.3. Phƣơng pháp xử lý tế bào bằng Formalin.................................... 34 2.6.3. Phƣơng pháp định tính enzyme của dịch nuôi cấy sau khi xử lý tế bào................................................................................................................34 2.6.4. Phƣơng pháp khảo sát sự ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiêu lực diệt sâu của chế phẩm ở các công thức phụ gia... ................... 37 2.6.4.1 Tỷ lệ các chất phụ gia trong chế phẩm ......................................... 37 2.6.4.2. Khảo sát hiệu lực diệt sâu khoang bằng phƣơng pháp quét lá .... 38 2.6.6. Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng nấm...................................... 40 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 43 iii Đồ án tốt nghiệp 3.1.Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất................................................................... 43 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào. ....................................................... 43 3.1.2. Trích ly thu prodigiosin ..................................................................... 45 3.1.3. So sánh hình thái của chủng SH1 và HB. .......................................... 47 3.2. Kết quả khảo sát phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu quả nhất................................................................................ 50 3.2.1. Phƣơng pháp xử lý acid ..................................................................... 51 3.2.2. Phƣơng pháp xử lý nhiệt .................................................................... 52 3.2.3. Phƣơng pháp xử lý tiêu diệt tế bào bằng dung dịch Formalin. .......... 54 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào của dịch nuôi cấy Serratia marcescens HB sau khi xử lý tế bào. .............................................................. 57 3.3.1. Thử nghiệm hoạt tính protease .......................................................... 57 3.3.2. Thử nghiệm hoạt tính Chitinase......................................................... 57 3.5. Khả năng ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở các nồng độ phụ gia.. ................................................... 59 3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm có lợi .......................................... 62 3.8. Quy trình sản xuất chế phẩm chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB............................................................................................ …64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 66 4.1. Kết luận .................................................................................................... 66 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 66 Tài liệu tiếng Việt ........................................................................................ 67 iv Đồ án tốt nghiệp Tài liệu nƣớc ngoài.......................................................................................... 68 PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG .................................... 72 PHỤ LỤC B. HÌNH ẢNH .............................................................................. 75 PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ .................................................................................. 82 PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ ............................................................. 84 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EPN : Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh: Entomopathogenic nematodes). H-CP16 : Heterorhabditis indica CP16 A.nauplii : Artemia nauplii S.marcescens: Serratia marcescens. SH1 : Serratia marcescens SH1 SH4 : Serratia marcescens SH4 SH5 : Serratia marcescens SH5 SB :Serratia marcescens SB HB :Serratia marcescens HB PG :Môi trƣờng Peptone glycerol PGA :Môi trƣờng Peptone glycerol agar CMC :Carboxymethyl cellulose vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011 Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens Hình 1.3 Các chất đại diện Prodigiosin (Fursttner, 2003) Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp Prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp Undercylprodigiosin (cụm màu đỏ từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp Prodigiosin Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh của enzyme serralysin metallprotease của S. marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishi et al; 2014) Hình 2.1 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật phù hợp Hình 2.2 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học khả năng diệt sâu và độc tính của chế phẩm Hình 2.3 Quy trình thử nghiệm khảo sát chọn ra phƣơng pháp tiêu diệt tế bào tối ƣu. Hình 2.4 Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men các chủng vi khuẩn Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch gelatin agar Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch Tween 80 agar Hình 2.7 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trƣờng thạch chitin agar Hình 2.8 Bố trí nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA Hình 3.1 Khả năng tiết enzyme Protease của 5 chủng Serratia marcescens SH1, SH4, SH5, SB, HB tƣơng ứng với các ký hiệu A, B, C, D, E. Hình 3.2 Khả năng tiết enzyme chitinase của chủng SB và HB. vii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện giá trị OD hiệu chỉnh của 5 chủng SH1, SH4, SH5, SB, HB. Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc và hình thái nhuộm Gram của hai chủng SH1 và HB Hình 3.5 Kết quả quét phổ hấp thu dịch lên men hai chủng Serratia marcescens SH1 và HB Hình 3.6 Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v) của chủng SH1 Hình 3.7 Kết quả quét phổ sau trích ly bằng hệ dung môi Ethanol:HCl (95:5,v:v) của chủng HB. Hình 3.8 Khuẩn lạc Serratia marcescens xuất hiện trên thạch PGA ở đĩa đối chứng (A) và đĩa khảo sát (B) sau 48 giờ ủ. Hình 3.9 Kết quả sau khi ria lại trên thạch PGA sau 24 giờ ủ ở hai nghiệm thức 1000C (A) và 650C (B). Hình 3.10 Kết quả sau khi cấy ria dịch canh trƣờng Serratia marcescens HB đã xử lý Formalin ở các nồng độ. Hình 3.11 Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của chế phẩm với các nồng độ phụ gia theo thời gian theo công thức Abbott (1925). Hình 3.12 Sâu khoang chết sau khi thử nghiệm chế phẩm. Hình 3.13 Sơ đồ sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB đã xử lý tế bào. viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens. Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973). Bảng 1.3 Tóm tắt những nghiên cứu liên quan đến chế phẩm diệt sâu từ Serratia marcescens đã thực hiện. Bảng 2.1 Bảng bố trí các nghiệm thức các nồng độ phụ gia. Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescen SH1, SH4, SH5, SB và HB. Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm), OD535nm sau khi trích ly sắc tố của các chủng SH1, SH4, SH5, SB, HB. Bảng 3.3 Bảng so sánh lƣợng prodigiosin còn lại sau quá trình xử lý tế bào ở các giá trị nồng độ Formalin . Bảng 3.4 Các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng lên men sau xử lí Formalin 0,5%. Bảng 3.5 Hiệu lực diệt sâu khoang tuổi 3 của chế phẩm. Bảng 3.6 Tỷ lệ ức chế nấm Trichoderma sp. Bảng 3.7 Tỷ lệ ức chế nấm Paecilomyces lilacinus. ix Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Theo thống kê của tổ chức Lƣơng – Nông thế giới cho thấy: các loài cây trồng hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Đây quả là một lực lƣợng hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất lớn cho mùa màng. Để giải quyết vấn đề trên, con ngƣời đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại.Từ đó đã ra đời nền công nghiệp thuốc trừ sâu hóa học, diệt các mầm bệnh cho cây trồng. Tuy nhiên, ngƣời nông dân đã dùng thuốc hóa học với liều lƣợng quá mức cho phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình sâu hại trở nên nghiêm trọng và diễn biến phức tạp hơn. Những năm gần đây, việc trích ly đƣợc hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay chỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chƣa có nghiên cứu nào về ứng dụng tạo phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin hoặc đã nghiên cứu nhƣng vẫn chƣa hoàn thiện đƣợc sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học. Dựa trên cơ sở đó mà ngƣời thực hiện đề tài đã chọn hƣớng cho Đồ án tốt nghiệp là: “Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB. 2. Mục đích nghiên cứu: Hoàn thiện quy trình tạo chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcesces chứa hợp chất prodigiosin. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu: Khảo sát chọn chủng vi khuẩn Serratia marcescens thích hợp có khả năng sinh tổng hợp Prodigiosin với nồng độ cao và hoạt lực enzyme protease, chitinase mạnh 1 Đồ án tốt nghiệp Khảo sát phƣơng pháp xử lý tiêu diệt tế bào vi khuẩn sau lên men thích hợp và để đảm bảo mục tiêu an toàn sinh học. Khảo sát sự ảnh hƣởng của việc phơi nắng đối với hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở các công thức phụ gia. Đƣa ra quy trình hoàn thiện để tạo chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Sử dụng công thức Abbott (1925) để tính toán hiệu lực diệt sâu. Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để phân tích ANOVA từ số liệu kết quả thu đƣợc. 5. Kết quả cần đạt đƣợc Chọn đƣợc chủng vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và nồng độ prodigiosin cao. Chọn phƣơng pháp xử lý thích hợp đối với dịch nuôi cấy sau lên men để tiêu diệt tế bào vừa đảm bảo mục tiêu an toàn sinh học vừa giữ đƣợc hoạt tính, nồng độ của hợp chất thứ cấp prodigiosin. Khảo sát đƣợc hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: hoạt lực enzyme, khả năng kháng nấm. Khảo sát khả năng ảnh hƣởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở các nồng độ phụ gia. Chọn ra đƣợc tỷ lệ phụ gia thích hợp cho việc tạo chế phẩm. Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu từ dịch lên men vi khuẩn Serratia marcescens HB. 2 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học là chất có khả năng kiểm soát dịch hại bằng cơ chế không độc. Thuốc trừ sâu sinh học có thể là các sinh vật sống (thiên địch) hoặc chế phẩm của chúng (hóa chất thực vật, chế phẩm vi sinh) hoặc hóa chất truyền tin đƣợc sử dụng để quản lý dịch hại cho thực vật. Thuốc trừ sâu sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng, mặc dù hầu hết các loại thuốc này thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với các công cụ khác (thuốc trừ sâu hóa học) nhƣ một phần của hoạt động quản lý dịch hại bằng phƣơng pháp sinh học. 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay 1. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000 IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu thuộc họ Lepidoptera. 2. Chế phẩm NPV: là chế phẩm trừ sâu hoạt lực mạnh và có tính chuyên hóa cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc chuyên dung để diệt trừ sâu xanh, sâu xanh đốm trắng, sâu khoang, sâu tơ trên các loại cây rau màu, cây công nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV có nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tƣơng đối dễ dàng: chỉ cần hòa thuốc vào bình và phun bình thƣờng với liều lƣợng 1,0 – 1,2 kg/ha. 3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium anisopliae (nấm xanh) đƣợc dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa va cây ăn quả đạt 70-90%, dạng nấm trắng (Beauveria sp.) đạt 50-85%. Chế phẩm Beauveria chuyên dung để trị sâu róm thong và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%.Tiến sĩ Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại 3 Đồ án tốt nghiệp thuốc này có thể sử dụng để tiêu diệt sâu róm hại thong đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”. 4. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15-20 x106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá, đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã đƣợc đƣa vào ứng dụng để trƣ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ hung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hóa). 5. Chế phẩm hóa sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trƣ các loại sâu hại rau màu đạt 45-50%. 6. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây ăn quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004). 1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học Ƣu điểm: - Ít độc với ngƣời và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ đƣợc sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu), ít gây tình trạng bùng phát dịch côn trùng. - Thời gian phân hủy trong tự nhiên nhanh chóng, ít để lại dƣ lƣợng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao nhƣ các loại rau, chè… - Ngoài ra, các nguyên liệu để làm thuốc trừ sâu sinh học thƣờng có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc nhƣ ớt, tỏi, hành, gừng…Chi phí sản xuất khi tự làm thuốc trừ sâu sinh học thấp hơn so với thuốc trừ sâu hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho ngƣời dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao. Hạn chế: - Các thuốc vi sinh thƣờng thể hiện hiệu quả diệt sâu tƣơng đối chậm hơn so với thuốc hóa học. - Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thƣơng yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn. 4 Đồ án tốt nghiệp 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.1 Lịch sử phát hiện Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó, vào năm 332 trƣớc công nguyên, những ngƣời lính trong quân đội Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có “máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng. Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố nhƣ vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcescens. Tuy nhiên, điều này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011). Bizio, một dƣợc sĩ ở Padua (Italya) là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serrati, tên loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta. Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn thấy những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn. 5 Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Phân loại Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serriatia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Serratia Loài: Serratia marcescens 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 400C và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) 6 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc Serratia marcesens 1.2.3 Đặc điểm sinh lí Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng Nutrient agar đƣợc mô tả là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học. 1.2.4 Đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng hiếu khí và kỵ khí. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, catalase, peroxides,…bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). 7