Tài liệu Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài các gen nrlsu và atp6

  • Số trang: 92 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 585 |
  • Lượt tải: 0
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI CÁC GEN nrLSU VÀ ATP6 KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SHPT GVHD: SVTH: MSSV: Khóa: ThS. Lao Đức Thuận CN. Vũ Tiến Luyện Nguyễn Thị Bích Thảo 1153010755 2011-2015 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành gửi tới thầy Lao Đức Thuận và anh Vũ Tiến Luyện - người luôn tận tình, kiên nhẫn và quan tâm hướng dẫn em trong suốt quá trình làm đề tài để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Người luôn tạo điều kiện cho em học tập, trau dồi kiến thức và rút ra nhiều bài học trong khoảng thời gian vừa qua. Em xin cảm ơn các bạn cùng nhóm đề tài và tập thể trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, trường Đại Học Mở TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ, tạo điều kiện trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Trên hết, con xin cảm ơn bố mẹ và gia đình đã luôn yêu thương và giúp đỡ con. Bình Dương, ngày 05 tháng 05 năm 2015. Danh mục bảng biểu Bảng 2.1. Trình tự các mồi sử dụng trong phản ứng PCR. Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR. Bảng 3.1. Các đặc tính vật lý của mồi LR0R/LR5 và ATP6-C1A/ATP6-C2A. Bảng 3.2. Thông tin trình tự tham chiếu dùng để xây dựng dữ liệu vùng trình tự nrLSU và Atp6. Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế khảo sát trên 3 mẫu nấm ký sinh côn trùng được tách chiết theo phương pháp Phenol:Chloroform. Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế khảo sát trên 3 mẫu nấm ký sinh côn trùng được tách chiết theo phương pháp Phenol:Chloroform bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB. Bảng 3.5. Hiệu chỉnh các nucleotide tại các vị trí (1) đến (10). Bảng 3.6. Tổng hợp kết quả hiệu chỉnh trình tự các mẫu nấm ký sinh côn trùng. Bảng 3.7. Kết quả chiều dài trình tự trước và sau hiệu chỉnh. Bảng 3.8. Kết quả các thông số của mô hình tiến hóa tốt nhất. Bảng 3.9. Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu phân tử và hình thái. Danh mục hình ảnh Hình 1.1. Cordyceps sinensis. Hình 1.2. Cấu trúc của rDNA. Hình 1.3. Vị trí các mồi khuếch đại gen nrLSU. Hình 2.1. Hình thái giải phẫu nấm mẫu DL004. Hình 2.2. Hình thái giải phẫu nấm mẫu DL0075. Hình 2.3. Hình thái nấm mẫu DL0077. Hình 3.1. Vị trí mồi xuôi ATP6-C1A được sắp gióng cột với các trình tự gen Atp6. Hình 3.2. Vị trí mồi ngược ATP6-C2A được sắp gióng cột với các trình tự gen Atp6. Hình 3.3. Kết quả sắp gióng cột của mồi xuôi LR0R với trình tự gen nrLSU. Hình 3.4. Kết quả sắp gióng cột của mồi ngược LR5 với trình tự gen nrLSU. Hình 3.5. Kết quả Annhyb cặp mồi ATP6-C1A và ATP6-C2A trên trình tự gen Atp6. Hình 3.6. Kết quả Annhyb cặp mồi LR0R và LR5 trên trình tự gen nrLSU. Hình 3.7. Kết quả kiểm tra mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A bằng BLAST trên GenBank. Hình 3.8. Kết quả kiểm tra mồi LR0R/LR5 bằng BLAST trên GenBank. Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 mẫu DL004, DL0075, DL0077 với cặp mồi LR0R/LR5 được tách chiết theo phương pháp Phenol:Chloroform. Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 mẫu DL004, DL0075, DL0077 với cặp mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A được tách chiết theo phương pháp Phenol:Chloroform. Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR cặp mồi LR0R/LR5 theo phương pháp Phenol:Chloroform có sử dụng β - mercaptoethanol và CTAB. Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR cặp mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A theo phương pháp Phenol:Chloroform có sử dụng β - mercaptoethanol và CTAB. Hình 3.13. Trình tự DNA của mạch xuôi và ngược chưa hiệu chỉnh của gen Atp6 trên giao diện Chromas lite. Hình 3.14. Mô tả sự sai khác mucleotide ở hai mạch xuôi và ngược gen Atp6. Hình 3.15. Vị trí sai lệch của hai kết quả giải trình tự ở đầu mạch xuôi của Atp6. Hình 3.16. Kết quả BLAST trình tự gen Atp6 mạch xuôi đã hiệu chỉnh. Hình 3.17. Cây phả hệ phân tử gen nrLSU được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood với bộ cơ sở dữ liệu. (Các con số hiển thị trên cây là giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại lần lượt của các cây NJ/MP/ML). Hình 3.18. Cây phả hệ phân tử gen Atp6 được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood với bộ cơ sở dữ liệu. (Các con số hiển thị trên cây là giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại lần lượt của các cây NJ/MP/ML). Hình 3.19. Cây phả hệ phân tử gen nrLSU-Atp6 được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood với bộ cơ sở dữ liệu. (Các con số hiển thị trên cây là giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại, lần lượt của các cây NJ/MP/ML). Danh mục những chữ viết tắt ATP: Adenosine triphosphate BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Bp: Base-pair Nu: Nucleotide DNA: Deoxyribonucleotide triphosphate RNA: Ribonucleic acid ITS: Internal transcribed spacer SSU: Small subunit LSU: Large subunit MP: Maximum parsimony ML: Maximum likelihood NJ: Neighbor-joining rDNA: Ribosomal DNA CTAB: Cetyl Trimethylammonium Bromide MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1. NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG ..................................................................3 1.1.1. Đặc điểm chung .....................................................................................3 1.1.2. Sự phân bố và thành phần loài ............................................................4 1.1.3. Ứng dụng của nấm Cordyceps ..............................................................4 1.2. NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI ............................5 1.2.1. Đặc điểm nhận dạng và định danh ......................................................5 1.2.2. Định danh phân tử ................................................................................7 1.2.3. Gen MT-Atp6 (Mitochondrially encoded ATP synthase 6) .................7 1.2.4. DNA ribosome và gen nrLSU (nuclear ribosomal large subunit) ....8 1.3. TÁCH CHIẾT DNA VÀ KỸ THUẬT PCR ............................................11 1.3.1. Tách chiết DNA ...................................................................................11 1.3.2. Kỹ thuật PCR ......................................................................................12 1.3.3. Giải trình tự .........................................................................................12 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC .......................................13 1.5. PHẢ HỆ PHÂN TỬ[11] ..............................................................................15 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................20 2.1.1. Phần mềm trong khảo sát in silico ....................................................20 2.1.2. Vật liệu sử dụng trong thực nghiệm..................................................20 2.2. TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM ...................................................................23 2.2.1. Khai thác và thu thập tài liệu ............................................................24 2.2.2. Khảo sát in silico .................................................................................24 2.2.3. Thực nghiệm ........................................................................................25 2.2.4. Giải trình tự .........................................................................................28 2.2.5. Hiệu chỉnh trình tự .............................................................................28 2.2.6. Xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA6.0................28 PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỒI ....................................................................30 3.2. CƠ SỞ DỮ LIỆU CỤC BỘ TRÌNH TỰ nrLSU VÀ ATP6 NHÓM NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG ...........................................................................38 3.3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ....................................................................44 3.4. KẾT QUẢ HIỆU CHỈNH TRÌNH TỰ ....................................................47 3.5. KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH LOÀI ................................52 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................60 4.2. ĐỀ NGHỊ ....................................................................................................60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................61 PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Cordyceps là nấm ký sinh trên côn trùng được biết đến và sử dụng phổ biến trong các bài thuốc cổ truyền của Trung Quốc kể cả các nước Châu Á. Đại diện tiêu biểu của chi này là Cordyceps sinensis, chứa các chất có hoạt tính cao ứng dụng trong y dược như kháng khối u, đáp ứng miễn dịch, chống oxi hóa, chống tăng đường huyết, hiệu quả bảo vệ thận, nâng cao hoạt động tình dục và sinh sản,… Chi nấm Cordyceps có hơn 400 loài đã được phát hiện. Trong đó, chúng được định danh chủ yếu bằng phương pháp truyền thống thông qua định danh hình thái gồm các đặc tính: quả thể, sinh bào tử, hình thái sinh sản…. Tuy nhiên, việc định danh hình thái chi Cordyceps cũng còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế trong việc phân loại, vì chi Cordyceps có thành phần loài rất phong phú. Đặc biệt, nhóm này tồn tại ở hình thức sinh sản vô tính và hữu tính. Ngoài ra, kiểu hình chi Cordyceps bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường khác nhau tạo nên dị hình thái dễ nhầm lẫn cho các nhà nấm học khi phân loại. Trong những năm gần đây, các tiến bộ của sinh học phân tử và ứng dụng tin sinh học, đã đóng góp rất nhiều cho việc giải quyết những khó khăn trên. Chẳng hạn như việc sử dụng các gen thuộc nhóm gen giữ nhà (house-keeping gen) để xây dựng cây phát sinh loài đã mang lại hiệu quả (Sung et al., 2007). Trong đó, gen nrLSU-rRNA mã hóa RNA 25S-28S của ribosome (tiểu phần lớn của ribosome) có nhiều vùng bảo tồn và đa dạng. Ngoài ra, nrLSU-rRNA còn bao gồm những vùng domain D1, D2, D3, gọi là vùng biến động (D-divergence region) chứa nhiều thông tin duy truyền, có độ bảo tồn cao và có thể khuếch đại bằng cặp mồi phổ quát do đó nó thích hợp cho nghiên cứu cấp độ loài thậm chí còn vượt qua cả mức độ loài. Hơn nữa, nrLSU-rRNA được coi như là một chỉ thị phân tử (marker) để phân loại và xác định tên loài trong một phạm vi rộng. Cùng với gen Atp6 mã hóa cho enzym ATPase trong ty thể tiểu phần số 6 của phức hợp F1-F0 ATPase. Mà ATPase là enzyme có vai trò quan trọng tham gia vào quá trình tạo ATP từ ADP trong ty thể, với sự hiện diện của kênh gradient Trang 1 proton qua màng, được tạo ra bởi tổ hợp vận chuyển điện tử của chuỗi hô hấp, cung cấp năng lượng cho tế bào sử dụng. Vì vậy, kết hợp gen ribosome nrLSU (Artjariyasripong et al., 2001, Sung et al., 2001, Stensrud et al., 2005) với gen Atp6 sẽ giúp cải thiện khả năng phân nhánh của cây phát sinh loài (Sung et al., 2007) dẫn đến tăng thêm mức độ chính xác trong việc định danh loài. Nên gen nrLSU và Atp6 là gen mục tiêu được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài để tìm ra độ tương quan và mức độ di truyền giữa các loài. Xuất phát từ những vấn đề trên tôi đề xuất đề tài: “Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài các gen nrLSU và Atp6”. Trang 2 PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1. NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG 1.1.1. Đặc điểm chung Cordyceps là nấm ký sinh trên côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Pyrenomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae[43]. Cordyceps sinensis được biết đến nhiều nhất trên thế giới vì có giá trị dược liệu quý hiếm và độc đáo, được phát hiện đầu tiên trong Đông y Trung Quốc hơn 50.000 năm trước[34]. Cordyceps sp. ký sinh trên côn trùng, động vật chân đốt (arthropods) và một số ít ký sinh trên nấm khác[29]. Đại diện, C. sinensis chủ yếu sống ký sinh trên ấu trùng của các loài sâu thuộc họ sâu bướm thuộc chi Hepialus, thường gặp nhất là ký sinh trên ấu trùng loài Hepialus biruensis chúng thường được gọi là „Đông trùng hạ thảo‟[26]. C. sinensis xâm nhiễm vào sâu non và bắt đầu làm chết ký chủ, sống ký sinh suốt mùa đông. Khi gặp điều kiện thích hợp vào mùa hè, các sợi nấm mọc ra từ miệng của xác sâu non và phát tán bào tử. Quả thể nấm có hình trụ, đỉnh túi dày, các bào tử có thể ngắt rời nhau[43]. Hình 1.1. Cordyceps sinensis[59]. Các nghiên cứu về nhóm nấm Cordyceps trong thời gian gần đây cho thấy không chỉ riêng C. sinensis mới có tính chất như: kháng khối u, chống oxi hóa, chống tăng đường huyết, hiệu quả bảo vệ thận, nâng cao hoạt động tình dục và sinh sản, …[12]. Nhiều loài Cordyceps sp. được phát hiện có khả năng ứng dụng trong y dược như C. Militaris, C. Cicadae, C. Ophioglossoides.... Một số các đặc tính dược lý điển hình như khả năng điều hòa đáp ứng miễn dịch của C. cicadae hay ức chế các tế bào khối u của C. Ophioglossoides, C. cicadae và Trang 3 chống oxy hóa của C. Militaris,...[27]. Đặc biệt, một số loài Cordyceps còn được ứng dụng trong kiểm soát sinh học điển hình chi nấm Beauveria và Metarhizium[8]. Các thành phần có hoạt tính chính của C. sinensis thường có bản chất là các nucleoside, cordycepin (3‟-deoxyadenosin), polysaccharide, protein, sterol...[26]. Các chất này thường được phân lập từ hệ sợi hay quả thể[26]. Ngoài ra, nó còn chứa các nguyên tố vi lượng như K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni…[26]. 1.1.2. Sự phân bố và thành phần loài Cordyceps chủ yếu tìm thấy vào mùa hè và phát triển mạnh ở độ cao trên 3800 m trên mực nước biển cấp, trong lạnh, cây cỏ hoặc đồng cỏ núi cao trên dãy cao nguyên Himalaya Tây Tạng và các tỉnh của Trung Quốc Tứ Xuyên, Cam Túc, Hồ Bắc, Chiết Giang, Sơn Tây, Thanh Hải và Vân Nam[26]. Cordyceps là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae, ước tính hơn 400 loài đã được mô tả trên toàn thế giới[33]. Trong đó, khoảng 90 loài được phát hiện tại Trung Quốc[50]. Chúng phân bố khắp thế giới ở tất cả các vùng trên mặt đất trừ Nam Cực và sinh sôi nảy nở tốt chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là khu vực Đông và Đông Nam Á dẫn đến sự đa dạng loài tại đây[43]. 1.1.3. Ứng dụng của nấm Cordyceps 1.1.3.1. Ứng dụng trong y dược Cordyceps có polysaccharides chiếm khoảng 3 - 8% tổng trọng lượng, chống ung thư, điều trị bệnh tim và hỗ trợ cải thiện khả năng giải độc gan…[26]. Các ergosterol và các đồng phân có hoạt tính kháng virus, điều hoà tim mạch, điều trị bệnh thận[51]. Cùng với hợp chất cordycepin và beta - glucans trong quả thể có tác dụng làm tăng trưởng chất ức chế chống lại tế bào ung thư. Chính vì vậy, Cordyceps trong tương lai sẽ được ứng dụng trị liệu trong điều trị ung thư, như là một loại thuốc hỗ trợ cho hóa trị liệu, xạ và cả trong điều trị ung thư truyền thống[26]. Hơn nữa, Cordyceps có tác dụng tăng cường miễn dịch vì sản xuất và bảo vệ tế bào T làm nâng cao hoạt tính đại thực bào và tế bào NK (natural killer cell-tế Trang 4 bào bạch cầu có khả năng nhận dạng và tiêu diệt vi trùng), cải thiện các kháng thể[34]. Cordyceps có khả năng điều trị rối loạn tình dục ở cả nam giới và nữ giới đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu tại các nước chủ yếu là Trung Quốc. Bởi vì trong quả thể của chúng có chứa hợp chất steroid có khả năng chống rối loạn tình dục[1][26]. 1.1.3.2. Ứng dụng trong sinh học Nấm Cordyceps sp. ngoài ứng dụng trong y dược còn được ứng dụng rộng rãi và thành công trong kiểm soát sinh học. Bởi vì nấm Cordyceps mang đặc điểm là ký sinh trên côn trùng nên Cordyceps trở thành thiên địch của các loài côn trùng gây hại. Chính vì vậy nhiều loài đã được sử dụng rộng rãi trong kiểm soát sinh học chống các loài sâu hại hay dịch bệnh. Tiêu biểu như loài nấm Beauveria bassiana và Metarhizium, trong đó nấm Beauveria bassiana sử dụng như thuốc trừ sâu vi sinh vật thay thế cho thuốc trừ sâu hóa học, bởi vì chúng có khả năng gây độc cho ký chủ cao, tác dụng nhanh, có phổ ký chủ rộng và an toàn cho người (McCoy, 1990)[45]. Hơn nữa, nấm Beauveria và Metarhizium dùng để phòng trừ sâu hại cây trồng, cây rừng, đồng thời phát triển công nghệ, hoàn thiện môi trường. Cụ thể, năm 2010 viện bảo vệ thực vật đã sản xuất và sử dụng chế phẩm nấm Beauveria bassiana phòng trừ sâu róm hại thông và nấm Metarhizium anisopliae trừ châu chấu hại ngô, mía, bọ cánh cứng hại dừa và một số sâu hại rau khác,… mang lại hiệu quả cao[8]. 1.2. NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI 1.2.1. Đặc điểm nhận dạng và định danh Trước đây, nấm ký sinh côn trùng chủ yếu được định danh dựa trên phân tích đặc điểm hình thái: màu sắc, quả thể, sinh sản, bào tử. Trong đó, họ Clavicipitaceae được nhận biết bởi các đặc điểm: thể túi dạng trụ, đỉnh túi dày và các bào tử túi dạng sợi thường có thể ngắt rời thành nhiều bào tử thứ cấp[43]. Bên cạnh đó, năm 1982 Kobayasi đã tiến hành định danh nấm này dựa vào vật chủ ký sinh của chúng, bởi vì giữa nấm này với vật chủ khi chúng chọn để ký sinh có mối liên quan mật thiết với nhau[43]. Trang 5 Thông qua những đặc điểm về hình thái và vật chủ ký sinh, họ Clavicipitaceae gồm nhóm: Cordyceps, Hypocrella và Torrubiella: ký sinh trên động vật chân đốt và nấm[43] [44]. Claviceps, Balansia và Epichloe: ở các loài cỏ cộng sinh[43] [44]. Elaphocordyceps bao gồm tất cả các loài sống ký sinh ở Elaphomyces hay ký sinh trên nhộng ve sầu[43] [44]. Cordyceps s.s: thường có màu vàng nhạt, sáng, quả thể mềm (Cordyceps militaris). Có chất nền dày mang sắc tố nhạt hoặc màu sáng rực rỡ, sợi nấm tổ chức lỏng lẻo, bào tử hình trụ. Đặc biệt, loài của Cordyceps s.s sinh chủ yếu 3 loại bào tử bao gồm: Bào tử tách rời (C.militaris); Bào tử nguyên (C.cardinalis và C.pseudomilitaris); Bào tử dạng Bola (C.bifusispora). Vật chủ ký sinh của chúng trong môi trường dễ tiếp cận như lá cây, rêu hoặc các lớp đất trên cùng[43] [44] . Metarcordyceps: quả thể nấm tươi có màu từ trắng (Metarcordyceps youngmunensis), màu hoa cà, màu tím, màu xanh lá cây. Các mẫu nấm khô có màu sẫm hơn hoặc màu đen (Metarcordyceps taii). Kết cấu của quả thể gồm hệ sợi và ít cùi hơn chi Cordyceps s.s[43] [44]. Ophiocordyceps: sắc tố đậm được tìm thấy trong đất (Ophiocordyceps sinensis) và trong gỗ mục (Ophiocordyceps variabilis). Hình thái quả thể đa dạng tùy theo loài, có thể có hình chỉ, dẻo dai hay hình chùy, có hệ sợi…[43][44]. Tuy nhiên, việc định danh bằng hình thái vẫn gặp khó khăn do chi nấm này có thành phần loài rất phong phú và hình dạng bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường. Những đặc điểm hình thái như màu sắc, hình dạng quả thể của từng cá thể khác nhau trong cùng một loài cũng có những biến đổi lớn. Hơn nữa, chúng tồn tại ở thể lưỡng danh là thể vô tính và hữu tính nên khó phân biệt, dẫn đến dễ nhầm lẫn khi định danh qua hình thái. Vì vậy, định danh thông qua hình thái còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế[29][43]. Trong những năm gần đây, các tiến bộ của sinh học phân tử và ứng dụng phần mềm tin sinh đã đóng góp rất nhiều cho việc giải quyết những khó khăn trong Trang 6 việc định danh nấm ký sinh côn trùng[19]. Chẳng hạn như, dựa trên kết quả phân tích cây phát sinh loài để suy luận mối quan hệ và lịch sử tiến hóa của các loài nấm ký sinh côn trùng, cây phát sinh loài này được xây dựng chủ yếu dựa trên bộ cơ sở dữ liệu gồm các vùng gen như: gen ITS (interrnal transcribed spacer)[48], gen ribosome (SSU nrDNA, LSU nrDNA) hay các gen thuộc nhóm gen giữ nhà (Atp6, Tef1, Rpb1, Rpb2,…) đã được ứng dụng rộng rãi[16][30][43]. 1.2.2. Định danh phân tử Định danh phân tử là xác định và phân loại thành phần loài ở mức độ phân tử thông qua việc so sánh các trình tự nucleotide và acid amin của DNA, protein hay RNA. Thực chất, của phương pháp định danh này dựa vào các đặc điểm của kiểu gen thay vì sử dụng kiểu hình như trong phân loại hình thái học. Hiện nay, định danh phân tử thông qua vùng gen giữ nhà “house-keeping gen”, phân tích cây phát sinh loài kết hợp với giá trị bootstrap được nhiều nhà khoa học đã và đang sử dụng hiệu quả trong việc định danh của các loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn trùng và một số nấm khác cùng với loài sinh vật khác với phạm vi rộng rãi[43][44]. Hơn nữa, định danh phân tử có vai trò quan trọng hỗ trợ cho phương pháp định danh hình thái để giúp giải quyết những hạn chế trong việc xây dựng hệ thống học và định danh các loài nấm về tính di truyền hay phát sinh loài,…[19]. Hiện nay, các nhà nghiên cứu dựa vào việc xây dựng và phân tích địa hình học của cây phát sinh loài, phân nhóm của cây và dựa vào giá trị bootstrap để định danh, xác định các loài sinh vật quan tâm. 1.2.3. Gen MT-Atp6 (Mitochondrially encoded ATP synthase 6) Gen Atp6 là gen thuộc nhóm gen giữ nhà. Gen giữ nhà “house-keeping gen” là gen mã hóa cho các protein giữ vai trò quan trọng duy trì chức năng của tế bào và bao gồm những gen có biểu hiện tương đối ở bất kỳ điều kiện nào[56]. Gen Atp6 mã hóa cho enzyme ATPase của ty thể tiểu phần số 6. ATPase là enzyme giúp ty thể thực hiện quá trình tạo năng lượng từ ADP chuyển đổi thành ATP với sự hiện diện của kênh gradient proton qua màng, được tạo ra bởi tổ hợp vận chuyển điện tử của chuỗi hô hấp, cung cấp năng lượng cho tế bào hoạt động[42][58]. Atp6 là tiểu đơn vị của phức hợp F1-F0 ATPase trong ty thể, được Trang 7 tìm thấy hầu hết ở sinh vật nhân chuẩn. F1 có chứa các lõi xúc tác trên màng và F0 nằm trong màng ty thể, có chứa các kênh proton màng, liên kết với nhau bởi một thân cây trung ương và một cuống ngoại vi[27]. Tiểu đơn vị này là một thành phần quan trọng của các kênh proton và đóng một vai trò trực tiếp trong việc di chuyển của proton qua màng. Do gen Atp6 có chức năng quan trọng trên và gen có kích thước nhỏ thuộc DNA ty thể nên được coi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen phục vụ nghiên cứu về phân loại. Điển hình gen Atp6 trong DNA ty thể của nấm men Saccharomyces cerevisiae có vị trí từ 28.487 bp đến 29.266 bp, chiều dài khoảng 779 bp[20]. Gần đây các nhà nghiên cứu nấm học như Spatafora et al., 2007, Sung et al., 2007 đã tiến hành sử dụng các gen mã hóa cho protein có vai trò quan trọng trong tế bào để bổ sung trong nghiên cứu phát sinh loài (Atp6, Rpb1, Rpb2, Tef1, Tub...)[43][44]. Hơn nữa, các nghiên cứu đều dựa vào DNA vì chúng có ưu điểm là cho nhiều thông tin hơn, trong khi acid amin có tính thoái hóa. Do DNA đột biến nhiều hơn nhờ đó giúp chỉ ra mối quan hệ gần gũi giữa các loài tốt hơn dựa vào các vùng biến động. Cụ thể, Zuckerkandl và Pauling nhận ra rằng trình tự chính của acid nucleic chứa một nhguồn thông tin phong phú về lịch sử tiến hóa[35]. Vì vậy, gen Atp6 giúp cải thiện được những hạn chế việc phân loại giữa chi và loài; cho thấy kiến thức về các mối quan hệ tiến hóa của các loài trong cùng họ Clavicipitaceae[43][44]. Một số nghiên cứu đã sử dụng gen Atp6 như: Atp6 dùng kiểm tra mối quan hệ phát sinh loài giữa 27 đơn vị phân loại từ Boletales và 4 nhóm đối chứng (outgroup); phát hiện loài nấm mới Stachybotrys chartarum dựa trên cây phát sinh loài đa gen; phân loại phát sinh loài của nấm Cordyceps và Clavicipitaceous[16][30][41]. 1.2.4. DNA ribosome và gen nrLSU (nuclear ribosomal large subunit) Trong nghiên cứu định danh về sinh học phân tử, nhóm nấm ký sinh côn trùng hay ở nhiều loài sinh vật khác thì việc lựa chọn trình tự DNA là vô cùng quan trọng. Đòi hỏi trình tự DNA có độ bảo tồn cao trong cùng một loài và biến động lớn giữa các loài khác nhau. Đặc biệt, trong định danh loài nấm ký sinh côn Trang 8 trùng thì vùng gen mã hóa cho RNA ribosome được sử dụng phổ biến. RNA ribosome là một trong hai thành phần chính của ribosome, được phiên mã từ DNA ribosome. Các gen RNA ribosome khuếch đại mồi phổ quát, có tính bảo tồn cao cho phép phân loại vượt mức độ loài[37]. Ribosome là một bộ máy phân tử lớn và phức tạp, có mặt trong tất cả tế bào sống. Đảm nhiệm chức năng sinh tổng hợp protein của tế bào. Ribosome gồm hai tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị gồm một hoặc nhiều phân tử RNA ribosome và nhiều phân tử protein[54]. Hai tiểu đơn vị này chỉ kết hợp với nhau tạo ra một ribosome hoạt động khi quá trình dịch mã trên mRNA bắt đầu. Ở sinh vật nhân sơ, tiểu phần nhỏ (30S) của ribosome chứa 16S RNA, tiểu phần lớn (50S) chứa 5S, 23S. Hai tiểu đơn vị nhỏ và lớn khi kết hợp với nhau sẽ tạo ra một rãnh ở chỗ tiếp giáp của chúng để cho mRNA đi qua[54]. Sinh vật nhân chuẩn, tiểu phần nhỏ (40S) của ribosome chứa 18S RNA, tiểu phần lớn (60S) chứa 28S, 5.8S và 5S[54]. Hình 1.2. Cấu trúc của rDNA[52] Trang 9 DNA ribosme là nhóm gen mã hóa cho rRNA ribosome. Đây là vùng gen bảo tồn cao nên được xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt của các sinh vật cùng loài hay khác loài, cung cấp nhiều thông tin và có nhiều bản sao nên đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến hóa, phát sinh loài[24]. Ngoài ra, dựa vào vùng bảo tồn của gen rRNA có thể thiết kế các cặp mồi phổ quát (universal primer) sử dụng khuếch đại trình tự của vùng gen rDNA từ nhiều loài trong định danh sinh học phân tử[24]. rDNA bao gồm nhiều đơn vị lặp lại, mỗi đơn vị lặp lại bao gồm vùng ITS (internal transcribed spacer), vùng 18S, 5.8S, 25-28S, 5S RNA và vùng IGS (intergenic spacer). Cụ thể, một đơn vị lặp lại bao gồm vùng theo thứ tự IGS218S (SSU)-ITS1-5.8S-28S (LSU)-IGS1-5S-IGS2. Giữa các đơn vị lặp lại của gen rDNA là một vùng không phiên mã (NTS)[24]. Trong đó, vùng 18S-28S là vùng phiên mã chính (Vilgalys, 2004), vùng 18S hình thành tiểu đơn vị nhỏ (SSU), vùng 28S, 5,8S và 5S hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosome RNA. Vùng 5,8S rRNA có cấu trúc và chức năng liên quan chặt chẽ với tiểu đơn vị lớn của rRNA và có nguồn gốc từ một phần của 23S ở sinh vật nhân sơ[24]. Vùng 5S rDNA thường không có vị trí cố định, chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm (Guarro, 1999). Các rDNA 5,8S; 18S; 28S nằm xen kẽ với các vùng phiên mã bên trong (ITS1 và ITS2) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS). Vùng ETS (external transcribed spacer) nằm ở đầu 5‟ của 18S và đầu 3‟ của 28S. Hơn nữa, vùng IGS bao gồm phần ETS (external transcribed spacer) và phần không phiên mã NTS (non-transcribed spacer). Vùng IGS (intergenic spacer) là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA[51]. Gen nrLSU mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome (25S-28S), có nhiều vùng bảo tồn và đa dạng. Ngoài ra, nrLSU-rRNA còn bao gồm những vùng domain D1, D2, D3, gọi là vùng phân kỳ (D-divergence region) được đánh số theo chiều 5‟ đến 3‟, chứa nhiều thông tin duy truyền, có độ bảo tồn cao và có thể khuếch đại với cặp mồi phổ quát do đó nó thích hợp cho nghiên cứu cấp độ loài thậm chí còn vượt qua cả mức độ loài[37][39][46]. Đồng thời, cấu trúc rDNA gồm nhiều Trang 10 đơn vị lặp lại nên số bản sao của gen nrLSU rất nhiều. Hơn nữa, nrLSU chứa các vùng bảo tồn, biến thiên có giá trị trong việc hỗ trợ định danh loài[39][43]. nrLSU-rRNA còn được coi như là một chỉ thị phân tử (marker) để phân loại và xác định tên loài tốt hơn về mặt duy truyền trong một phạm vi rộng[37][39][41]. Vùng D1/D2 mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome được coi là tiềm năng ứng dụng trong phân loại phần lớn các loài nấm kỵ khí[41]. Cặp mồi LR0R/LR5 là cặp mồi phổ quát được biết đến nhiều nhất và được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử định danh loài nấm ký sinh côn trùng và các loài sinh vật khác trong những năm gần đây[44]. Cặp mồi này được thiết kế để khuếch đại vùng D1/D2 và cho kết quả khuếch đại khoảng 800 - 1300 bp (Sonnenberg et al., 2007). Gen nrLSU đã ứng dụng thành công trong nghiên cứu định danh ở loài nấm ký sinh côn trùng hay các loài nấm khác như: sử dụng vùng D1/D2 của tiểu đơn vị lớn nrLSU (28S) vùng rDNA trong phân loại ở cấp độ loài khác biệt trong Orpinomyces spp.[41]… Hình 1.3. Vị trí các mồi khuếch đại vùng gen nrLSU (tự vẽ)[57]. 1.3. TÁCH CHIẾT DNA VÀ KỸ THUẬT PCR 1.3.1. Tách chiết DNA DNA chứa thông tin di truyền, các nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận các acid nucleic tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Tùy thuộc vào loại DNA mà các nhà nghiên cứu lựa chọn các phương pháp tách chiết khác nhau. Hơn nữa, mỗi quy trình tách chiết DNA phải theo nguyên tắc[17]: Trang 11
- Xem thêm -