Tài liệu Hệ thống chính trị và hệ thống chính trị cơ sở

  • Số trang: 77 |
  • Loại file: DOC |
  • Lượt xem: 91 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Đã đăng 39801 tài liệu

Mô tả:

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SỐNG ĐỜI (KALANCHOE PINNATA) LÊN QUÁ TRÌNH TĂNG SINH TẾ BÀO CÓ NGUỒN GỐC TỪ DA CHUỘT NHẮT TRẮNG (MUS MUSCULLUS VAR.ALBINO) SƠ CẤP Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện Ths. LẠI ĐÌNH BIÊN NGÔ QUỐC NGUYÊN ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SỐNG ĐỜI (KALANCHOE PINNATA) LÊN QUÁ TRÌNH TĂNG SINH TẾ BÀO CÓ NGUỒN GỐC TỪ DA CHUỘT NHẮT TRẮNG (MUS MUSCULLUS VAR.ALBINO) SƠ CẤP Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện Ths. LẠI ĐÌNH BIÊN NGÔ QUỐC NGUYÊN Mã số SV: 2008100005 ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN Mã số SV: 2008100084 Lớp: 01ĐHSH1 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014 NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ TP. HCM,tháng 6 năm 2014 Ký tên LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành khóa luận này, nhóm chúng tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị cùng các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, chúng tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: Thạc sĩ – Lại Đình Biên, người Thầy kính mến đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho nhóm chúng tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Tập thể các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học và Kĩ thuật môi trường, đã trang bị cho chúng tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý giá trong quá trình học tập tại trường và nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi thực hiện đề tài này. Tập thể các bạn sinh viên khóa 01ĐHSH đã luôn giúp đỡ và động viên chúng tôi mỗi khi chúng tôi gặp khó khăn trong quá trình làm việc. Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng do thời gian có hạn, trình độ, kỹ năng của bản thân còn nhiều hạn chế nên chắc chắn đề tài khóa luận tốt nghiệp này của chúng tôi không tránh khỏi những hạn chế, thiếu sót, rất mong được sự đóng góp, chỉ bảo, bổ sung thêm của thầy cô và các bạn. LỜI CAM ĐOAN Chúng tôi cam đoan rằng khóa luận tốt nghiệp này là do chính chúng tôi thực hiện. Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong báo cáo là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Tháng 6 năm 2014 Sinh viên thực hiện NGÔ QUỐC NGUYÊN ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN MỤC LỤC Trang bìa lót Nhận xét của giáo viên hướng dẫn Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục các bảng biểu và sơ đồ Danh mục các hình ảnh và biểu đồ PHẦN MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề...................................................................................................................2 Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................... 2 PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................. 3 1.1 Đại cương về mô da động vật............................................................................... 4 1.1.1 Các loại tế bào của mô da.............................................................................. 4 1.1.2 Cấu trúc mô da................................................................................................5 1.2.1 Lịch sử nuôi cấy tế bào...................................................................................8 1.2.2 Đặc điểm của tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào........9 1.2.3 Các phương pháp tách tế bào từ mô sống......................................................11 1.2.4 Enzyme sử dụng trong tách tế bào................................................................12 1.2.5 K ỹ thuật nuôi cấ y tế bào động vật...............................................................14 1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào.....................................18 1.2.7 Tỉ lệ môi trường với mật độ tế bào đem nuôi, lượng mô đem cấy................22 1.2.8 Môi trường nuôi cấy......................................................................................22 1.2.9 Ðánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy...............................................................24 1.3 Đại cương về nguyên bào sợi..............................................................................25 1.3.1 Nguồn gốc.....................................................................................................25 1.3.2 Đặc điểm của nguyên bào sợi.......................................................................25 1.3.3 Chức năng của nguyên bào sợi......................................................................26 1.3.4 Sơ lược về kinh nghiệm nuôi cấy nguyên bào sợi trên thế giới.....................26 1.3.5 Nguyên bào sợi trong các nghiên cứu và ứng dụng.......................................29 1.4 Sơ lược về cây sống đời (Kalachoe pinata).........................................................30 1.4.1 Nguồn gốc, phân bố và danh pháp cây sống đời...........................................30 1.4.2 Đặc điểm hình thái........................................................................................31 1.4.3 Công dụng của cây sống đời.........................................................................32 1.4.4 Thành phần hóa học trong cây sống đời........................................................33 PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................34 2.1 Vật liệu................................................................................................................35 2.1.1. Dụng cụ - thiết bị.........................................................................................35 2.1.2 Hóa chât .......................................................................................................35 2.2 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................36 2.2.1. Phương pháp thu nhận dịch chiết cây sống đời ...........................................36 2.2.2. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nguyên bào sợi chuột từ da chuột ........38 2.2.3. Xử lý số liệu ................................................................................................43 PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................44 3.1 Thu nhận dịch chiết từ lá cây sống đời ...............................................................45 3.2 Khảo sát khả năng tách tế bào bằng phương pháp trypsin ấm và trypsin lạnh.....45 3.2.1 Trypsin ấm ...................................................................................................46 3.2.2 Trypsin lạnh .................................................................................................47 3.3.1 Quá trình tăng sinh và bám của tế bào nguyên bào sợi chuột trong môi trường D’MEM 5% huyết thanh thỏ..................................................................................50 3.3.2 Quá trình tăng sinh của tế bào nguyên bào sợi chuột trong môi trường D’MEM 5% huyết thanh thỏ có bổ sung dịch chiết từ lá cây sống đời..................52 3.4. Khảo sát nồng độ dịch chiết tối ưu khi bổ sung dịch chiết lá cây sống đời vào môi trường nuôi cấy..................................................................................................54 PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................58 4.1 Kết luận ..............................................................................................................59 4.2 Kiến nghị ............................................................................................................59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................60 PHỤ LỤC .................................................................................................................... 61 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ Bảng 1.4.3.1: Công dụng chữa bệnh của cây sống đời.............................................32 Bảng 1.4.4: Thành phần hóa học trong cây sống đời...............................................33 Bảng 2.2.2.4: Thí nghiệm khảo sát nồng độ trypsin và phương pháp phù hợp để tách tế bào đơn..................................................................................................................... 40 Bảng 3.2.1.1: Tổng mật độ tế bào đơn khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau ................................................................................................................................ 46 Bảng 3.2.1.2: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau ................................................................................................................................. 46 Bảng 3.2.2.1: Tổng mật độ tế bào đơn khi ủ với trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau ................................................................................................................................. 47 Bảng 3.2.2.2: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau ................................................................................................................................. 47 Bảng 3.2.2.3: Xác định phương pháp phù hợp để tách tế bào đơn...........................49 Sơ đồ 1.2.5: Quy trình nuôi cấy sơ cấp....................................................................16 Sơ đồ 2.2.1: Quy trình thu dịch chiết từ lá cây sống đời..........................................37 Sơ đồ 2.2.2: Quy trình phân lập và nuôi cấy nguyên bào sợi từ da chuột.................43 DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1.1: Cấu tạo da................................................................................................5 Hình 1.1.2.1: Cấu trúc lớp biểu bì..............................................................................6 Hình 1.1.2.2: Mô liên kết trung bì..............................................................................7 Hình 1.2.4.1: Cấu trúc không gian của enzyme trypsin............................................13 Hình 1.3.2: Cấu trúc nguyên bào sợi........................................................................25 Hình 1.4.1: Cây sống đời.........................................................................................31 Hình 2.2.2.4: Buồng đếm hồng cầu loại 25 ô lớn.....................................................41 Hình 3.1: Dịch chiết lá sống đời tươi.......................................................................45 Hình 3.2: Tế bào được nhuộm trypan blue...............................................................46 Hình 3.3.1.1: Tế bào nuôi ngày thứ nhất..................................................................50 Hình 3.3.1.2: Tế bào nuôi ngày thứ ba.....................................................................50 Hình 3.3.1.3: Tế bào nuôi ngày thứ năm..................................................................51 Hình 3.3.1.4: Tế bào nuôi ngày thứ bảy...................................................................51 Hình 3.3.1.5: Tế bào nuôi ngày thứ tám...................................................................52 Hình 3.3.2.1: Tế bào nuôi ngày thứ nhất..................................................................52 Hình 3.3.2.2: Tế bào nuôi ngày thứ ba.....................................................................53 Hình 3.3.2.3: Tế bào nuôi ngày thứ tư......................................................................53 Hình 3.3.2.4: Tế bào nuôi ngày thứ năm..................................................................54 Hình 3.4.1: Tế bào nuôi ở nồng độ dịch chiết 10μl..................................................55 Hình 3.4.2: Tế bào nuôi ở nồng độ dịch chiết 20μl..................................................55 Hình 3.4.3: Tế bào nuôi ở nồng độ dịch chiết 30μl..................................................56 Hình 3.4.4: Tế bào nuôi ở nồng độ dịch chiết 60μl..................................................56 Đồ thị 3.2.1: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau ................................................................................................................................. 47 Đồ thị 3.2.2.1: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau ................................................................................................................................. 48 Đồ thị 3.2.2.2: So sánh mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm và trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau.............................................................................................49 PHẦN MỞ ĐẦU 1  Đặt vấn đề Với quan niệm “ nhất dáng nhì da” thì da xếp thứ hai để quan sát và đánh giá vẻ đẹp của một con người. Hiện nay do kinh tế xã hội phát triển nên nhu cầu thẩm mỹ về da ngày càng phát triển, đặc biệt nhu cầu thẩm mỹ trong điều trị bỏng. Chính vì những lý do đó các nhiều nghiên cứu về trị bỏng tức thời và lâu dài bằng cách tạo vật liệu sinh học trị bỏng hay da nhân tạo để ghép tự thân. Hiện nay, những vật liệu sinh học có bổ sung hoạt chất tự nhiên để trị bỏng với những ưu điểm như kháng viêm, kháng khuẩn, tính sinh miễn dịch thấp… trong việc tạo da nhân tạo bằng nuôi cấy tế bào da để ghép tự thân đang là tiêu chuẩn vàng để tạo vết da đẹp và liền không có vết sẹo. Trên thế giới, công nghệ này liên tục được nghiên cứu hoàn chỉnh về quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào. Nhiều nước đã đạt những tiến bộ vượt bậc trong điều trị bỏng và tổn thương mất da, nhiều nạn nhân bỏng sâu và rộng trên 70% diện tích đã được cứu sống cũng như giảm thiểu các di chứng nặng do mất da để lại. Tại Việt Nam là một nước rừng nhiệt đới nên có rất nhiều loại cây cỏ và hoạt chất ứng dụng trong trị bỏng. Hiện nay các nghiên cứu về sử dụng hoạt chất thiên nhiên ứng dụng trong trị bỏng ngày càng nhiều dựa theo các phương pháp dân gian thì các cây có ứng dụng trị bỏng giúp trị lành vết thương như dầu mù u, củ nghệ, mỡ trăn cây sống đời…. Trong các loại cây, thì chỉ có vài cây được khoa học nghiên cứu và khẳng định tính năng trị bỏng như dầu mù ứng dụng trong việc tạo màng sinh học trong trị bỏng , cucurmine trong củ nghệ ứng dụng trong mỹ phẩm có chức năng trị lành vêt thương. Tuy nhiên, cây sống đời một loại cây cũng được dân gian sử dụng nhiều trong trị bỏng lại chưa có đề tài và sự nghiên cứu về công dụng trị bỏng của nó chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài : “Khảo sát sự ảnh hưởng của dịch chiết từ lá cây sống đời (Kalanchoe pinnata) lên quá trình tăng sinh tế bào nguyên bào sợi da chuột nhắt trắng (Mus muscullus var.albino)” . Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát khả năng tách của tế bào bằng hai phương pháp trypsin ấm và trypsin lạnh. Khảo sát khả năng bám và tăng sinh của tế bào sau thời gian nuôi cấy trong môi trường có bổ sung dịch chiết. 2 Xác định nồng độ dịch chiết tối ưu cho khả năng bám dính của tế bào nguyên bào sợi chuột trong giai đoạn nuôi sơ cấp. Từ những yếu tố trên chúng tôi sẽ xây dựng được quy trình phân lập, và nuôi cấy tế bào nguyên bào sợi da có bổ sung dịch chiết cây sống đời trong môi trường nuôi cấy. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Đại cương về mô da động vật [3] Da là mô lát tầng, là một loại mô liên kết biểu bì. Cấu trúc của da có một điểm đặc biệt là chúng có nhiều lớp tế bào, trong đó các lớp ngoài luôn bị thoái hóa, bong ra và thay thế bằng các lớp tế bào bên dưới. Nguồn gốc của sự thay mới thường xuyên này là do một lớp tế bào của da ở vị trí tiếp giáp với mô liên kết có khả năng thường xuyên tạo tế bào mới. Đây chính là tế bào mầm của cơ thể trưởng thành, có khả năng tạo thành những dòng tế bào ổn định phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng. Chính vì vậy, da có tiềm năng lớn trong công nghệ tế bào. 1.1.1 Các loại tế bào của mô da 1.1.1.1 Keratinocyte Tế bào keratin (keratinocyte) thường thấy ở lớp biểu bì – lớp ngoài cùng của da. Keratinocyte chiếm đa số trong biểu bì. Các keratinocyte trưởng thành khi nó di chuyển từ tầng dưới lên để hình thành tầng mới bên trên. Keratinocyte xây dựng một khung tế bào rất vững chắc nhờ thay đổi sự biểu hiện của các loại vi sợi keratin từ keratin 5 và 14 thành keratin 1 và 10. Keratinocyte có khả năng sản xuất ra protein có vỏ keratin như involucrin và loricrin cho việc chuẩn bị hình thành tế bào sừng (corneocyte). Keratin do keratinocyte tạo ra luôn có xu hướng tích lũy theo hướng lên trên, do đó các tế bào ở phía trên của lớp biểu bì thường tích lũy nhiều keratin và tạo thành tầng sừng. Sự tích lũy chất keratin trong các tế bào của lớp biểu bì tạo nên sự sừng hóa tế bào. 1.1.1.2 Fibroblast (nguyên bào sợi) Fibroblast là những tế bào có khả năng tạo sợi. Fibroblast thường thấy ở lớp da chính thức. 1.1.1.3 Melanocyte (hắc tố bào) Melanocyte là loại tế bào có trong mô biểu bì với mật độ khá ít, thường tập trung ở tầng sinh sản. Melanocyte tạo màu cho da, lông, tóc nhờ tạo ra các hạt sắc tố melanin và ngấm vào keratin. 1.1.1.4 Tế bào Langerhans Tế bào Langerhans là những đại thực bào (macrophage) có hình sao, có vai trò trong miễn dịch. 1.1.1.5 Tế bào Merkel Tế bào Merkel là những tế bào ít phân bố trong mô biểu bì, chúng tập trung chủ yếu ở lớp da chính thức. Tế bào Merkel là loại tế bào thần kinh làm nhiệm vụ thụ quan cảm giác, có khả năng trả lời các kích thích nhiệt độ, áp suất, xúc giác… 1.1.2 Cấu trúc mô da [3] Da do mô liên kết và biểu mô tạo nên, có cấu tạo nhiều lớp: 4 Hình 1.1.2 Cấu tạo da 1.1.2.1 Lớp biểu bì Lớp ngoài cùng của da, gồm nhiều lớp tế bào mô xếp dính chặt với nhau, dày từ 0,07 đến 1,8mm. Lớp biểu bì gồm 5 lớp tế bào: lớp mầm, lớp gai, lớp hạt, lớp bóng và lớp tế bào sừng. Lớp mầm (stratum germinatum) Lớp mầm được tạo thành bởi một hàng tế bào khối vuông và trụ có khả năng phân chia liên tục, sản sinh ra các tế bào cho lớp biểu bì. Gồm các loại tế bào: tế bào sừng, tế bào hắc sắc tố, tế bào Langerhans và tế bào Merkel. Lớp gai (stratum spinosum hoặc filamentosum) Gồm các tế bào có hình khối đa điện, nhân tròn, nằm trên lớp đáy, có 7 – 15 tầng tế bào. Những kẽ trống giữa các tế bào này chứa dịch nuôi được tạo ra từ lớp nhú của trung bì để trao đổi dinh dưỡng với tế bào biểu bì. Các khe trống này bảo đảm cho sự chuyển hóa, tăng trưởng và biệt hóa của các tế bào sừng. Các đầu tận cùng của dây thần kinh nhận cảm giác đau cũng nằm rải rác trong các khe này. Lớp hạt (stratum granulosum) Gồm những tế bào dẹt có nhân chứa các chất sừng trong suốt. Các tế bào này không chỉ tổng hợp, biến hóa và nối tiếp chéo các protein mới trong quá trình sừng hóa mà còn làm nhiện vụ tự hủy theo chương trình để biến từ tế bào hạt thành tế bào sừng. Lớp bóng (stratum lucidum) Là lớp tế bào trong suốt, được hình thành tạo nên từ lớp đáy, các lớp tế bào già được đẩy dần ra khỏi môi trường nuôi dưỡng và sự biệt hóa cũng hoàn thành. Lớp 5 bóng nằm ngay dưới lớp tế bào sừng, có chức năng giữ cho da không bị mất nước và bảo vệ lớp tế bào phía dưới đối với các tác động cơ học. Lớp sừng (stratum corneum) Là lớp ngoài cùng có 15 – 20 tầng tế bào, có hình khối dẹt rộng, hoặc hình đa điện. Các tế bào này đã mất khả năng sống, hoàn toàn sừng hóa. Chúng dính chặt vào lớp tế bào trong suốt tạo thành một lớp bảo vệ ngoài cùng của da. Hình 1.1.2.1 Cấu trúc lớp biểu bì 1.1.2.2 Lớp trung bì (dermis) Trung bì nằm dưới lớp biểu bì, dày từ 0,7 – 7mm, dày hơn chiều dày của biểu bì từ 15 – 40 lần. Trung bì là một lớp xơ rất chắc, được tạo nên từ các chất nền (chất gian bào), các tế bào liên kết, bó sợi liên kết, sợi đàn hồi, các tuyến ống, cơ dựng nang lông, mạch máu và dây thần kinh. Nguyên bào sợi được coi là tế bào chủ của trung bì, chúng sản sinh ra chất keo mạng lưới (reticular collagen), các sợi đàn hồi và các chất nền của trung bì. Trung bì gồm hai lớp: lớp nhú và lớp lưới. Lớp nhú Là một lớp tế bào mỏng, nằm sát ngay dưới màng nền và lớp tế bào mầm của lớp đáy hình thành nhiều gai nhú gồ lên hình làn sóng. Lớp nhú có các sợi tơ tạo keo, sợi tơ đàn hồi, chất keo đặc giữa các sợi tơ và các tế bào liên kết, bạch cầu, tế bào Langerhans… Lớp nhú là nơi trao đổi các yếu tố tăng trưởng, cytokine và các chất cơ bản của trung bì gắn kết với các tế bào biểu bì qua thụ cảm xuyên màng. Lớp lưới (reticular dermis) Có chiều dày 4 – 5mm, có ít tế bào và mạch hơn lớp nhú. Lớp lưới chứa các bó sợi liên kết gồm các sợi tạo keo, sợi đàn hồi, các sợi bắt màu bạc. Lớp lưới chia làm hai 6 vùng: vùng trên (nông) có nhiều tế bào liên kết, nguyên bào sợi, tế bào viêm, các bó keo, các sợi chun dãn xếp theo hướng ngang và vùng dưới (sâu). Chức năng của lớp lưới là làm nền cho da bền chắc. Hình 1.1.2.2 Mô liên kết trung bì 1.1.2.3 Lớp hạ bì (hypodermis, subcutis) Là một lớp mô liên kết – mỡ, dày 0,25mm đến vài cm. Hạ bì gồm 3 lớp: lớp mỡ, lớp chân nông và lớp tế bào dưới da. - Lớp mỡ: các bó xơ dày to hình nón quây thành những khoang chứa các tế bào mỡ. Chúng góp phần tạo hình, dự trữ năng lượng và cách nhiệt. - Lớp chân nông: có chỗ dày tới 1mm. - Lớp tế bào dưới da: là mô liên kết lỏng lẻo, làm cho da dễ dàng di động trên cơ, gân, xương. Các tổ chức tế bào lỏng lẻo này có khả năng thấm nước và các chất hòa tan của dịch. 1.2 Sơ lược về nuôi cấy tế bào 1.2.1 Lịch sử nuôi cấy tế bào [7, 10, 21] Năm 1883, người ta có thể duy trì được các tế bào phôi gà trong dung dịch nước muối. Năm 1709, Harrison đã tách tế bào thần kinh ếch và nuôi trong môi trường bạch huyết. Sau vài tuần nuôi cấy, ông thấy có sự xuất hiện và tăng trưởng những tế bào này trên mẫu cấy. Năm 1910, Roux tiếp tục nghiên cứu trên những tế bào ung thư ở gà. Năm 1913, Carrel và công sự đã làm nhiều thí nghiệm chứng minh được tế bào động vật hoàn toàn có thể sống được một khoảng thời gian dài trong điều kiện in vitro, nếu thường xuyên cung cấp các chất dinh dưỡng vô trùng cần thiết. Đến năm 1923, ông 7 thiết kế ra hộp chuyên sử dụng để nuôi cấy mô động vật trong điều kiện vô trùng gọi là hộp Carrel. Năm 1948, Earle đã tiến hành phân lập các tế bào và nuôi cấy chúng trong điều kiện môi trường đặc biệt. Năm 1952, Grey đã tách và nuôi thành công tế bào ung thư cổ tử cung người (HeLa). Đây là một trong những dòng tế bào tốt nhất được tạo ra đầu tiên trên thế giới từ khối u cổ tử cung của một phụ nữ 31 tuổi tên Henrietta Lacks. Năm 1954, Levi – Moutalcini đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng lên khả năng phát triển của tế bào trong nuôi cấy in vitro. Năm 1955, Eagle và năm 1965, Ham đã tìm được môi trường và quy trình nuôi cấy thích hợp cho nhiều loại mô khác nhau của người và động vật. Năm 1961, I.A.Macpherson và M.G.P. Stoker tạo được dòng nguyên bào sợi thận chuột đồng con (BHK-21). Dòng tế bào được sử dụng rộng rãi là dòng 13 từ thận của 5 con chuột một ngày tuổi chưa xác định giới tính, những chú chuột đồng này thuộc loài Mesocriteus auratus. Công việc nuôi cấy tiến hành liên tục trong 84 ngày và dòng 13 được phân lập từ tế bào đơn. Năm 1962, George Todaro và Howard Green đã tạo được dòng nguyên bào sợi phôi chuột (3T3) từ mô phôi của chuột Mus. musculus. Dòng tế bào này được ứng dụng trong nghiên cứu các protein cơ bản của sợi myelin. Năm 1964, J. Ponten và E. Saksela đã tạo ra dòng tế bào ung thư xương người (U-2 OS), có nguồn gốc từ dòng 2T được phân lập từ mô xương của một bé gái 15 tuổi bị bệnh về xương. Năm 1966, J.P. Jacobs tạo ra dòng nguyên bào sợi phổi bào thai người (MRC-5) từ khối u mô phổi thai nhi 14 tuần tuổi. Dòng tế bào này được sử dụng trong việc phát triển vaccine, trong chuyển nhiễm tế bào chủ để nghiên cứu virus và kiểm tra cytotoxic in vitro. Năm 1972, D.J. Giard và cộng sự đã tạo được dòng tế bào ung thư biểu mô phổi người (A-549) từ khối u của biểu mô phổi ở một nam giới người Caucasian 58 tuổi. Dòng tế bào này được dùng để nghiên cứu về những bệnh có liên quan đến hệ hô hấp. Từ năm 1970 – 1980, sản xuất được kháng thể lai đơn dòng. Từ năm 1987 – 1995, kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã tạo ra nhiều loại sản phẩm sinh học từ các tế bào biến đổi di truyền. Sự phát triển của nuôi cấy mô như là một kĩ thuật tinh vi hiện đại nhờ vào sự cần thiết của hai nhánh chính nghiên cứu về y học: tạo vaccine kháng virus và nghiên cứu về ung thư. Sự tiêu chuẩn hóa các điều kiện và các dòng tế bào để sản xuất và thí nghiệm virus rõ ràng đã thúc đẩy sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô hiện đại, cụ thể là tạo ra một lượng lớn tế bào phù hợp cho các phân tích sinh hóa. Cùng với sự phát 8 triển của những kỹ thuật khác đã tạo nên những sản phẩm môi trường và huyết thanh đáng tin cậy được thương mại hóa, và kiểm soát tốt hơn về ngoại nhiễm với các kháng sinh và thiết bị làm sạch không khí, làm nuôi cấy mô có thể được quan tâm rộng rãi. 1.2.2 Đặc điểm của tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào 1.2.2.1 Sự điều hòa trao đổi chất [11] Quá trình trao đổi chất của cơ thể được tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào. Sự chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại của cơ thể sống. Ở vi sinh vật, quá trình trao đổi chất là quá trình xảy ra giữa tế bào và môi trường sống. Do đó, ngoài các yếu tố ảnh hưởng từ bên ngoài (nhiệt độ, pH, nồng độ các chất dinh dưỡng, các chất độc…), tế bào còn phụ thuộc rất nhiều vào các hoạt động của enzyme. Ở tế bào thực vật, ngoài tác động của enzyme, quá trình trao đổi chất còn chịu tác động rất mạnh bởi hệ dịch bao quanh tế bào. Ở tế bào động vật, ngoài tác động của enzyme, hệ dịch quanh tế bào như ở thực vật, chúng còn bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình trao đổi chất ở tế bào. Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh. Do đó, việc điều khiển trao đổi chất của tế bào động vật trong cơ thể sống trở nên hết sức phức tạp. Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dưỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác quá trình dinh dưỡng tế bào trong cơ thể. Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập, không tuân theo quy luật của mô và của cơ thể đa bào. Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt động của enzyme, đây cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những sản phẩm trao đổi chất của tế bào, cũng như khả năng phân chia tế bào. Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hưởng quyết định đến kết quả: - Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào. - Những yếu tố môi trường quyết định đặc trưng riêng biệt của tế bào. Sự hiểu biết nguồn gốc của tế bào giúp ta định hướng sản phẩm cuối, còn sự hiểu biết về đặc trưng riêng biệt giúp ta điều chỉnh (hay điều khiển) để tính trạng đó được biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy. Trong nuôi cấy tế bào in vitro có những yếu tố hoàn toàn khác với sự phát triển của chính tế bào đó trong cơ thể. Mọi yếu tố tác động lên tế bào nuôi cấy in vitro là những tác động trực tiếp. Còn khi phát triển trong cơ thể, các tế bào này không chỉ chịu tác 9
- Xem thêm -