Tài liệu Góp phần nghiên cứu một loài Rauvolfia ở Việt Nam

BỘ \ T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ơ c HÀ NỘI GÓP PHÂN NGHIÊN cứu MỘT LOÀI RAUV OLFIA Ở VIỆT NAM KHOÁ LUẬN T Ố T N G H IỆ P Dược s ĩ ĐẠI H ỌC Khoá 1995-2000 Ngưòi thực hiện Nguôi hướng dẫn Noi thực hiện Thòi gian thực kiện : sv. Nguỵễn Ngọc Sơn : TSKH T rần Văn -Thanh PGS. TS. Nguyễn Kim c ấ n : Hộ môn Dược liệu : 0l/()3-23/()5/2()0() I HÀ NỘĨ, 5-2000 \\ ' 9 tri'i' ^ \ Ar ,\ "\.;X 7-;u- ' *ì / , MỤC LỤC Mục lụ c ............................................................................................................................. 1 Phần I- Đặt vấn đề....................................................................................................2 phần n-T ổng quan tài iiệu..................................................................................... 3 I. Đặc điểm thực vật chi RAU VOLPIA.................................................................3 n. Hoá học Alkaloid R auvolíia...............................................................................4 1. Định tính Alkaloid Raưsioỉỹìa..........................................................................4 2. Định lượng.......................................................................................................... 6 m . Tác dụng dược lý và sử dụng trong y h ọc....................................................... 8 1. Ạịm alỉn................................................................................................................ 8 2. Reserpin............................................................................................................... 9 3. Aịm aỉicin.............................................................................................................9 rv. Sơ lược về Rau volíia vomitoria Afz ........................................................... 9 ỉ . Đặc điểm thực vật..............................................................................................9 2. Nghiên cứu vềR. vomitoria trong và ngoài nư ớc.................................. 10 Phần III-thực nghiệm............................................................................................13 I- Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu:.......................................................13 1. Nguyên liệu :..................................................................... ............................13 2.Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 14 3. Sai s ố của sự xác định.......... ........... .................................................16 n. Thực nghiệm và kết quả.....................................................................................17 AI Nghiên cứu hình thái thực vật của cây ......................................................17 1. Đ ặc điểm hình thái thực vật:........................................................................ 17 2. Vi phẫu:.............................................................................................................18 3. Đ ặc điểm hột lá, thân, rễ cây Raưvolỷia vom itoria................................ 23 BI Nghiên cứu hoá học R auvol/ia vom itoria.................................................24 1. Định tính Alkaloid RaưVolfìa vom itoria ................................................... 24 2. Định lượng Alkaloid....................................................................................... 29 3. Hydro hoá Serpentin làm giàu Ajm alicin.................................................. 31 4. Phân lập Reserpin và Aịmalin trong vỏ rễ R. vom itoria........................ 32 Phần IY: Kết luận và đề x u ấ t.............................................................................36 Tài liệu tham khảo................................................................................................. 37 PHAN I- ĐẠT VẨN ĐE Các bệnh tim mạch và cao huyết áp ỉà những bệnh rất nsiuv hiếm . ánh hirớne nhiều đến sức khỏe tính mạnu con nairời. Nsày nav nụuv cơ mác các bệnh đó có chiều hướnơ aia tănơ (theo thốnơ kê trên 40% nsười cao tuổi măc các bệnh nàv ở các nước phát triển, ở các nước côim nahiệp có l5-206r só người lớn mắc bệnh huyết áp cao. ỏ' Việt Nam 6-12c/c và sỏ nụười mắc bệnh trẽn dưới 5-6 triệu). [8]. [12] Nhu cáu về thuốc chữa bệnh cao huvết áp ngày càng tăng. Tnrớc đây các cây thuốc thườtts đế chữa bệnh cao huvết áp la: • Cây hoè Sophora Japonia Linn. họ Fabaceae. • Cây dừa cạn Catharanthus roseus L. họ Apocynaceae. • Cây ba gạc có hai loài thường dùng là: - Rauvolfia verticillata họ Apocynaceae - Rau Yolfia seipentina họ Apocvnaceae Tuv nhiên nsuồn nguvên liệu từ các cây trên không đưọc dổi dào, cho đen nay hầu như nước ta chưa sản xuất được thuốc chữa cao huyết áp và ' im mạch, chủ yếu vẫn phải nhập từ nước ngoài. Do đó việc nah ẻn cứu nguồn nguyên liệu khác để thay thế các nguồn nguvên liệu trên, đáp ứng nhu cầu sản xuất thuốc chữa bệnh là cần thiết. Mấy nám qua chúna tôi đã nahiên cứu thãm dò cày Rauyolíia vomitoria Afz. Apocvnaceae là một câv có hàm lượng Aỉkaloiđ khá cao. đặc biệt là Reserprn. Ajmalin. Ajmalicin, câv lại có thể phát triển trồng lớn băng, cách nhân giống hĩru tính, cây sinh trưởng và phát triển tốt, phù họp với khí hậu nhiệt đới nước ta [5]. Do vậy chúng tôi tiến hành đề tài "Góp phần nshiên cứii câv RauVolfia vomitoria Afz. ở Việt nam" với nội dung: 1. Nghiên cứu hình thái giải phẫu, thành phần hoá học cây R. vomitoria. 2. Bước đẩu nghiên cứií làm giàu Aịmaỉiciĩì trong Aỉkaỉoid toàn phẩn. 0 PHẦN ĨI-T ổN G QƯAiN TÀI LIỆU I. ĐẶC Đ IỂM THỰC VẬT C H I R A I V O LFIA Chi Rauvolíia là một chi lớn, chiếm vị trí quan trọns trons họ trúc đào (Apocvnaceae). phân bô rộna rãi trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (nhất là vùim Đỏnsỉ và Nam phi). Theo tài liệu [_2?i] chi Rauvoltìa có khoáns 200 loài, tronc đó dã nshiên cứu xác định được 123 loài, chia thành 13 lớp. 0 Việt nam chi Rauvolfia cổ 11 loài, đa sô mọc hoanơ, một sô đã được di thực từ các nước [7] 1. Rauvolfia verticillata (Lour) Bail - Ba gạc Việt Nam: chủ yếu mọc hoana ó' các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Giang, Thanh Hoá. 2. R auvolíia littoralis Pierre ex Pitard hay R. indochinensis Pichon mọc hoans; ỏ' Phú Quốc, An Giang, Khánh Hoà. 3. Rauvolíia cambod ana Pierre (Ba gạc lá to - Ba gạc Nghĩa Bình) có 0' Đồng Nai, Lâm Đồnu, Nghĩa Bình. 4. Rauvolíia chaudocensis có ở Phú Quốc, Khánh Hoà. 5. Rau volíia vietnamensis: mọc hoang ở vìins: Khánh Hoà. 6. Rau volíia latiíronsa: mọc hoang ở phía Bắc giáp Trung Quốc. 7. R auvolíia ynnanensis ỏ' phía bắc giáp Trung Quốc (tỉnh Sơn La, trong rừng ở độ cao 900-1300 m gọi là ba gac Vân Nam). 8. Rauvolfia tetraphvlla. L. (Ba sạc Cư ba R. canescens) 2ỐC ó' Truns MT.ta nhập giốna tù' Liên xô cũ và Cuba, có nhiều ở Ba vì. 9. Rauvolíia seipentina Benth. (Ba gạc Ấn Độ) di thực vào Việt Nam. mới phát hiện mọc hoans ở Đắc Lắc, Kontum [14]. 10.RauVolfia caffra Sonder. phân bố chú vếu ở Đông và Nam phi. ta nháp vào năm 198 1 hiện có tại trung tâm trổRS và chế biến câv thuốc Hà Nội. ò I LRauVolTia vomitoria Afz. (Ba sạc 4 lá - Ba aạc Vĩnh Phú) Có nạuón aỗc Châu Phi. năm 1965 viện dược liệu phát hiện tại VTnh Phú. tiên nõrn 1974 đã xác định rèn khoa học là R.vomitoria Afz. họ Apocynaceae. II. HOÁ HỌC ALKALOID RAL VOLFIA Từ năm 1703 đã có những nshiẽn cứu hoá học của hơn 100 loài trên thế ụiứi [29] và phát hiện được hàns trăm Alkaloid Alkaloid Rauvolfia chia làm 5 nhóm [29] • Alkaloid nhân Indol: Reserpin, R-escinnanmin. Serpentin Altstonin. Sarpagin tập trung nhiều ở R.canescen, R.veiticillata. R.Serpentina, R.vomitoria, R.tetraphila, R.caffra. • Alkaloid nhân Indolin: Ajmalin chủ yếu ở R.vomitoria. R.canescens. R.caffra. • Alkaloid oc indocil: isoreserpilin a-indocil. • Alkaloid indolenin: perakin có ở R.caffra, R.vomitoria. • Alkaloid oxi indol. Ngoài ra còn có một số Alkaloid mới phát hiện không thuộc một tronc; năm nhóm trên như Raucaffricil. Raucaffrilin. Raucaffridin. Trons đó quan trọnẹ hơn câ phải kê đến: 1931-1935 Siddiqui đã phân lập được một số Alkaloid tinh khiết là: Ajmalin, Ajmaỉicin, Serpentin và Serpentinin [29] 1951-1952 Muller, Schlittler và Bein [20] đã phân ỉập được từ rễ câv chất Reserpin có tác dụn2 hạ huyết áp. 1. Định tính Alkaloid Raux/olfìa 1.1 Định tính bằng thuốc thử chung của Alkaloid Chủ yếu là định tính sơ bộ sự có mặt Alkaloid có trong cây 4 1.1.1 Nhóm thuòc thử tạo tua [9J Một sò thuốc thử thường dùns ỉà: Thuòc thử N-Iaver : Cho rua trán SI hav và ne nhat với alkaioid Thnỏc thư Boucharđut xho tua nâu vứi alkalt)id. - Thuôc thử DrauendortT : Cho túa vàng cam đên đỏ với alkaloiđ . 1.1.2 Nhóm các thuôc thử tao màu Có thé xác đinh có Alknloid nào đó dưa vào các phan ứng màu đặc trưng, các thuốc thứ tạo màu rhưòm dùnơ là: axit Sulfuric đặc. axit Nitric đặc. thuốc thử Frohde. thuốc thử Merke, thuốc thử Mandelin. (axit Sulfuric đãc và axit Vanadic ). [9] V í dụ : Thuốc thử Alkaloid Reserpin Axit Nitric đặc Ajmalin Xanh chàm —> đỏ Đỏ máu [19] gạch —> .^iig [21] Vanilin và HC1 đăc Đỏ [17] Serpentin Vàng [19] 1 í Tím hồng [19] 1.2 Định tính bằng phương pháp sắc ký lóp mỏng (SKLM) Trong dịch chiết có chứa nhiều Alkaloid và tạp chất khác thì phản ứns màu khôna được rõ bãns p.hữna Alkaloid đã được chiết và phân lóp ở dạns tinh khiết. Do đó để kết luận được chính xác người ta thườns dùns phán ứng màu đặc hiệu kết họp với phươns pháp sác kv có Alkaloiđ tinh khiết làm chất chuẩn. Nsuyèn tác: - Chiết Alkaloid trona dược liệu bằng dunẹ môi hữu cơ thích họp. - Khai triển sắc ký trên ban mỏng silicaơel (Merk. Daim Stadt. BRD) dã đưọ'c hoạt hoá ỏ' 110°c trong một 2 ÌỜ. khai triển bằn 2 một trona: các hệ duns môi sau: 5 • Clorofoc: Methanoi: Amoniac (50:9:1 ) • Cloroíoc: Methanol: Amoniac (19:1:0,5) • Buranol: Axit acetic: H ,0 (4:1 1:40) • n Butanol: Ethvl acetat: Ethvlclorid (10: 30:60 ) Phát hiện sự có mặt của Alkaloid nhờ đèn tử imoại. thuốc thử hiện màu Draơendorff. Bromothvmol xanh, đo Rf đôi chiếu với Rf của chất chuân. 2. Địrih lượng Có nhiều phươns pháp, trons đó có hai phương pháp định lươnu chủ vè 11 là Phương pháp trọng lượnơ Phương pháp trắc quang (so màu, đo quang) Ngoài ra còn có phương pháp - Phương pháp tạo tủa - Dhương pháp cực phổ 2.1. Địriú lượng Atkaloid toàn phần 2.1.1. Phưưng pháp trọng lượng [13] Nguyên tắc: Chiết Alkaloid toàn phần bằng dung môi hữu cơ khác nhau trong môi trườns kiềm (thường dùng Cloroíoc. cồn ...) • Loại tạp bằng một trong các loại axit sau: axit Sulfuric, Photphoric. axit Tactaric chiết Alkaloid dạng muối. • Kiềm hóa dịch chiết axit chuyển về Alkaloid bazơ. • Chiết Alkaloid bằnơ dung môi hũii cơ • Bốc hơi dung môi đến cạn • SấyV đến khối lương khôngI 'đổi • <—' • Cân và tính kết quá 6 2.1.2. Plurơns pháp đo quansi. N m i v è n tăc: • Chièt Alkaloid toàn phan từ dược liệu băne dung mỏi hữu CO' khác nhau ( C lo ro ío c [28]. c ồn [15]. ...) t r o n s mò! t r ư ờ n s kié m • Tạo màu với thuốc thử khác nhau: Metvl da cam ựlỉ] • Đo mật độ quang của duns dịch phân tích ở bước sóns hấp thụ cực đai • Naoài ra còn dùng: phương pháp đục kế khu vếch tán, phưoìiii pháp tạo tủa Reinecke. 2.2. Định lượng các Alkaloid chính 2.2.1. Phương pháp tử ngoại [28] Nsuyên tắc đo mật độ quang của dung dịch phân tích sau khi được tách bằng sắc ký lớp mỏng trên cùng một bước sóng, so sánh với dung dịch chất chuẩn. a, Ajmalin Dung dịch Ajmalin trong ccn tuyệt đối có độ hấp thụ cực đại ở ^,„ax = 249nm b, Reserpin Đo mật độ quang ỏ Xmiíx = 224nm c, Serpentin Đo mật độ quang ở Àmax = 307iim d, Ajmalicin Đo mật độ q u an ơ à k lUiìX= 227nm 2.2.2. Phương phảp đo quang, a- Ajmalin Nguyên tắc: tạo màu với thuốc thử thích hợp và đo mật độ quang học của phức màu ở bước sóns hấp thụ cực đại. 7 Có thế tao màu với: Axit Nitrie. tạo san phám diazo hoá. Xanthvldrol. tao màu với ỉod [22]. tạo màu với xanh Bromthymol [28]. Đôi chiến với chuàn Ajmaiin xác định được hàm lượns Ajmali:ì cua mát: phân rích. Niioài ra còn định lượim Ajmalin bá nu phirơnỉĩ pháp cực phố [24Ị. b- Reserpin Níiuyên tăc: Reserpin tạo màu với thuốc thử troníi điếu kiện thích hợp. đo mật độ quan.iĩ của phức hợp màu ờ bước sóns thích họp. Có thế lao màu với: Bromothvmol xanh [28], Iod [15] Ngoài ra còn dừng: phương pháp sắc kv khí, sắc ký siấy c- Serpentin: chủ yếu dùng phươns pháp so mầu Tạo phức màu Iod [22], Xanthydrol, Bromothymol xanh [28] và phương pháp cực phổ [26] d- Định lượng Ajmalicin Tạo phức màu với Iod [24], tạo phức màu với Xanthyldrol. phươns pháp tử ngoại III. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ s ử DỤNG TRONG Y HỌC Ba gạc ỉà nguồn dược liệu chứa Ajmalin, Reserpin, Ajmalic:in... các chất này đều là các chất có tác dụng dược lý riêng và có ý nghĩa quan trọng tron 2 V ìiọc. 1. Ajmaỉin Ajmaiin có tác dụng chống rung tim. thường sử dụng làm thuốc chóYis loan nhịp, dùns ở hai dạng là thuốc tiêm hoặc uống. Ajmalin có tác dụng chốns rung tim tươna; tự như Quiniỉin do tro na phân tử C(S Ìihóm Quinnclidin naoài ra Ajmalin cũns có tác dụna hạ huyết áp Liều thườnẹ dùng 50-100m2/lân X 3 lần /ngày cho ngườị lớn [4]. 8 2. Reserpin Reserpin có tác dụna hạ huvết áp và an thân , dùng dạns ưỏns h:iv rièm Liéu thonu thườn ii 0.25-0.5 nm/làn. l-2mn/nízày Liéu ròi đa 1ma/lần. 5ms/nuàv [41. 3. Aị mal i ci n Là thuốc rất quý. có tác dụim điéu trị r.li biến mạch mau não. rỏi loạn tâm thần - cư xử do chứna suy não ó' niiười ụià và các biểu hiện viêm độnu mạch chi dưới Liều thôna dụna 10-20 mg/nsày [4]. IV. S ơ LƯỢC VỂ R AUVO LFIA VOMITCRIA 1. Đặc điểm thực vật Rauvolíia vomitoria họ trúc đào (Apocvnaceae) -- Ba gạc Vĩnh Phú. Câv có nguồn gốc Châu Phi. tại Việt Nam đẫ phat hiện mọc hoang ở Phú Hộ Vĩnh Phú vào năm Ỉ965 [3], đã được nghiên cúa Lrồ112 trẹt tại Phú Thọ. vườn thuốc Văn Điển. R. vomitoria là câv nhỡ cao 2~5m, có thể tới 10 m. Cành có nhựa mủ trắng, phân nhánh nhiều, cành non có màu xanh, canh de í. cành già hình trụ màu nâu bạc. Lá đơn nauvên mọc vòng thườna có 4 lá. Hoa có cụm xim tán dài 8-15cm , mọc ở kẽ lá hay đầu cành. Hoa có 5 cánh màu trắna lục nhỏ, có 5 lá đài hình tam giác. Cánh hoa xoăn, ống tràn2; phình ở hni đầu (tràntr chí naắn bằng 1/ 2 của loài R. serpentina và R. vertillata) bên tronsi có lông. 5 nhị đính vào chỗ phình của ống tràng. Chi nhị rất ngán, vòi nhụv có ÌÔH2 ớ phàn đuôi, báu gồm hai noãn. Quá hạch hình cầu hay hình trứng đâu hơi nhọn, mọc riêng lẻ hay đôi một rời nhau, khi chín có màu đỏ cam. có một hạt hình trái xoan (hạt dẹt. cons, có khía) [7], [14] Mùa ra hoa vào tháns 4-8. mùa quá chín thán 2 1 1 9 2. Nghiên cứu về R. vomitoria trong và ngoài nước 2.1. Nghiên CÚÌI trong nước: 0 Việt Nam càv ba iiac 4 lá (R.vomitoria) đã đuvvc các nhà thực \'ậi. In>;í được chú V ràt nhiều. • Vé thực vậi Năm 1983 các tác ĩúá Nsuvẻn Kim cấn. Tạ Quans Nhiệm. Trán Toàn. Hạ Thị Na đã imhiên cứu thuán hoá ba iiạc 4 lá từ hoaim dại đua vào iTone trọt đổHíi rhò'i theo dõi độ nục? hoá tích ỈLiỹ hàm lượng Alkaloid Lphu• rhuộc vào thời * • c • kì sinh trướng, phát triên và mùa thu hái. [5] Năm 1987 tác giả Nsuyễn Kim cắn - Nsuyễn Văn Thanh đã nghiên cứu kích thích quá trình sinh trưởng, 1'úr ngắn thời ai an phát triển của câv và làm tăng hàm krợníỉ Alkaloid trong vỏ rễ của câv bằng nguyên tố Coban. [6] • Hoá học Từ nám 1975 Trịnh Gia An, Nguyễn Văn Đàn, Phạm Đình Sửu đ ã n g h iê n cím thành phần hoá học rẽ cây R.vomitoria, chiết Reserpin [1]. Đến năm 1976 các tác giả đã chiết được /\jmalin từ vỏ rễ cây [2]. Bang 1: Những đặc trưng hoá lí của một số Alkaloid đã xác định tronơ vỏ rề ba sạc: 4 lá (R.vomitoria) Alkaloid 1 Điểm chảy Phổ tử ngoại Phổ hồng naoại 1 (T°c) (°C) 1 C?H?OH A.max(nm) vmax( c n r 1) đặc trưna Reserpin C „H J()N:Og ■263°-265"C 210, 270. 295 1 IsoReserpin 1C nH ^ N .O , 1 150-155 218. 268. 295 MetyỉReser pat ! 2435 nhóm 1ONH) ; 1735.1715 (CH;COO-í 1590.1500 đặc ĩxưnc (Ar) vòng chơm; 1 130 đặc i Ịtrưns(-CO-) j 3390ONH); 1730.1710 Ị (CH;COO-): 1630.1500 NH);!735.i715 ; (CHXOO-): 1630.1590. 10 C.?H?0N ,0 , ; 248 DeReserpiđ ị; 155 ein 218,268,295 217. 268, 295 1500 (A n 1 125(-CO-) ; 3450ONH); 1730.1715: (CH,COO-): 1625,1590.! 1505 (-AD: 1 130 (-CO-) Ajmalicin C: i H,4N:0 : 248-250 226. 282 .o N hT: 1715 ' 3170 (CH.COO-); 1600, 1570 (Ar); 1 130 (-CO-) ! Ajmalin 158-160 248.290 13370 (-OH); 1615: 1500 (- 1 Ar); 1 ỉ 20 (-CO-) Akuamilin 1 140-143 216,268,295 C A N A • 1715 (CH3COO-): 1625, 1590. 1505 (- Ar); 1 130 (- ị CO-) ! Nghiên cứu tác dụng dược lý Alkaloid Rauvolíia vomitoria Nsoài hoạt chất Reseipin, Ajmalin, Ajmalicin trong vỏ rễ ba sạc còn có các Alkaloid khác cũng có tác dụng như Rescinamin, Reserpilịn... Mới đây Các giả Phạm Duv Mai đã nghiên cứu dạng cao toàn phần của Rauvolíia vomitoria để làm thuốc điều trị cao huyết áp. [10] Cao Rauvolíia vomitoria có tác dụng hạ huyết áp rõ trên động vật thí nghiệm, Sơ bộ so sánh với Reseipin thấy cao R. vomitoria vói liều lượng 20mg/kg có tác dụng hạ huyết áp tương đương vởi 7,5mơ/kg Reserpin. [! 0] Ngoài ra cao Rauvolíia vomitoria còn có tác duns gây thu nhỏ đổng từ và làm sa mi mắt trên động vật thí nshiệm. Về độc tính, cao Rauvolíia vomitoria có độ độc tương đương với độ độc của một sỏ loài Rauvolfia khác như R.verticillata. Từ dạng cao toàn phần đã nghiên cứu dập viên nén với tên Rauvomin. mỗi viên có hàm lượng Alkaloid toàn phần !à 0,002 a (Rauvomin có tác dụng hạ huyết áp tâm trương tốt. Khi phối hợp dùng với Hvpothiazid thì tác dụng hạ huyết áp tốt hơn ). [10] 2.2. Nghiên cứu níỊoài nước vê K. vomitoria: Theo một sỏ tài liệu nước neoài Ba 2 ạc 4 lá (R.vomitoria ) có ít nhár 72 aikaloiu. \êp thành 19 kiêu cấu Ĩ'TÌC [21]. [25j Vó thân có 48 alkaloid, alkaloid Heteroyohimbin như. ỉsoreserpilin. cùa vỏ thán là các alkaloid Yohimbin và các alkaloid kièu kiêu Dihỵdroindol như Norpurpelin. Nortetraphvlicin và Purpelin. các Alkaloid khác chi thu đirợc với hàm lượna dưới 0.0005C/c [25]. Vỏ rề có khoảns 33 alkaloid. Alkaỉoid vỏ rễ chủ yếu thuộc kiếu Dihvdroindol như Ajmalin. aceivl Ajmalin, Rau\volfin... thuộc kiểu Yohimbin như Reserpin. Rescinarnin ... Lá có 19 alkaloid kiểu Keteroyohimbin như Isoreseipilin, Reserpinin, Aricin... kiểu oxidol như Rauvoxin, Rauvoxinin.. Năm 1987 các tác giả Fujirnoto, Kenji Yamamoto, Osamu đã nghiên cứu sản xuất Reserpin bẳng nuôi cấy tế bào của Rauvolíia (trong tế bào mô cua R.vomitoria có 0,158 % Resetpip ^ [17] Năm 1997 Petati M, Ruffii J. đã phân lập từ vỏ rễR. vomitoria 2 Alkaloid idole mới là 3-epi resci.namine và 3, 4 - dimethoxv benzoyl- reserpin axit Me-este. [22] í2 PHẦN III-THỰC NGHIỆM ĩ- NGUYÊN LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ú I : 1. Nguvên liệu: * Dược liệu tươi thu hái vào thánii 3 (lá. vò thân, rẻ) troiii: thời kì cày sáp ra hoa. Nsuvèn liệu được sơ chê bằng cách phơi trong râm đên khô hoặc sấy nhẹ ở 60°c đến khô. Sau đó tán thành bộC ráv qua râv cỡ lỗ Imm(rể cẩn rửa sạch đất nhưng không làm bong lớp vỏ bề naoài rồi bóc vỏ riêns, lõi đế riẻna). Bột được bảo quản trong lọ màu, tránh ánh sáng, rránh ấm * Thuốc thử, hoá chất, máv móc thiết bị * Thuốc thử, hoá chất: - Bromothymol xanh cho định tính + Dung dịch A: 0,31 g Bromothymol xanh hoà tan tronẹ hỗn họp gồm 4ml cồn 96° và 3ml NaOH 0,2N thêm vừa đủ lOOml cồn . + Dung dịch B: NaOH 0,05 N trong cồn Etylic. + Dung dịch A và B trộn theo tv lệ 1:1 (thế rích) - Các đuna dịch chuẩn Ajmalicin. Ajmalin. Reserpin. Serpenũn + Dung dịch chuẩn Ajmalin: lOma Ajmalin hoà tan trong bình định mức 25 mi với duns môi là Clorofoc vừa đủ. + Dung dịch Ajmalicin: lOmg Ajmalicin hoà tan vơi Clorotbc vừa đủ trong bình đinh mức 25 ml. + Dans dịch chuẩn Reserpin: lOms Reserpin hoà ran với Clorofoc vừa đủ trong bình đinh mức 25ml + Dung dịch chuẩn Serpentin: 10 ma Serpentin hoà tan với Cloroíoc vừa đủ trong bình định mức 25 ml 13 Các dunsi dịch trên phai bao quan trong tu lạnh tránh ánh sánii - Các thuỏc thư + Draaenđoilt + Maver + Bouchardat + Axit picric 4- Sãt [II clorid 5cr troiiiỉ axit Percloric Các thuốc rhử trên pha theo dược điển Việt Nam II tập 3 - Duna môi Clorofoc. Methanol. Amoniac. Âxit Photphoric, Cồn. Benzen, Aceton. Axit Acetic, Etvl Acetat, Ete dáu, A1?0 , - Bán mỏns Silicasel G: Dùng Silicagel G cho sắc ký lớp mỏns; (cỡ hạt 5-40 ỊLim). • Máy móc thiết bị - Bìiih gạn, bìiih định mức, bình sac ký - Bộ cất quay - Máv đo quan£ phổ - Đèn tử nsoại Camax - Máv đo điểm cháy Mícro-Heiztisch — Boctus - Kính hiển vi - Máyj ly J tâm...v.v. uv ,IR, UV-VIS - Campec 2. Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp nghiên cứu hình thái giải phẫu: Tiến hành cắt vi phẫu nsuvên liệu tươi các bộ phận lá , thân, rễ . nhuộm theo phương pháp nhuộm kép thôns thườna, cỉùng xanh metylen và dỏ son phèn. 14 Đinh tính: Dùna thuốc thirchuna của alkaloid để định tính aỉkaloid íronu các bộ phân của cây. Dùne phươnii pháp săc kv lớp moim kết hợp với phán ứng màu đúc hiệu đè xác định các alkaioiđ ironii câv. * tìịniĩ lượng Áỉkaloiả toàn phần Chiíns tòi đã tiến hành định lượns Alkaloid toàn phân tronsi : ỉá. vó thân. vỏ rẻ. lõi rẻ theo phương pháp khối lượn 2 Theo cách tính của dược điển Việt Nam II, tập 3 a X 100 X 100 x = ------------------------- (%) (1) p(ioo-b) X: hàm lượng Alkaloid toàn phần trong dược liệLL (%) a : Ịvhối lượng cắn (g) p : khối Ịượng dược liệu đem phân tích (g) b: độ ẩm cửa dược liệu (%) Định lượng các Alkaloid chủ yếu của R auvoự ĩa Dùng phương pháp tử ngoại [29] để định lượng các Alkaloid chủ yếu của cây Nguyên tấc: Đo mật độ quang của dung dịch phán tích tiên cùnn mọr bước song, so sánh với dung dịch chất chuẩn. Áp cỉụns côna thức: Cx . K.V.100.100 X = ------- ------- ---------------- (%) p ( 100-b ) X: hàm lượng Alkaloid (%) K:hệ số pha loãng dịch chiết V: thể tích dịch chiết (ml) 15 (2) P: Khoi lượns dược liệu (ỊI) Cx: nồng độ (ms/mỉ) Dx Cx = --------Dc X Cc (3) Dx: Độ hấp thụ (mật độ quans) của dunsỉ dịch cán xác định Cx : Nồng độ chất hoà tan tronẹ đun 2 dịch chất cần xác định Dc : Độ hấp thụ (mật độ quang) của đuníĩ dịch chuẩn đã biết nổnsi độ Cc : Nồng độ cúa dung dịch chuẩn 3. Sai sỏ của sự xác định * Giá trị trung bình của đại lưọng ngẫu nhién 1 X = n ----------- X n Xị i=l Đ ộ lệch chuẩn Í/ I I T ( n ( Xị - X )2 s2= z X , 7 7 X| • X )2 --------- —> s=\ / i = ỉ______ i= 1 n- 1 y :!: Độ lệch chuẩn tương dôi s RSD = -------------X Có thế tính theo phần trăm s RSD % = ---------- . 100% X Trongw đó X,I là 2 Ìá tri. thưc . nơhièm o n là số thí nghiêm 16 n- ỉ II. THỰC NGHIỆM VÀ KẼT QUẢ A/ Nghiên cứu hình thái thực vật của cây 1. Đặc điểm thực vật: - Mô tả cây (hình dạng bên ngoài) Rauv/olíia vomitoria là cây nhỡ cao 2-6 m, có thể tới 10 m vỏ thân xù xì có màu xám bạc, có nhựa mủ trắng, cành phân nhánh nhiều. Lá đơn nguyên mọc vòng, 4 lá một. Cụm hoa một xim tán mọc ở kẽ lá hay đầu cành, hoa nhỏ màu trắng lục. Quả hạch hình cầu hay hình trứng, đầu hơi nhọn, khi chín có màu đỏ, có một hạt hình trái xoan. 9 Anh 1. Cây ba gạc Vũih Phú (Rau volfia vomitoria) Ảnh 2. Hoa cây ba gạc Vĩnh Phú ( R.vomitoria) 2. Vi phẫu: Vi phẫu lá Rau voỉíla vomitoria *. Gân lá: Gân lá lồi cả hai mặt, gân trên lồi rõ bao gồm các phần: (1). Biểu bì (trên, dưới): Gồm một lớp tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn, phủ lớp cutin mỏng (2). Mô dầy: Trong iớp biểu bì ỉà mô dày. - Mô dầy trên: Gồm đám những tế bào hình tròn xếp xít vào nhau - Mò dn\- dưới: Các tè bào hình đa c.‘_úác có kích thước lớn ho'n tè bào mỏ dây trẽn. (3). Mò mcin vo: Càu rao hơi nhữna tế bào tròn t kích thước ió'11 hưn :ẽ bào mo đà\ ) manu cellulo/.n moim. xẽ[ì lộn xộn đê ho' nhữnu khoánu uian bào nhỏ . (4-). Nhièu tinh thé Canxi oxulat trona phần mò mềm (5). Bó libe-iĩỏ: hình cung nầin giữa gân lá, libe xếp thành vòng liên tục bao quanh 20 (6) tron 2 iibe có các ône nhựa mủ (7). Rái rác nhiều đám sợi bèn nsoài li be. *. Phiên lá - Biểu bì ( trên, dưới ): gồm một lóp rê bào hình chữ nhật xếp đều đặn, phủ lóp cutin mỏng. (8). Mô giậu: gồm 1-2 hàng tê bào hình chữ nhật xếp vuông 2ÓC biếu bì trên (9). Mò khuvết: 2 ồm nhiều hàng tế bào xếp lộn xộn để hỏ' những khoảng gian bào. Những đặc điểm vi phẫu lá R.vomitoria được vẽ ở hình I. Hình 1. Vi phản lá ba gạc (Rauvolfia vomitoria) 19