Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Góp phân nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 166...

Tài liệu Góp phân nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 166

.PDF
56
184
115

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI SOUTTHIDA VONGSAVATH GÓP PHẦN NGHIÊN CƢ́U LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 166.28 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TÊ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI SOUTTHIDA VONGSAVATH GÓP PHẦN NGHIÊN CƢ́U LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 166.28 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: PGS – TS. Cao Văn Thu Nơi thƣ̣c hiên: ̣ Bô ̣ môn Vi sinh - Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nôị HÀ NỘI - 2013 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................ 2 1.1 Đại cương về kháng sinh .................................................................................. 2 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh ............................................................... 2 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh ............................................................................ 2 1.1.3 Phân loại kháng sinh ............................................................................... 3 1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh.............................................................. 3 1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh ................................................................. 4 1.2 Đại cương về xạ khuẩn..................................................................................... 5 1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ............................................................ 5 1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces .............................................. 6 1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh ............................................................... 8 1.4 Tuyển chọn , cải tạo và bảo quản giống của xạ khuẩn ................................... 9 1.4.1 Chọn lọc ngẫu nhiên ............................................................................... 9 1.4.2 Đột biến cải tạo giống ............................................................................. 9 1.4.3 Bảo quản giống ....................................................................................... 9 1.5 Lên men tổng hợp kháng sinh ....................................................................... 10 1.5.1 Đại cương ............................................................................................... 10 1.5.2 Các phương pháp lên men...................................................................... 10 1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ....................................... 12 1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ........................................ 12 1.6.2 Các phương pháp chiết tách ............................................................ 12 1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ..................................................... 13 1.7.1 phổ tử ngoại – khả kiến ( UV-VIS) ....................................................... 13 1.7.2 Quang phổ hồng ngoại (IR) ................................................................... 13 1.7.3 phổ khối ( MS) ....................................................................................... 13 1.8 Một số nghiên cứu liên quan . ....................................................................... 13 1.8.1 Phát hiện nguồn kháng sinh tự nhiên phong phú nhờ nghiên cứu những13 chất hóa học sinh ra bởi Streptomyces sp. trên ong bắp cày.............. ……….13 1.8.2 Tối ưu hóa môi trường lên men chủng Streptomyces Orientalis 4912 sinh vancomycin ……..…………………...………………………………..…………14 CHƢƠNG II : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... ..15 2.1 Nuyên liệu và thiết bị ..................................................................................... 15 2.1.1 Chủng xạ khuẩn ..................................................................................... 15 2.1.2 Ví sinh vật kiểm định ............................................................................. 15 2.1.3 Các môi trường ...................................................................................... 15 2.1.4 Dung môi............................................................................................... 17 2.1.5 Một số dụng cụ , máy móc. ................................................................... 18 2.2 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 18 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống ......................................................................... 19 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh............................................................. 19 2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được ................... 19 2.3 Phương pháp thực nghiệm ............................................................................ 19 2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ........................................................... 19 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ............. 20 2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên .............................................................................. 21 2.3.4 Đột biến bằng ánh sáng UV ................................................................. 21 2.3.5 Phương pháp đột biến hoá học ............................................................. 23 2.3.6 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ..................................................... 23 2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ................... 24 2.3.8 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng ............ 24 2.3.9 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay .................................. 25 2.3.10 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ............................................ 26 2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được................................... 26 CHƢƠNG III : KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHÂN XÉT .................... 27 3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ................................................................. 27 3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1. ........................................................ 28 3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2. ........................................................ 29 3.4 Kết quả đột biến hóa học........................................................................... 30 3.5 Kết quả chọn môi trường lên men. .......................................................... 31 3.6 Kết quả lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh ...................................... 32 3.7 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi ............................................. 33 3.8 Kết quả tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột. ............................................ 33 3.9 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết ........... 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 39 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS -TS Cao Văn Thu - Bộ môn Vi sinh – Sinh học người đã tâ ̣n tình hướng dẫn tôi từ những bước đầ u tiên cho đế n khi tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo , các cán bộ , kỹ thuật viên giảng dạy , công tác ta ̣i Bô ̣ môn Vi sinh - Sinh ho ̣c, Bộ môn Công Nghiệp Dược, Viê ̣n vê ̣ sinh dich ̣ tễ Trung ương, Bộ môn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Nhân dip̣ này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đế n Ban giám hiê ̣u cùng toàn thể các thầ y cô giáo trường Đa ̣i ho ̣c Dươ ̣c Hà Nô ̣i đã da ̣y dỗ và ta ̣o mo ̣i điề u kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i cho tôi trong thời gian tôi ho ̣c tâ ̣p ta ̣i trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ tôi trong suố t thời gian thực hiê ̣n khóa luâ ̣n. Do hạn chế về thời gian, điều kiện trang thiết bị và phương tiện nghiên cứu, khóa luâ ̣n này còn có nhiề u thiế u sót . Tôi rấ t mong nhâ ̣n đươ ̣c sự góp ý của các thầ y cô , bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2013. Sinh viên Soutthida Vongsavath DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ATCC American Type Culture Collection DM Dung môi ĐB Đột biến ĐBHH Đột biến hóa học Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) IR Infrared ( hồng ngoại ) KS Kháng sinh MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể MTth Môi trường thích hợp MC Mẫu chứng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên SKLM Sắc ký lớp mỏng VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật UV Ultra violet ( tử ngoại) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên. Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính KS đột biến lần 1 Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2. Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men chìm Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men Bảng 3.7: Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi Bảng 3.8: kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau sắc kí lần 1. Bảng 3.9: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 Bảng 3.10: kết quả IR. Bảng 3.11: Kết quả dự đoán từ phổ MS DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh Hình 1.2: Khuẩn lạc xạ khuẩn Hình 1.3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn Hình 1.4: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn Hình 1.5: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh Hình 1.6: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn Hình P.1: Hình thử HTKS bằng phương pháp khối thạch. Hình P.3: Hình thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch.. Hình P.3: Hình thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc Hính P.4: Hình phát hiện vết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV Hính P.5: Kết quả đo phổ UV của kháng sinh tinh khiết thu được Hình P.6: Kết quả đo phổ IR của kháng sinh tinh khiết thu được Hình P.7: Kết quả đo phổ khối của kháng sinh tinh khiết thu được. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một nước khí hậu nhiệt đới , tỷ lệ bệnh nhiễm trùng trong cơ cấu bệnh còn rất cao , vì thế kháng sinh là rất quan trọng do kháng sinh là một trong những công cụ đắc lực của các bác sỹ , dược sỹ trong phòng và chữa bệnh, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm nấm , ngoài ra kháng sinh còn được dùng trong chăn nuôi , trông trọt và công nghiệp thực phẩm . Tuy nhiên trên thị trường dược phẩm nước ta hiện nay , hầu hết các kháng sinh đều được nhập khẩu ở dạng thành phẩm và bán thành phẩm , ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh chưa thực sự hình thành. Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong các nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới của tổ chức y tế thế giới ( WHO ) . Do đó, đẩy mạnh nghiên cứu , sản xuất các kháng sinh có hiệu quả điều trị cao , độc tính thấp và ít bị kháng thuốc là một yêu cầu tất yếu trong phát triển y tê. Môi trường tự nhiên rất đa dạng của nước ta là một điều kiện thuận lới cho sự sinh sôi , phát triển của hệ vi sinh vật , trong đó đáng chú ỳ là các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh , đặc biệt là chi xạ khuẩn Streptomyces vì trong tất cả các kháng sinh được biết đến hiện nay thì có khoảng 60% nhuồn gốc từ xạ khuẩn và 55% trong số đó thuộc chi Streptomyces. Nắm bắt được xu hướng này , chúng tôi lựa chọn dề tài “ Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 166.28” đề làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu như sau:  Nghiên cứu cải tạo giống đề nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 166.28.  Nghiên cứu điều kiện lên men , chiết tách, tinh chế kháng sinh tốt nhất.  Nghiên cứu 1 vài đặc tính của kháng sinh thu được 2 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng về kháng sinh 1.1.1 Lich sử nghiên cứu kháng sinh Người đầu tiên đạt nền móng cho khoa học nghiên cứu chất kháng sinh là Alexander Fleming – nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra tác dụng kháng sinh vào tháng 10-1928 .[17] Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học Anh, Mỹ, penicillin đã được nghiên cứu, sản xuất với số lượng lớn và trở thành “ một loại thuốc thần kỳ” . Năm 1945, A.Fleming , E.Chain và H.W.Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penicillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh.[17] Những năm 1940-1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu kháng sinh với hàng loạt chất kháng sinh mới liên tiếp được phát hiện như : gramixidin, tiroxidin do Rene’Jules Dubos phát hiện năm 1939, Streptomycin do Waksman phát hiện năm 1941, Erythomycin do Gurre phát hiện năm 1952 … Cùng với việc phát hiện ra các chất kháng sinh mới , công nghệ lên men sản xuất chất kháng sinh cũng ra đời và dần được hoàn thiện [8] 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những hợp chất cón nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh ( cũng như cả với các tế bào ung thư ) ở nồng độ thấp mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người , động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung. [9,15] 3 1.1.3 Phân loại kháng sinh Kháng sinh có thể phân loại theo nhiều cách, theo nguồn gốc, theo cấu trúc hoá học, theo cơ chế tác dụng, theo đích tác dụng...[15] Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hoá học là chủ yếu, chia kháng sinh thành các nhóm chất sau đây: - Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin) - Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol) - Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin) - Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin) - Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin) - Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin) - Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B) - Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin) - Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (dactinomycin D). - Các kháng sinh khác : rifampicin … [9,16] 1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. [15]Có 6 kiểu chủ yếu: - Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào - Tác dụng lên màng nguyên sinh chất - Tác dụng lên sự tổng hợp ADN - Tác dụng lên sự tổng hợp protein - Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp - Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian.[16] 4 Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh 1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh + Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh được sử dụng rộng rãi, phổ biến để điều trị và phòng các bệnh nhiễm khuẩn, ngoài ra còn điều trị ung thư, chống nấm.[15] + Lĩnh vực khác:  Trong chăn nuôi: Bác sỹ thú y dùng kháng sinh để chữa bệnh cho động vật :Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò … kháng sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc , gia cầm, giảm chi phí thức ăn , tăng sản lượng trứng ở gà , vịt … [15]  Trong trồng trọt: Kháng sinh có thể diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây trồng; ví dụ: Blastincidin, Validamycin...[15]  Trong công nghiệp thực phẩm: Một số kháng sinh được dùng để bảo quản thực phẩm tươi, đóng hộp; ví dụ: Subtilin, Nisin... [15] 5 1.2 Đại cƣơng về xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G+C>55%. Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh. Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều.[15] Trong số hơn 16,000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khảng 60% là do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme (amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác.[15] 1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: - Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.[5] (Hình 2) Hình 1.2 : khuẩn lạc xạ khuẩn 6 - Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Xạ khuẩn phát triển theo kiểu mọc trồi . Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: da cam, đen, đỏ, nâu, trắng, vàng, xám… [5] - Xạ khuẩn được phân loại sơ bộ theo hình 3.[15] Actinomycetes Actinomycetales Actinoplanaceae Streptoverticulum Streptomycetaceae Streptomyces VSV giống xạ khuẩn Actinomycetaceae … Themostreptomyces … Hình 1.3 : sơ bộ phân loại xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces. (Tham khảo phụ lục 1) [7] - Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh: + Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.[6] 7 + Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào từ.[6] + Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (sp). [20] Hình 4 dưới đây thể hiện các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn. `Hình 1.4 : Các khuẩn ty ở xạ khuẩn - Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[8,19] - Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid . 8 1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh Dưới dây giới thiệu sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh [4,9] Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm Nhân giố ng trong phòng thí nghiê ̣m Nhân giố ng trên thiế t bi ̣nhân giố ng Lên men tổng hợp kháng sinh Dịch lên men Lọc, ly tâm Sinh khố i Dịch lọc Chiế t bằ ng dung môi hữu cơ Dịch chiết sinh khối Dùng cột trao đổi ion… Dịch chiết Cô, tinh chế Sản phẩm tinh chế Kiể m nghiê ̣m Sản phẩm đã được kiểm nghiê ̣m Đóng gói Sản phẩm đóng gói Hình 1.5: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 9 1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống của xạ khuẩn 1.4.1. Chọn lọc ngẫu nhiên Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết , có cả thể có HTKS tăng lên 20-30% so với những cá thể khác , phương pháp này giúp tuyển chọn các cá thể có HTKS cao để tiến hành các nghiên cứu tiếp [9] 1.4.2. Đột biến cải tạo giống Trong thực tế việc chọn lọc ngẫu nhiên các cá thể có hoạt tính cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, chưa có giá trị áp dụng vào sản xuất . Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh người ta áp dụng phương pháp đột biến nhân tạo.[9] Có 3 nhóm tác nhân gây gây đột biến :  Tác nhân hóa học : Hydroxylamin, ethylenimin, nitroso-guanidine, HNO2…  Tác nhân vật lý : Ánh sáng UV, tia X, tia gamma hay electron… Khả năng gây đột biến của ánh sáng UV phụ thuộc vào cường độ bức xạ, khoảng cách chiếu và thời gian chiếu .  Tác nhân sinh học : Các yếu tố di truyền động transposan , phage Mu ..v..v.. Sau khi chiụ tác đô ̣ng của các tác nhân đô ̣t biế n , phầ n lớn các VSV chế t . Trong số các biế n chủng số ng sót có biế n chủng có hiê ̣u suấ t sinh tổ ng hơ ̣p KS tăng (đô ̣t biế n dương), có biến chủng có hiệu suất giảm (đô ̣t biế n âm). Cầ n cho ̣n lo ̣c ra những biế n chủng có hiê ̣u suấ t sinh KS tăng để nghiên cứu tiế p . [12] 1.4.3 Bảo quản giống Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật có thể kể đến như : bảo quản lạnh, cấy chuyền, làm khô, đông khô, đông lạnh, ổn định trong đất …[13] Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm , cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần [14] 10 1.5 Lên men tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Đại cƣơng . Lên men là quá trình phân giải hydrocacbon trong điều kiện thích hợp ( hiếu khí hay kị khí ) và kháng sinh là một trong những sản phẩm quan trọng của quá trình lên men sử dụng xạ khuẩn.[9] Cụ thể hơn , kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần váo lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn ,thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng [15] Hình 6: giới thiệu đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn nối tiếp: pha tiềm tàng, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy tàn.[15] Hình 1.6 : Đƣờng cong sinh trƣởng phát triển của xạ khuẩn 1.5.2 Các phƣơng pháp lên men  Lên men bề mặt. Lên men bệ mặt là thực hiện nuôi cấy VSV trên bề mặt MT dịch thể hoặc rắn, bán rắn . VSV hấp thụ các chất của MT và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt MT dinh dưỡng [4] 11 + Ưu điểm : đơn giản , dễ thực hiện, chi phí đầu tư trang thiết bị ban đầu thấp. + Nhược điểm : hiệu suất thấp, tốn diện tích , khó cơ giới hóa , tự động hóa.  Lên men chìm. Vi sinh vật được nuôi cấy trong MT dịch thể , phát triển trong không gian 3 chiều của môi trường lỏng . [4] + Ưu điểm : sử dụng MT dịch thể tốt nhất , đáp ứng nhu cầu sinh lý của VSV. Hiệu suất sử dụng không gian cao . các thiết bị dễ cơ giới , tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng , nhân công, cho phép kiểm soát được toàn bộ quá trình lên men một cách thuận lợi. [13] + Nhược điểm: chi phí đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn . [13]  Có 4 kiểu lên men chìm như sau: + Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm. Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm. [4] + Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình lên men. [4] + Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng thời bổ sung thêm đồng lượng MT mới vào bình. [4] + Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định. [4]
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan

Tài liệu vừa đăng