BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ THU HIỀN
GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 173.113
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ THU HIỀN
GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 173.113
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Giáo viên hướng dẫn: Ths.VÕ THỊ THU THỦY
Nơi thực hiện: Bộ môn VI SINH – SINH HỌC
Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI – 2013
Lời cảm ơn
Tôi xin gửu lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo Ths. Võ Thị Thu Thủy –
người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành
khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên đang
giảng dạy và làm việc tại bộ môn Vi sinh - Sinh học trường đại học Dược Hà nội đã
tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận tại bộ môn.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể
các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên,giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian thực nghiệm hạn hẹp, điều kiện trang thiết bị, phương tiện
nghiên cứu cũng như trình độ của bản thân còn hạn chế, khóa luận này không tránh
khỏi còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và bạn bè để
khóa luận này có thể được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Lê Thị Thu Hiền
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN..………………………………………………………..2
1.1 Đại cương về kháng sinh …..………………………………………………2
1.1.1 Lược sử phát triển của kháng sinh ……………….…………………..2
1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh ……………………………………2
1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh …………………………………….4
1.1.4 Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất kháng sinh ……………….……...5
1.1.5
Các ứng dụng của kháng sinh ………………………………….……6
1.2 Đại cương về xạ khuẩn .…………………………………………….……...6
1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn ………………………………………...7
1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces………………………………7
1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn …………………….….9
1.3.1 Mục đích ……………………………………………………………..9
1.3.2 Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng SLNN ………….……9
1.3.3 Đột biến cải tạo giống …………………………….………………….9
1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn …………………………….……………..10
1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ……………………………………..11
1.4.1 Khái niệm lên men ………………………………………………….11
1.4.2 Các phương pháp lên men ………………………………………….11
1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men …………………….12
1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ...…………………..13
1.6 Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh..………………14
1.6.1 Phổ tử ngoại – khả kiến..……………………………………………14
1.6.2 Phổ hồng ngoại………..…………………………………………….14
1.6.3 Khổi phổ (MS)………………………………………………………15
1.7 Một số kết quả nghiên cứu về kháng sinh …………………………….....15
1.7.1 Ảnh hưởng của mức độ oxy hòa tan trên sản xuất dạng viên
Rapamycin từ Streptomyces hygroscopicus ……………………....15
1.7.2 Tối ứu hóa chuyển đổi của Streptomyces sp. ATCC 39.366 sản xuất
Leptomycin bởi electroporation …………………………………….16
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……..………..17
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị ....…………………………………………….17
2.1.1 Nguyên vật liệu ………………………………………………………17
2.1.2 Máy móc và thiết bị ………………………………………………….19
2.2 Nội dung nghiên cứu …………………………………………..………….19
2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống ………………………………………………...19
2.2.2 Lên men, tách chiết kháng sinh ………………………………………..20
2.2.3 Sơ bộ xác định tính chất kháng sinh thu được …………………………20
2.3 Phương pháp thực nghiệm …………………………………………….….20
2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ……………………………………….20
2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ………...20
2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………………………21
2.3.4 Phương pháp đột biến ………………………………………………….22
2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ……………………………………23
2.3.6 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc kí lớp mỏng …………24
2.3.7 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không ………………………...25
2.3.8 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc kí cột ……………………………….25
2.3.9 Sợ bộ xác định kháng sinh thô bằng sắc kí cột ………………………...26
Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT…………………….27
3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………….…...27
3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 ………………………….………...27
3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 ………………………….………...28
3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 ……………………………………29
3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh ……………..…….……….30
3.6 Kết quả chọn chủng lên men ……………………………………….…...31
3.7 Kết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi ………………………..…32
3.8 Kết quả sắc kí cột …………………………………………….…………32
3.9 Kết quả đo phổ của kháng sinh tinh khiết …………………………….38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1 Kết luận ………………………………………………………………….…...40
2 Kiến nghị …………………………………………………..…………………40
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
S.A
Staphylococcus aureus
P. mirabilis
Proteus mirabilis
ADN
Acid deoxyribonucleic
ARN
Acid ribonucleic
DMHC
Dung môi hữu cơ
ĐB1
Đột biến lần 1
ĐB2
Đột biến lần 2
G (-)
Gram âm
G (+)
Gram dương
HTKS
Hoạt tính kháng sinh
IR
Hồng ngoại - Infrared
KS
Kháng sinh
MC
Mẫu chứng
MT
Môi trường
MTdt
Môi trường dịch thể
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
SLNN
Sàng lọc ngẫu nhiên
TB
Tế bào
TĐC
Trao đổi chất
UV
Tử ngoại – Ultraviolet
VK
Vi khuẩn
VSV
Vi sinh vật
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học .................................... 3
Bảng 2.1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn ........................................................ 17
Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định ............................................. 18
Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng ...................................................................... 18
Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên ................................................ 27
Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 .......................................................... 28
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 .......................................................... 28
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3 .......................................................... 29
Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men ......................................................... 30
Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men .................................................................31
Bảng 3.7: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký ................................................. 32
Bảng 3.8: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1..................... 33
Bảng 3.9: Kết quả SKLM các phân đoạn lần1 (hiện hình bằng P. mirabilis) ....... 34
Bảng 3.10: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2................... 35
Bảng 3.11: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 2 (hiện hình bằng P. mirabilis) .... 36
Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3 ......... 37
Bảng 3.13: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 3 (hiện hình bằng P. mirabilis) .... 38
Bảng 3.14: Biện giải các nhóm chức của phổ IR ................................................... 39
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood,2007) .................... 2
Hình 1.2: Vị trí tác dụng của một số chất kháng sinh ............................................. 4
Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh ....................................................... 6
Hình 1.4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn ....................................................................... 8
Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn ……………………..13
Hình 3.1: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 1 trên P.mirabilis…………..34
Hình 3.2: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 2 trên P.mirabilis ………….35
Hình 3.3: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 3 trên P.mirabilis ………….36
Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.
Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
Hình P3: Phát hiện viết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV.
Hình P4: Sắc kí lớp mỏng.
Hình P5: Sắc kí cột.
Hình P6: Phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được.
Hình P7: Phổ khối của kháng sinh tinh khiết thu được.
Hình P8 : Phổ tử ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tác dụng của kháng sinh được phát hiện năm 1928 và Penicillin được sử dụng
vào năm 1943, từ khi ra đời, kháng sinh đã mở ra một kỷ nguyên mới trong lịch sử
ngành y – dược. Nhờ có nhóm thuốc này mà con người đã dự phòng và điều trị
được các bệnh nhiệm khuẩn, nhiễm nấm ,ung thư … Không dừng lại ở đó, ngày nay
phạm vi điều trị của kháng sinh còn đang được mở rộng trong cả điều trị ung thư và
HIV/AIDS cũng cho nhiều kết quả khả quan. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh
tràn lan và không đúng cách làm cho tình trạng kháng kháng sinh xuất hiện và ngày
càng trở nên nghiêm trọng. Vì vậy, việc tìm ra kháng sinh mới là điều cần thiết và
được cả thế giới quan tâm.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ
của nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng kháng sinh đạt
được nhiều thành tựu. Do đó, việc nghiên cứu để phát hiện ra kháng sinh mới có
nguồn gốc từ vi sinh vật vẫn là đề tài thu hút các nhà khoa học
Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có
nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi
lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ
Streptomyces 173.113” làm khóa luận tốt nghiệp. Bởi vậy, trong khóa luận này tôi
mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây:
-
Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh
-
Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất.
-
Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được.
Chương 1 : TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về kháng sinh
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh
Tháng 10 – 1928 bác sỹ, nhà sinh vật học người Scotland – Alexander
Fleming lần đầu tiên phát hiện ra vòng vô khuẩn kháng sinh và kháng sinh
Penicillin được dùng điều trị và thử nghiệm đầu tiên vào những năm 1940. Ngay
sau đó, penillin trở thành một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều chiến binh
trong chiến tranh thế giới thứ II.
Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều KS mới được xác định
hầu hết từ các xạ khuẩn, và đó là thời kỳ “ vàng son” của hóa liệu pháp KS( Hình
1.1)
Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007)
Việc phát hiện, phát triển và sử dụng KS trong điều trị ở thế kỷ 20 đã làm
giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ những từ 1980 số kháng sinh
mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển và thử nghiệm
thuốc mới ngày càng lớn. Bên cạnh đó, một hiện trang đáng báo động là ngày càng
tăng số lượng VSV gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Hiện nay, việc
kháng của VK phải được khắc phục bằng việc phát hiện ra thuốc mới.
Bên cạnh con đường nghiên cứu tìm kiếm các kháng sinh mới có nguồn gốc
tự nhiên thì công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện.
Đồng thời, việc tổng hợp, bán tổng hợp kháng sinh từ những khung hóa học sẵn có
cũng đạt được những thành tựu đáng kể với sự xuất hiện của cloramphenicol và
cephalosporin…
1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh
Định nghĩa
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn tự
nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách
chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật …) hay
tế bào ung thư ở nồng độ thấp. [11]
Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại KS: Theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng…Tuy nhiên
phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì người nghiên cứu có
thể nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện
khi biết được cấu trúc hóa học của nó. [11]
Phân loại KS theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm cấu trúc được
trình bày trong bảng 1
Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học [11, 18]
NHÓM KS
KS cụ thể
β-lactam
Penicillin, Cephalexin…
Phenicol
Cholaramphenicol...
Aminosid
Steptomycin, Tobramycin…
Macrolid
Erythromycin, Clarithromycin…
Lincosamid
Lincomycin, Lindamycin…
Tetracyclin
Tetracyclin, Doxycyclin
Peptid
Vancomycin, Polymycin…
Quinolon
Floxacin, Levofroxacin…
Cotrimoxazol
Cotrimoxazol…
1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Cơ chế tác dụng lên VSV gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc
điểm riêng, tùy thuộc bản chất của kháng sinh đó. (Hình 1.2)
Hình 1.2 : Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào receptor trên tế bào VSV,
làm biến đổi phản ứng sinh hóa trong tế bào VSV đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác
dụng lên các đích khác nhau. [18]
Có 6 kiểu chủ yếu: [18]
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào.
- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất.
- Tác dụng lên sự tổng hợp AND.
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein.
- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp.
- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian.
1.1.4 Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh
Giới thiệu tổng quát sơ đồ tổng hợp lên men sản xuất kháng sinh trong hình
1.3. [11]
Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm
Bình nhân giống quy mô phòng thí nghiệm
Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống
Bình lên men tạo kháng sinh
Dịch lên men
Sinh khối
Dịch lọc
Sinh khối thô
Dịch chiết kháng sinh
Dịch chiết sinh khối
Dịch chiết đậm đặc
Sản phẩm tinh chế
Sản phẩm tinh chế
Sản phẩm đã kiểm nghiệm
Sản phẩm được đóng gói
Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh
1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh
Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực khác nhau [11]:
Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh dùng để chữa các bệnh do vi khuẩn, vi
nấm gây ra. Ngày nay, một số kháng sinh còn dùng chữa bệnh trong ung thư.
Ngoài lĩnh vực y học: kháng sinh còn được sử dụng trong các lĩnh vực khác.
Trong chăn nuôi: Bác sĩ thú y dùng kháng sinh dùng để chữa bệnh cho động
vật: Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn
được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức
ăn, tăng sản lượng trứng ở gà, vịt[11].
Trong trồng trọt: Kháng sinh đã được sử dụng để tiêu diệt các bệnh của cây
trồng do vi khuẩn, virus, nấm gây ra.Ví dụ: Vandamycin dùng để diệt nấm
Rhidoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả [11].…
Trong công nghiệp thực phẩm: KS cũng được sử dụng trong công nghiệp
thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp giúp giảm thời gian khử trùng bằng
nhiệt, nhiệt độ khử trừng giảm xuống là cho chất lượng sản phẩm tốt hơn, các
vitamin không bị phá hủy, hương vị ít bị biến đổi. Ví dụ: kháng sinh subtilin (do
Bacillus subtilis tạo ra), nisin (từ Bacillus licheniformis). [11].
1.2 Đại cương về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomcetes) là những VK thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi
trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ
chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được.
Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo
dạng sợi phân nhánh có G + C > 55%. [4, 18]
Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm TĐC quan trọng như
KS, vitamin, acid hữu cơ, các enzym....nên được các nhà khoa học nghiên cứu rất
nhiều. [7, 19]
1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ
sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ
khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô
ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ. [7, 19]
Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3
μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết
sức phong phú: vàng, xám, da cam, đen đỏ, nâu, trắng … [7]
Actinomycetes
Actinomycetales
Actinoplanaceae
Streptoverticulum
Streptomycetaceae
Streptomyces
VSV giống xạ khuẩn
Actinomycetaceae
…
Themostreptomyces
…
Hình 1.4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có
cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh được tìm thấy do xạ khuẩn tổng
hợp thì có hơn 55% là do Streptomyces.
Bên cạnh những đặc điểm chung của xạ khuẩn, Streptomyces cũng có những
đặc điểm riêng:
Đặc điểm hình thái:
Khuẩn lạc xạ khuẩn là tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ. Khuẩn
lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng
màng dẻo, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.
Hệ sợi khuẩn lạc có cả khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ
chất: Mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát
triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi. Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển
dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ
xuất hiện các chuỗi bào tử. [7] Chuỗi bảo tử (sợi bào tử ) có rất nhiều hình dạng
khác nhau : thẳng, sóng, móc câu, xoắn…chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử
trần, là sơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn,
nhẵn, xù xì da cóc, có gai hoặc có tóc. [7, 12]
Đặc điểm sinh lý:
Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng
phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời
thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit.
Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 2530°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[7, 12]
Khả năng tạo sắc tố:
Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của
khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. [7, 12]
Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Có khá nhiều khóa phân loại Streptomyces: Khóa phân loại của Waksman, khóa
phân loại của Gauze,…Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình
Streptomyces quốc tế (ISP) do Shirling và Gottlieb đề xuất năm 1970 đã được sử
dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Khóa phân loại
này dựa trên các đặc điểm sau:
-
Màu của khuẩn lạc.
-
Màu của khuẩn ty cơ chất.
-
Sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan.
-
Hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử.
-
Khả năng tiêu thụ nguồn hydratcarbon.
1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1 Mục đích
Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên ( bùn, đất, nước,
mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh
thấp . Do đó, để thu được các chủng có HTKS và hiệu suất sinh tổng hợp cao đưa
vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn lọc giống bằng các phương pháp khác nhau
và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp.[11,15]
1.3.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự đột biến tự
nhiên với tần số khoảng 10-10 -10-5 trong ống
giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau
. Trong đó có biến chủng có
HTKS mạnh hơn 20-30 % những cá thể khác. Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính
cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. [11,15]
1.3.3 Đột biến cải tạo giống
Trong thực tế, việc sàng ngẫu nhiện các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, nó không có giả trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có
khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến
nhân tạo.[ 11 ]
Phương pháp: Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:
• Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), hydroxylamin,
dimethylsulphat…
• Tác nhân vật lý:
-
Ánh sáng UV, tia X, tia
hay electron.
-
Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Ánh
sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV
có kích thước nhỏ thì nó có thể xuyên thấu tới màng nhân.
-
Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian
chiếu, cường độ bức xạ.
-
Một đặc điểm trong tác động của tia UV là hiện tượng quang phục
hoạt (photoreactivation): Sau khi chiếu tia UV lên tế bào nếu để ngoài
ánh sáng thường thì các tổn thương do tia UV gây ra phần lớn được
phục hồi.
• Tác nhân sinh học: Các transposons, phage Mu.
Sau khi chịu tác động của các tác nhân đột biến
, phần lớn các VSV ch ết.
Trong số các biến chủng sống sót có biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp KS tăng
(đột biến dương ), có biến chủng có hiệu suất giảm (đột biến âm ). Cần chọn lọc ra
những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng để nghiên cứu tiếp.[ 11 ]
1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn
Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái
hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học. Mục đích cụ
thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi
và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ. [14, 16]
Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng
VSV:
- Cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền
sang môi trường mới),
- Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng)
- Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm
khô mẫu đông lạnh)
- Đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và
bảo quản ở nhiệt độ thấp).[14, 16]
Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi
cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong
tủ lạnh 20C và định kỳ 3 - 6 tháng cấy lại 1 lần.[14, 16]
1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.4.1 Khái niệm lên men
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của
vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các
hợp chất trung gian cho chúng [4,7,11]
Nuôi cấy VSV để tĩnh hoặc lắc sinh học hay trong bình lên men trong môi
trường dịch thể ( lên men chìm ) là các hệ thống đảm bảo sinh trưởng, phát triển của
VSV phát triển theo 4 pha đặc thù là pha lag ( pha tiềm tang ), pha log ( pha lũy
thừa ), pha cân bằng và pha suy tàn. Kháng sinh là sản phẩm bặc 2, tạo ra lúc kết
thúc quá trình sinh trưởng, vào pha cân bằng [11, 7]
Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn
1.4.2 Các phương pháp lên men
Lên men bề mặt : Trong phương pháp này , vi sinh vật được nuôi cấy trên bề
mặt cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng.
Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không đòi
hỏi thiết bị phức tạp.
- Xem thêm -