Tài liệu Giám sát sự lưu hành của virus cúm type AH5N1 trên đàn gia cầm tại các chợ của 3 tỉnh Bắc Trung Bộ thuộc dự án VAHIP bằng phương pháp PCR (Real time RT – PCR)

Phần I MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Chăn nuôi là ngành không thể thiếu được trong nền nông nghiệp của nước ta. Trong nhiều năm qua, ngành chăn nuôi đã phát triển rất đa dạng với nhiều hình thức chăn nuôi và loài chăn nuôi khác nhau góp phần tăng thu nhập cho bà con nông dân. Một trong số đó không thể không nhắc tới chăn nuôi gia cầm. Hằng năm ngành chăn nuôi gia cầm của nước ta đã cung cấp khối lượng thực phẩm đứng thứ hai sau chăn nuôi lợn, chiếm 17% tổng thịt hơi các loại. Theo số liệu thống kê năm 2008 nước ta có tới 247,3 triệu con gia cầm so với năm 2007 tăng 21,3 triệu con, với năm 2006 tăng 32,7 triệu con.(Tổng cục thống kê. 24/4/2010). Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi gia cầm nói riêng đã gặp không ít khó khăn. Nhiều dịch bệnh đã xảy ra buộc phải tiêu hủy toàn đàn gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi và nền kinh tế nước nhà. Nhiều dịch bệnh không chỉ xảy ra trên vật nuôi mà còn lây sang con người gây tử vong. Một trong số đó là bệnh Cúm gia cầm. Khi mới xuất hiện ở Việt Nam vào năm 2003, bệnh đã thể hiện là một căn bệnh có tính lây lan nhanh và gây hậu quả nghiêm trọng. Thời gian đầu của dịch bệnh từ ngày 27/12/2003 đến 30/04/2004, chỉ trong vòng hơn 4 tháng dịch đã làm cho 2574 xã/phường thuộc 381 huyện/thị trấn của 57 tỉnh/thành phố mắc bệnh. Tổng số gia cầm bị chết do bệnh và tiêu hủy lên tới 43,9 triệu con. Trong thời gian gần đây, mặc dầu chúng ta đã có nhiều biện pháp phòng chống dịch nhưng bệnh vẫn đang xảy ra trên phạm vi rộng và ngày càng nguy hiểm hơn, đặc biệt là số lượng người mắc và tử vong ngày càng tăng. Năm 2003 ở Việt 1 Nam chỉ có 3 người nhiễm và cả 3 người đều tử vong, trên thế giới có 4 người nhiễm và cả 4 người đều tử vong. Nhưng đến năm 2009, ở Việt Nam có tới 111 người nhiễm trong đó có 56 người tử vong, trên thế giới có 423 người nhiễm trong đó có 258 người tử vong. Với đặc điểm của căn bệnh là có nhiều subtype khác nhau và khả năng tổ hợp biến chủng đã làm cho căn bệnh ngày càng trở nên nguy hiểm hơn gây nhiều thiệt hại cho người chăn nuôi, đe dọa tính mạng con người đồng thời gây không ít khó khăn cho việc khống chế dịch bệnh cho ngành thú y. Trước tình hình trên đặt ra cho chúng ta câu hỏi là: làm thề nào để có thể chủ động biết được nơi đang lưu hành dịch, tỷ lệ lưu hành và nơi đó đang lưu hành chủng gây bệnh nào đồng thời phát hiện thêm các chủng mới một cách chính xác nhất. Chính vì thế mà chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Giám sát sự lưu hành của virus cúm type A/H5N1 trên đàn gia cầm tại các chợ của 3 tỉnh Bắc Trung Bộ thuộc dự án VAHIP bằng phương pháp PCR (Real time RT – PCR)”. 1.2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI. Góp phần xác định sự lưu hành của virus cúm type A/H5N1 trên 3 tỉnh thuộc dự án VAHIP: Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Thừa Thiên - Huế. 2 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. KHÁI NIỆM VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM Cúm gia cầm có tên khoa học là Avian influanza, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính gây ra bởi virus cúm type A thuộc họ Orthomyxovirideae. Đây là tác nhân gây bệnh nguy hiểm và nghiêm trọng trên gia cầm, dã cầm, động vật có vú khắp thế giới và có thể lây sang cho người gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và kinh tế mỗi quốc gia nói chung. Bệnh cúm gà đặc trưng với tỷ lệ ốm và chết nhanh, cao với các triệu chứng sốt cao và những biểu hiện bệnh lí ở các cơ quan. Trước đây, bệnh được gọi là bệnh dịch tả gà, nhưng từ Hội nghị quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville (Mỹ) năm 1981 đã thay thế tên này bằng tên Highly pathogenic avian influenza – HPAI. Tên này dùng để chỉ các virus cúm type A có độc lực mạnh, lây lan nhanh và có tỷ lệ tử vong cao. Tổ chức OIE (2003) đã xếp HPAI thuộc danh mục A, là 1 trong 15 bệnh nguy hiểm ở động vật. 2.2. TÌNH HÌNH BỆNH CÚM GIA CẦM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.2.1. Tình hình thế giới Bệnh đã được mô tả đầu tiên ở Italya vào năm 1878 và nó được nhìn nhận là một bệnh quan trọng và nguy hiểm. Năm 1955 virus gây bệnh mới được xác định thuộc type A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1 và H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây và các loại chim khác. Vào năm 1971 bệnh đã được mô tả kỹ qua đợt dịch cúm khá lớn trên gà tây ở Mỹ. Các năm tiếp theo bệnh được phát hiện ở Nam Mỹ, Bắc Mỹ, Nam Phi. Đặc biệt năm 1983 – 1984 ở Mỹ, dịch cúm gia cầm do chủng H5N2 ở bang Pensylvania, Virginia, Newtersey làm chết và tiêu hủy hơn 19 triệu con gà. Cũng trong thời gian này tại Irelan người ta phải tiêu hủy 270000 con vịt, tuy 3 không có triệu chứng lâm sàng nhưng đã phân lập được virus H5N8 và bệnh đã được loại trừ một cách nhanh chóng. Đến năm 2004, bệnh Cúm gia cầm đã xảy với quy mô lớn và với tốc độ bùng phát nhanh ở các nước châu Á với tổng số 11 quốc gia. Dịch xuất hiện đầu tiên ở Hàn Quốc từ đầu tháng 12/2003, sau đó dịch xảy ra nhiều nước khác với diễn biến khá phức tạp. Đến cuối tháng 2/2004 đã có 10 nước công bố dịch là Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan và Pakistan. Chủng virus độc lực cao đã được phân lập và định type là H5N1 đây là type chủ yếu, bên cạnh đó còn có H5N2 ở Đài Loan và H7N3, H9N2 ở Pakistan. Ngoài ra, tại một số nước khác đã phân lập được một số chủng khác như H6 ở Nam Phi, chủng H10N7 ở Ai Cập, H7N3 ở Canada, H7N2 ở Hoa Kì. Trong đợt dịch này khoảng 120 triệu gia cầm gồm: gà, gà tây, gà sao, gà lôi, vịt, ngan, ngỗng, chim cút, bồ câu và một số chim hoang dã đã bị nhiễm bệnh và nằm trong vùng dịch phải tiêu hủy. Cùng với diễn biến bệnh trên gia cầm, hàng trăm người cũng đã bị lây nhiễm, trong đó có trên 20 người bị chết (Hội nghị cúm gia cấm tại thành phố Hồ Chí Minh). Dịch cúm gia cầm ngày càng lan rộng. Tại Thái Lan, đợt dịch thứ nhất kéo dài từ ngày 23/01/2004 đến giữa tháng 3/2004 đã phải tiêu hủy 30 triệu con. Vừa chấm dứt thì đợt dịch thứ hai xuất hiện kéo dài từ ngày 03/07/2004 đến 14/02/2005. Ở Indonesia dịch xuất hiện đợt dịch thứ hai vào ngày 23/03/2005. Trong tháng 02/2004 một số nước đã tuyên bố khống chế được dịch song có một số nước dịch lại tái phát lần 2 như Thái Lan, Campuchia, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam. Có thể nói đây là lần đầu tiên trong lịch sử bệnh Cúm gia cầm xảy ra nhanh trên diện rộng với diễn biến khá phức tạp. Ngoài thiệt hại về kinh tế tính đến năm 2009 đã có 423 người nhiễm và 258 người tử vong (Ivan Larondelle. “ Cúm gia cầm”, Bách khoa toàn thư mở wikipedia.5/2/2010) 4 Bảng 2.1. Số lượng các ca nhiễm cúm gia cầm trên người 2.2.2. Tình hình dịch Cúm ở Việt Nam Dịch Cúm gia cầm xuất hiện đầu tiên ở Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 tại trại giống của công ty CP ( Thái Lan) làm 8000 gà ốm chết trong 4 ngày. Từ đó đến nay đã xảy ra các đợt dịch chính như sau: Đợt dịch thứ nhất: từ tháng 12/2003 đến 30/3/2004 Trong thời gian này dịch bệnh đầu tiên được báo cáo xảy ra vào cuối tháng 12/2003 ở một xã thuộc Hà Tây. Cùng thời điểm đó, các ổ bệnh cũng xảy ra tại các tỉnh Tiền Giang và Long An. Sau thời điểm này, bệnh đã lây lan nhanh từ tỉnh này sang tỉnh khác thuộc miền Trung, Tây Nguyên và một số tỉnh phía Bắc. Đây là đợt dịch đầu tiên xảy ra tại Viêt Nam nên ngành thú y gặp nhiều khó khăn trong công tác khống chế bệnh. Đồng thời dịch lây lan một cách nhanh chóng với nhiều ổ bệnh xuất hiện cùng một lúc ở nhiều địa phương khác nhau đã gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Chính vì thế, chỉ trong 2 tháng đợt 5 dịch đã làm cho gia cầm của 2574 xã/phường thuộc 381 huyện/thị trấn của 51 tỉnh/thành phố của Việt Nam bị mắc bệnh. Tổng số gia cầm bị chết do bệnh và bị tiêu hủy hơn 43,9 triệu con và thủy cầm là 13,5 triệu con. Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và tiêu hủy (Nguyễn Tuấn Anh, 2006). Đến đầu tháng 2/2004, bệnh Cúm gia cầm đã lan ra hầu như khắp cả nước với diễn biến phức tạp. Trung bình 1 ngày có khoảng 13 – 230 xã, 15 – 20 huyện phát sinh ổ dịch mới trong cả nước. Số gia cầm phải tiêu hủy lên tới 2 – 3 triệu con/ngày, ngày cao điểm lên tới 4 triệu con. Số lượng các ổ dịch cao nhất vào ngày 6/2/2004. Sau ngày 29/2/2004 không có thông báo về các ổ dịch mới, không còn gia cầm bị tiêu hủy và ngày 30/3/2004 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã công bố hết dịch cúm gia cầm trên toàn quốc. Như vây, trong đợt dịch đầu tiên này có 57/61 tỉnh/thành trong cả nước có dịch. Có 4 tỉnh không có dịch là Tuyên Quang, Phú Yên, Khánh Hòa và Bình Thuận. Hầu hết ở các tỉnh có dịch đều có trên 10% số xã có dịch. Theo thống kê cho đến đợt dịch cuối, đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long là những khu vực có tỷ lệ gia cầm mắc bệnh cao nhất. Đợt dịch thứ 2: từ tháng 4 đến tháng 11 năm 2004 Các ổ dịch Cúm gia cầm thể độc lực cao đã tái xuất hiện vào giữa tháng 4/2004 ở một số tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long. Trong đợt dịch tái lại này, bệnh xuất hiện chủ yếu ở các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ và hầu như không có trại chăn nuôi quy mô lớn nào bị nhiễm bệnh. Như vậy ta thấy dịch có khuynh hướng xuất hiện ở những vùng chăn nuôi nhiều thủy cầm và dịch đã xuất hiện ở 46 phường/xã tại 32 quận/huyện thuộc 17 tỉnh/thành. Thời gian cao điểm nhất là tháng 7 sau đó giảm dần, đến tháng 11 cả nước chỉ có 1 điểm phát dịch. Tổng số gia cầm bị tiêu hủy trong đợt này là 84000 con, trong đó có gần 56000 gà, hơn 8000 vịt và gần 20000 chim cút (Nguyễn Lan Anh, ‘Hội nghị quốc tế lần thứ hai về cúm gia cầm ở Châu Á’.12/4/2005.) 6 Đợt dịch thứ 3: từ tháng 12/2004 đến tháng 5/2005 Trong đợt này bệnh Cúm gia cầm thể độc lực cao đã xuất hiện ở 670 xã tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh/thành phố trong đó có 15 tỉnh phía Bắc và 21 tỉnh phía Nam. Thời điểm xuất hiện nhiều ổ dịch nhất là vào tháng 1/2005 với 143 ổ dịch xảy ra trên 31 tỉnh/thành. Tổng số gia cầm tiêu hủy của đợt dịch này là 460320 con gà, hơn 825000 vịt ngan và 551000 chim cút đã chết và bị tiêu hủy. (Báo cáo về dịch cúm gia cầm - Hội nghị dịch Cúm gia cầm) Đợt dịch thứ 4: từ 01/10/2005 đến 5/2005 Từ đầu tháng 10/2005 đến 15/12/2005 dịch đã tái phát ở 285 phường/xã, thị trấn thuộc 100 quận/huyện của 24 tỉnh/thành phố. Số gia cầm ốm, chết và tiêu hủy là 3735620 con, trong đó có 1245282 con gà, 2005557 con vịt, 484781 chim cút, bồ câu, chim cảnh (Nguyễn Tuấn Anh, 2006). Đây là đợt dịch có diễn biến khá phức tạp nên buộc các địa phương phải áp dụng các biện pháp quyết liệt như diệt toàn bộ gia cầm thả rông, đóng cửa rừng, đóng cửa các vườn chim, không nuôi gia cầm chim cảnh trong nội thành. Với những biện pháp trên với mục đích là đến năm 2006 không còn dịch Cúm gia cầm, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ban hành lệnh cấm ấp mới thủy cầm đến hết tháng 2/2007. Đợt dịch thứ 5: từ ngày 06/12/2006 đến ngày 04/03/2007 Ở những tháng đầu của năm 2007 dịch bệnh đã xảy ra tại 83 xã/phường thị trấn, 33 huyện/quận của 11 tỉnh/thành phố; nơi đầu tiên xảy ra dịch là Cà Mau sau đó lan ra ở các vùng lân cận. Tổng số gia cầm bị bệnh là 99040 trong đó có 11950 con gà, 87090 vịt và ngan. Sau thời gian trên dịch bệnh vẫn tiếp tục diễn ra trên nhiều điạ phương khác. Và theo số liệu thống kê trong năm 2007 dịch bệnh đã xảy ra trên 283 phường/xã thuộc 115 huyện/quận của 33 tỉnh/thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh là 62207 con, số gia cầm chết và tiêu hủy là 314268 con. Như vậy, so với các năm trước thì dịch bệnh đã có xu hướng giảm xuống 7 về phạm vi mắc bệnh cũng như số lượng mắc bệnh. Dịch bệnh năm 2008 Đầu năm 2008 dịch cúm gia cầm mới chỉ xảy ra trên tỉnh Trà Vinh sau đó dịch đã xảy ra trên các tỉnh khác như Thái Nguyên, Tuyên Quang, Quảng Bình, Hải Dương, Nam Định, Nghệ An, Hà Tĩnh và nhiều tỉnh khác. Trong năm 2008 dịch đã xảy ra trên 80 phường/xã thuộc 57 huyện/thị trấn của 27 tỉnh. Tổng số gia cầm mắc bệnh là 13007 con và tổng số gia cầm tiêu hủy là 106058 con (Phòng dịch tễ,’ Báo cáo tổng kết công tác phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2009 và phương hướng năm 2010’, Cục thú y, trang 1 – 4). Dịch bệnh năm 2009 Tính từ đầu năm 2009 đến ngày 22/12/2009 cả nước đã có 129 ổ dịch tại 71 xã/phường của 35 huyện/thị xã thuộc 17 tỉnh/thành phố phát dịch cúm gia cầm là: Bạc Liêu, Bắc Ninh, Cà Mau, Điện Biên, Đồng Tháp, Hậu Giang, Khánh Hòa, Nghệ An và một số tỉnh khác. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 105.601 con, trong đó gà 23733 con (chiếm 22,51 %), vịt 79138 con (chiếm 74,94 %) và ngan 2690 con (chiếm 2,55 %). Trong năm 2009 dịch bệnh đã diễn ra trên 72 xã/phường thuộc 18 huyện/thị trấn của 18 tỉnh. Tổng số gia cầm mắc bệnh 68463 con, tổng số gia cầm chết và tiêu hủy là 105601 con ((Phòng dịch tễ,’ Báo cáo tổng kết công tác phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2009 và phương hướng năm 2010’, Cục thú y, trang 1 – 4). Qua những số liệu trên ta thấy năm 2009 dịch bệnh đã giảm về phạm vi (số phường, xã) tuy nhiên số lượng gia cầm chết và tiêu hủy năm 2009 tương đương năm 2008 và bằng 1/3 so với năm 2007. Tình hình dịch cúm gia cầm trong 3 năm 2007, 2008, 2009 được thể hiện ở bảng 2.2. 8 Bảng 2.2. Tình hình dịch cúm gia cầm trong 3 năm (2007 – 2009) Giai đoạn Số tỉnh Số huyện có dịch Số Số gia cầm xã/phường mắc bệnh có dịch (con) Số gia cầm chết, tiêu hủy (con) Năm 2007 33 115 283 69207 314268 Năm 2008 27 54 80 13007 106058 Năm 2009 18 36 72 68463 105601 Dịch bệnh năm 2010 Trong những tháng đầu năm 2010 dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở nhiều tỉnh trên toàn quốc. Dịch xảy ra đầu tiên ở Cà Mau, sau đó dịch lan ra ở một số huyện ở Sóc Trăng. Tiếp đó dịch xảy ra ở Kon Tum, Quảng Trị, Nghệ An, Nam Định, Khánh Hòa và một số tỉnh khác. Trong gian đó, ở vùng Bắc Trung Bộ dịch xảy ra cũng khá phức tạp. Ở Hà Tĩnh dịch đã xảy ra ở huyện Cẩm Xuyên, Thành phố Hà Tĩnh, huyện Thạch Hà. Tổng số gia cầm ốm là 3527 con và tổng số tiêu hủy là 5726 con. Dịch cũng đã xảy ra ở một số huyện ở tỉnh Nghệ An như Huyện Nam Đàn, Huyện Nghi Lộc, Thành phố Vinh làm cho 370 con bị ốm và 1139 con tiêu hủy. Ở Quảng Trị, dịch mới chỉ xảy ra ở huyện Triệu Phong đã làm cho 495 gia cầm bị ốm và 1440 con gia cầm tiêu hủy. Có thể nói rằng dịch cúm gia cầm ngày càng diễn ra phức tạp trên phạm vi toàn quốc. Do vậy công tác phòng chống dịch ngày càng phải chặt chẽ hơn, ý thức người dân cũng phải nâng cao hơn. 9 2.3. VIRUS HỌC BỆNH CÚM GIA CẦM TYPE A 2.3.1. Cấu trúc chung của virus cúm Virus cúm gia cầm type A là thành viên của họ Orthomyxoviridae. Virus có vỏ ngoài với bộ gen là ARN cực âm một sợi. Hạt virus (virion) có dạng hình khối tròn, hình trứng hoặc hình khối kéo dài có đường kính 80 – 120 nm. Đôi khi virus có hình sợi kéo dài đến vài µm. Phân tử lượng của hạt virus khoảng 4.6 – 6.4 Dalton. Virus được bọc bên ngoài bằng các Protein và có màng Lipit ở ngoài cùng. Bề mặt ngoài phủ bằng hệ thống Protein bao gồm Protein có phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (hemagglutinin), Protein enzym cắt thụ thể NA (neurominidase). Hình 2.1. Cấu trúc bên ngoài của virus cúm gia cầm Capsid bên ngoài nhân của virus được cấu tạo từ Protein, cấu trúc đối xứng xoắn, độ dài 130 – 150 nm, đường kính 9 – 15 nm tạo thành giới hạn vòm của mỗi phân đoạn và liên kết với nhau một cách riêng biệt. Cùng với virus cúm A thuộc họ Orthromyxoviridae còn có 3 nhóm khác là: Virus cúm type B chỉ gây bệnh cho người Virus cúm type C chỉ gây bệnh cho người và lợn Virus nhóm Thogovirus 10 2.3.2. Nét đặc trưng về cấu trúc hệ gen Hệ gen của virus cúm chứa duy nhất axit ribonucleic (RNA) một sợi. Sợi RNA có độ dài 10.000 – 15.000 nucleotide tùy loại virus, chúng không được nối với nhau tạo thành một sợi RNA hoàn chỉnh mà được chia thành 7 – 8 phân đọan, mỗi một phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho các Protein khác nhau. Các phân đoạn 1, 2 và 3 là những phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, bao gồm: - Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus. Protein PB2 có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 84000 Dalton - Phân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA. - Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước 2233 bp, là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 83000 Dalton. PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus. Hình 2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm type A 11 Các phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid của virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A, bao gồm: - Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm A (ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng 1704 1707 bp). Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA 1 và HA2. HA1 nối với HA2 bằng một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là điểm cắt của enzym protease, và đây là vùng quyết định độc lực của virus. - Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có chiều dài thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở A/H6N2 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp). Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 50000 Dalton. Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau. Đặc trưng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng đột biến trượt - xóa một đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho độ dài vốn có trước đây của NA(N1) là 1410 bp còn 1350 bp. Các phân đoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng khác nhau của virus, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, bao gồm: - Phân đoạn 5 (gen NP) kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ. - Phân đoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1027 bp, mã hóa cho protein đệm (matrix protein - M) của virus (gồm hai tiểu phần là M1 và M2 12 được tạo ra bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA), cùng với HA và NA có khoảng 3000 phân tử MP trên bề mặt capsid của virus cúm A, có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin. Protein M1 là một protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus. Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử theo tính toán là 11000 Dalton, là protein chuyển màng - kênh ion (ion channel) cần thiết cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo” virus trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ. - Phân đoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc, có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus nếu thiếu chúng virus sinh ra sẽ bị thiểu năng. NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán là 27000 Dalton chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ. NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen (30 bp và 336 bp) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 14000 Dalton đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân. Trong các đoạn trên, đoạn RNA có trọng lượng nhỏ nhất mang mật mã cho 2 loại Protein không cấu trúc là NS1 và NS2, chúng dễ dàng tách được ở các tế bào bị nhiễm. Tất cả 8 đoạn của sợi RNA có thể tách và phân biệt dễ dàng qua phương pháp điện di. 2.3.3. Kháng nguyên của virus Dựa trên yếu tố ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin viết tắt là H ) và trung hòa (Neuraminidase viết tắt là N) là những kháng nguyên có vai trò trong miễn dịch bảo hộ và có tính đa dạng cao mà virus Cúm type A được phân type. Đến nay, có tất cả 16 loại gen H (H1 – H16) và 9 loại gen N (N1 – N9), mỗi một hợp gen H và N tạo nên 1 biến chủng gây bệnh. 13 Haemagglutinin(HA) một đặc tính kháng nguyên quan trọng của virus cúm là khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loại động vật mà thực chất là sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt virus với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu làm cho hồng cầu ngưng kết lại với nhau tạo mạng ngưng kết qua cầu nối virus. Từ đặc tính kháng nguyên này có thể sử dụng các phản ứng ngưng kết hồng cầu HA và ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI trong việc chẩn đoán bệnh. HA là một loại kháng nguyên vừa quyết định tính kháng nguyên vừa quyết định tính độc lực của virus Cúm type A. Neuraminidase (NA) là một enzyme có bản chất là glycoprotein mang tính kháng nguyên trên bề mặt virus cúm. Có 9 gen N nhưng trong đó chỉ có N1 và N2 có liên quan đến các vụ dịch ở người. Neuraminidase có tác dụng hỗ trợ giải phóng virus ra khỏi tế bào vật chủ. Neuraminidase cắt liên kết giữa gốc sialic acid tận cùng khỏi phân tử carbonhydrate của tế bào và virus, từ đó ngăn cản quá trình kết hợp của virus và cho phép giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào bị nhiễm. Nguy hiểm nhất về kháng nguyên virus cúm type A là chúng có khả năng tổ hợp biến chủng dẫn đến sự biến đổi liên tục về tính kháng nguyên. Chúng có hai khả năng đột biến: - Đột biến điểm (còn gọi là đột biến ngẫu nhiên hoặc hiện tượng trôi trượt, lệch lạc về kháng nguyên – antigenic drift). Đây là kiểu đột biến xảy ra thường xuyên, đặc biệt là đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N tạo ra những thay đổi nhỏ về trình tự Nucleotide của gen mã hóa cho kháng nguyên H và kháng nguyên N. Nếu quá trình dập tắt dịch không triệt để, virus vẫn còn tồn tại thì hiện tượng đột biến này sẽ xảy ra. Kết quả là sẽ tạo ra type Cúm hoàn toàn mới. - Đột biến do tái tổ hợp di truyền (còn gọi là đột biến thay đổi bản chất kháng nguyên – antigenic shift). Đột biến này là sự tái tổ hợp di truyền xảy ra định kỳ trong đó có sự sắp xếp lại các Nucleotide do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus khác nhau. Điều này đã tạo nên những sai khác cơ bản về bộ gen của virus đời con so với đời bố mẹ. 14 Chính khả năng tổ hợp biến chủng này đã gây ra nhiều tai họa không chỉ trên gia cầm mà còn trên con người. Năm 1918 ở Tây Ban Nha do biến chủng H1N1 làm chết 20 – 40 triệu người, năm 1957 ở châu Á do chủng H2N2, năm 1968 dịch cúm ở Hồng Kông do H3N2, dịch cúm năm 1977 ở Nga do H1N1. Hầu như tất cả các biến chủng virus cúm type A gây ra đều là sản phẩm tái tổ hợp của subtype có nguồn gốc từ động vật trước hết là chim và gia cầm. Do trên người có một số chủng virus gây bệnh cúm thông thường, nó sẽ là một nhân tố trong quá trình trao đổi gen giữa virus cúm thông thường trên người và virus cúm trên gia cầm tạo nên tổ hợp biến chủng mới. Và tổ hợp biến chủng này sẽ thích ứng trên người nên chúng rất nguy hiểm cho nhân loại. 2.3.4. Độc lực của virus Để đánh giá độc lực của virus cúm người ta sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3 – 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2ml nước trứng đã gây nhiễm virus với tỉ lệ pha loãng 1/10, sau đó đánh giá mức độ nhiễm của gà để cho điểm (chỉ số IVPI: Intravenous Pathogenicity Index). Điểm tối đa là 3 đó là virus có độ độc lực cao nhất. Theo quy định của Ủy ban châu Âu. Bất cứ virus Cúm nào có chỉ số IVPI từ 1,2 trở lên thuộc loại LPAI - độc lực cao. Trong thực tế, virus cúm gây bệnh ở loài chim được phân chia theo tính gây bệnh với 2 mức độ độc lực khác nhau: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên. - HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48h sau nhiễm. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin. - LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. 15 Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm. Cho đến nay, hầu như các vụ dịch lớn đều do virus HPAI gây ra thường là virus có kháng nguyên H5, H7, H9. Riêng H5 và H7 thông thường bắt nguồn từ virus độc lực thấp, sau quá trình lây truyền trên gà và chim cút độc lực tăng lên rất nhanh và gây ra các vụ dịch lớn. 2.3.5. Cơ chế xâm nhập, nhân lên và gây bệnh của virus Virus cúm A/H5N1 có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, hơn nữa đây là loại virus sống kí sinh nội bào bắt buộc nên quá trình xâm nhiễm và nhân lên chủ yếu xảy ra ở đường hô hấp. Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 2.3). Hình 2.3. Quá trình xâm nhập và nhân lên của virus trong tế bào vật chủ 16 - Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6h). Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ. - Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription). Phức hợp protein – RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào. - Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus. - Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế 17 bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác. 2.3.6. Sức đề kháng của virus Virus cúm type A tương đối nhạy cảm với các hóa chất và các tác nhân vật lí. Các hạt virus tồn tại thích hợp pH trong khoảng 6,5 – 7,9, ở pH quá kiềm hay quá acid thì khả năng lây nhiễm của virus giảm. Lớp vỏ bên ngoài có bản chất là lipid nên dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, các chất tẩy rửa và các chất sát trùng: fomaldehyde, phenol, β- propiolacton, sodium hypochloride, acid loãng và hydroxylamine. Virus bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40h, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường. Tia tử ngoại bất hoạt được virus mà không phá hủy được kháng nguyên virus. Tuy nhiên, virus cúm A dễ bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100 oC và 60oC/30 phút. Trong phân gia cầm ở nhiệt độ thấp tồn tại ít nhất 3 tháng, trong phủ tạng có thể tồn tại 24 – 39 ngày, nếu bảo quản ở nhiệt độ - 70 oC thì có thể tồn tại hàng năm. 2.4. TRUYỀN NHIỄM HỌC 2.4.1. Động vật cảm nhiễm Tất cả các loại chim thuần dưỡng (gia cầm) hoặc hoang dã (đặc biệt là loại thủy cầm di trú) đều mẫn cảm với virus cúm type A. Bệnh thường phát hiện khi lây nhiễm cho gia cầm (gà, vịt, gà tây, chim cút). Phần lớn các loại gia cầm non đều mẫn cảm với virus cúm type A. Ngoài ra, virus cúm type A có thể gây bệnh cho các loài động vật có vú như lợn, ngựa, thú hoang dã và cả con người. Mỗi một loại kí chủ có vai trò khác nhau trong việc lưu trữ, phân tán và lây bệnh. Có 3 loại kí chủ: 18 - Kí chủ lưu trữ hay mang mầm bệnh: đây là kí chủ thường nhiễm virus nhưng không phát bệnh hoặc phát bệnh rất nhẹ hoặc con non mắc bệnh còn con trưởng thành có thể tạo miễn dịch. Trong trường hợp này, các loại thủy cầm được coi là kí chủ mắc bệnh tuy nhiên còn phụ thuộc vào độc lực của virus. - Kí chủ hứng chịu: đây là loại kí chủ mẫn cảm với virus cúm và đào thải virus ra môi trường ngoài. Loại kí chủ này khi bị nhiễm thường phát bệnh rất nặng và các loại gà (gà, gà tây, gà lôi, đà điểu...) thường được coi là kí chủ hứng chịu. - Ký chủ lệch: là loại động vật hiếm khi bị nhiễm virus. Khi bị nhiễm bệnh nặng thì không hoặc bài thải rất ít virus ra môi trường bên ngoài. 2.4.2. Sự truyền lây bệnh Khi gia cầm bị nhiễm virus cúm, virus được nhân lên trong đường hô hấp và đường tiêu hóa. Sự truyền lây bệnh được thực hiện theo hai phương thức trực tiếp và gián tiếp. - Lây trực tiếp do vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung được bài tiết từ đường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn, nước uống bị nhiễm. - Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những công cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lây qua chim thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển. Có thể nói đây là phương thức lây truyền chủ yếu. Như vậy virus cúm dễ lây truyền tới những vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi... Đối với các virus gây bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm thì sự lây truyền chủ yếu qua phân, đường miệng. 19 2.5. TRIỆU CHỨNG, BỆNH TÍCH 2.5.1. Triệu chứng Thời gian nung bệnh từ vài giờ đến 3 ngày tùy thuộc vào số lượng, độc lực của virus, đường nhiễm bệnh, loài cảm nhiễm virus gây bệnh. Một số nghiên cứu cho thấy thời gian ủ bệnh trong nhiều trường hợp có thể dài hơn đến 7 ngày và lâu nhất là 14 ngày. Biểu hiện triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chủng virus, số lượng virus, loài nhiễm, tuổi, giới tính, điều kiện môi trường (nhiệt độ, ánh sáng, thành phần không khí...) chế độ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi nhiễm bệnh, sự bội nhiễm của VSV khác như: E.Coli, virus Newcastle, virus gumboro... Nhìn chung, khi mắc bệnh đàn gia cầm sẽ có triệu chứng:  Toàn đàn suy sụp, ũ rủ, lông xù, xơ xác. Nếu nhiễm virus độc lực cao thì gà chết đột ngột không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, tỷ lệ tử vong cao có khi đạt đến 100% trong vài ngày.  Có các biểu hiện về đường hô hấp thường xuất hiện đầu tiên và khá điển hình như ho khẹc, hắt hơi, thở khò khè, vảy mỏ, chảy nhiều nước mũi, nước mắt.  Mi mắt bị viêm, mặt phù nề, sưng mọng và có chiều hướng lan xuống cổ và ức do vậy gà bệnh có động tác vươn cổ ra để thở.  Mào dày lên do thủy thũng, tím tía, có nhiều điểm xuất huyết. Thịt gà bị bệnh thường thâm xám, dưới da vùng chân có điểm xuất huyết.  Bên cạnh các triệu chứng về đường hô hấp, gia cầm bị bệnh còn có triệu chứng thần kinh: đi lại không bình thường, run rẩy, mệt mỏi, nằm lì bì tụ đống với nhau. Ngoài ra, gia cầm bị bệnh thường tiêu chảy mạnh, phân loãng 20