Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giải mã gen kháng nguyên h, phân tích đặc điểm phân tử và xác định phả hệ nguồn ...

Tài liệu Giải mã gen kháng nguyên h, phân tích đặc điểm phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của canine distemper virus gây bệnh care ở chó tại hà nội

.PDF
77
66
127

Mô tả:

Bệnh Care hay còn được gọi là bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus Canine Distemper (Canine Distemper Virus - CDV) gây ra. Đặc trưng của bệnh là sốt cấp tính, rối loạn tiêu hóa, hô hấp và rối loạn hệ thần kinh, đặc biệt bệnh có tỷ lệ chết rất cao (Nguyễn Như Pho, 2003). Bệnh Care được phát hiện lần đầu tiên ở Peru từ thế kỷ XVIII và sau đó lan ra toàn thế giới như Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi và nhiều nước châu Âu. Ở châu Á, bệnh được ghi nhận tại Nhật Bản (Lan và cs., 2006), Thái Lan (Kubo và cs.,2007), Hàn Quốc (Cha và cs.,2013) và Ấn Độ (Swati và cs.,2015). Tại Việt Nam, bệnh xảy ra tương đối phổ biến và là một trong những bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất ở chó. Chó mắc bệnh Care bao gồm chó chưa được tiêm vaccine và cả những chó đã được tiêm vaccine (theo ghi nhận của các phòng khám thú y). Virus gây bệnh Care có hệ gen là RNA sợi đơn âm, có kích thước khoảng 15.7kb, thuộc loài Canine morbillivirus, họ Paramixoviridae, chi Morbillivirus. Hệ gen mã hóa cho 8 protein, gồm 2 protein không cấu trúc (protein C và V) và 6 protein cấu trúc là nucleocapsid (N), matrix (M), fusion (F), hemagglutinin (H), phospho (P) và large (L) protein. Trong đó, protein H và protein F là 2 protein kháng nguyên, quyết định tính độc lực của virus. Đây là các gen có nhiều biến đổi nhất giữa các chủng và giữa các genotype nên được chọn là đối tượng chính cho nghiên cứu dịch tễ phân tử và nguồn gốc phả hệ (Ke và cs.,2015). Có ít nhất 14 genotype khác nhau của CDV đã được công bố, bao gồm: Asia-1, Asia-2, Asia-3, Asia-4, Europe, European wildlife, Arctic, Rockbornlike, America-1, America-2, Africa, South America-1, South America-2 và South America-3 (Espinal và cs., 2014; Guo và cs., 2013).
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ ĐỨC THÀNH GIẢI MÃ GEN KHÁNG NGUYÊN H, PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÀ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CỦA CANINE DISTEMPER VIRUS GÂY BỆNH CARE Ở CHÓ TẠI HÀ NỘI Ngành: Thú y Mã số ngành: 8.64.01.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Đặng Thị Mai Lan - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 2. TS. Đoàn Thị Thanh Hương - Viện Công nghệ sinh học Thái Nguyên - 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện với sự giúp đỡ của: - Ths. Đỗ Thị Roan, Ths. Nguyễn Thị Khuê, Ths. Phạm Thị Khánh Linh, KS. Nguyễn Thị Thu Hiền cùng các anh, chị, em Phòng Miễn dịch học Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Chủ các Phòng khám Thú y tại quận Hà Đông, Nam Từ Liêm, Cầu Giấy - Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Tác giả Đỗ Đức Thành ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo: TS. Đặng Thị Mai Lan và TS. Đoàn Thị Thanh Hương, người đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin được chân thành cảm ơn tới Ths. Đỗ Thị Roan, Ths. Nguyễn Thị Khuê, Ths. Phạm Thị Khánh Linh, KS. Nguyễn Thị Thu Hiền cùng các anh, chị, em Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú y, các thầy cô, các anh chị em đồng nghiệp khoa Chăn nuôi Thú y, Chủ các Phòng khám Thú y tại quận Hà Đông, Nam Từ Liêm, Cầu Giấy - Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn. Lời sau cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người bạn, người thân trong gia đình và nhất là bố, mẹ đã luôn kịp thời động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành luận văn. Xin trân trọng cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Đỗ Đức Thành iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ................................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................ viii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2 3. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 3 3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4 1.1. Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu...................................................... 4 1.1.1. Nguyên nhân gây bệnh ............................................................................ 4 1.1.2. Con đường xâm nhập và cách lây lan ..................................................... 4 1.1.3. Cơ chế gây bệnh ...................................................................................... 5 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích ......................................................... 6 1.1.5. Chẩn đoán và phòng, trị bệnh ................................................................. 8 1.2. Cơ sở pháp lý của vấn đề nghiên cứu ...................................................... 14 1.2.1. Đặc điểm sinh học của virus Canine Distemper (CDV) ....................... 14 1.2.2. Tầm quan trọng của việc giải mã hệ gen virus Care ............................. 17 1.3. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................... 20 1.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ........................................ 22 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 24 iv 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 24 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 24 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 24 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 24 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 24 2.2.1. Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số quận trên địa bàn Hà Nội ..... 24 2.2.2. Thu nhận mẫu bệnh phẩm nhiễm CDV ................................................ 24 2.2.3. Thu nhận gen kháng nguyên H bằng kỹ thuật PCR .............................. 24 2.2.4. Giải trình tự nucleotide và amino acid của gen H ................................ 24 2.2.5. So sánh tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và amino acid của chủng CDV Việt Nam với các chủng của thế giới .............................................................. 24 2.2.6. Xác định phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV Việt Nam .................... 24 2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ....................................................... 25 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 25 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 26 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 34 3.1. Kết quả về tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận trên địa bàn Hà Nội ............................................................................................................. 34 3.1.1. Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận ở Hà Nội ..................... 34 3.1.2. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống..................................................... 35 3.1.3. Tỷ lệ mắc bệnh Care theo lứa tuổi ........................................................ 37 3.1.4. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa ....................................................... 39 3.1.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo nhóm đã được tiêm phòng và chưa được tiêm phòng vaccine ............................................................................... 40 3.1.6. Những triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care .......................... 42 3.2. Kết quả về số mẫu xét nghiệm và thu nhận gen H của chó mắc bệnh Care ...... 43 3.3. Kết quả phản ứng PCR và giải trình tự nucleotide, amino acid của gen H ............................................................................................................... 45 v 3.4. Kết quả phân tích gen H và so sánh với các chủng của thế giới.............. 49 3.5. Kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc của các chủng CDV Việt Nam ...... 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 58 1. Kết luận ........................................................................................................ 58 2. Đề nghị......................................................................................................... 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 60 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CDV: Canine Distemper Virus bp: base pair (cặp base) DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid CPE Cyto pathogenic Effect ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay IHC Immunohistochemistry IF Immuno Fluorescent test RT-PCR Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction RT Reverse Transcriptase msf multiple sequence file dNTPs: deoxynucleotide triphosphate MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis Epp: Eppendorf NCBI: Ngân hàng gen PCR: Polymerase Chain Reaction vii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Bộ mồi thu nhận gen H ................................................................... 25 Bảng 2.2: Các bước tách chiết RNA tổng số .................................................. 27 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA từ RNA tổng số ............ 28 Bảng 2.4: Thành phần của phản ứng PCR ...................................................... 28 Bảng 2.5: Các bước tinh sạch sản phẩm PCR................................................. 31 Bảng 3.1. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care tại 3 Quận ở Hà Nội............................... 34 Bảng 3.2. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống .............................................. 36 Bảng 3.3. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi ........................................... 37 Bảng 3.4. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa ................................................ 39 Bảng 3.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm đã được tiêm và chưa được tiêm phòng vaccine .................................................................................................. 40 Bảng 3.6. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care ................. 42 Bảng 3.7. Các mẫu virus CDV sử dụng trong nghiên cứu ............................. 44 Bảng 3.8. Nồng độ RNA tổng số được đo bằng máy Nanodrop .................... 45 Bảng 3.9. Danh sách các chủng CDV của Việt Nam và thế giới sử dụng trong nghiên cứu ................................................................................ 49 Bảng 3.10. Tỷ lệ đống nhất về nucleotide và amino acid giữa các chủng CDV nghiên cứu và các chủng của thế giới ............................................................. 53 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Mô hình cấu trúc của virus Canine Distemper (CDV) .............................15 Hình 1.2. Hình thái của virus Canine Distemper ......................................................16 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................26 Hình 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ...........................................................29 Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care tại 3 Quận ở Hà Nội .............................34 Hình 3.2. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống ............................................36 Hình 3.3. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi .........................................38 Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa...............................................39 Hình 3.5. Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm đã được tiêm và chưa được tiêm phòng vaccine............................................................................................................41 Hình 3.6. Sản phẩm điện di RNA các chủng CDV thu thập được ............................43 Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen H của 2 mẫu CDV nghiên cứu .................................................................................................................45 Hình 3.8. Trình tự nucleotide và amico acid (suy diễn) của gen H chủng CDVHN7 ...................................................................................................................47 Hình 3.9. Trình tự nucleotide và amino acid (suy diễn) của gen H chủng CDVHN6 ...................................................................................................................48 Hình 3.10. Sai khác nucleotide ở cuối gen H dẫn đến sự khác biệt của chủng virus vaccine so với chủng virus nghiên cứu .....................................................................54 Hình 3.11. Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ nguồn gốc giữa các chủng CDV nghiên cứu và các chủng của thế giới ...................................................................................56 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh Care hay còn được gọi là bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus Canine Distemper (Canine Distemper Virus - CDV) gây ra. Đặc trưng của bệnh là sốt cấp tính, rối loạn tiêu hóa, hô hấp và rối loạn hệ thần kinh, đặc biệt bệnh có tỷ lệ chết rất cao (Nguyễn Như Pho, 2003). Bệnh Care được phát hiện lần đầu tiên ở Peru từ thế kỷ XVIII và sau đó lan ra toàn thế giới như Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi và nhiều nước châu Âu. Ở châu Á, bệnh được ghi nhận tại Nhật Bản (Lan và cs., 2006), Thái Lan (Kubo và cs.,2007), Hàn Quốc (Cha và cs.,2013) và Ấn Độ (Swati và cs.,2015). Tại Việt Nam, bệnh xảy ra tương đối phổ biến và là một trong những bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất ở chó. Chó mắc bệnh Care bao gồm chó chưa được tiêm vaccine và cả những chó đã được tiêm vaccine (theo ghi nhận của các phòng khám thú y). Virus gây bệnh Care có hệ gen là RNA sợi đơn âm, có kích thước khoảng 15.7kb, thuộc loài Canine morbillivirus, họ Paramixoviridae, chi Morbillivirus. Hệ gen mã hóa cho 8 protein, gồm 2 protein không cấu trúc (protein C và V) và 6 protein cấu trúc là nucleocapsid (N), matrix (M), fusion (F), hemagglutinin (H), phospho (P) và large (L) protein. Trong đó, protein H và protein F là 2 protein kháng nguyên, quyết định tính độc lực của virus. Đây là các gen có nhiều biến đổi nhất giữa các chủng và giữa các genotype nên được chọn là đối tượng chính cho nghiên cứu dịch tễ phân tử và nguồn gốc phả hệ (Ke và cs.,2015). Có ít nhất 14 genotype khác nhau của CDV đã được công bố, bao gồm: Asia-1, Asia-2, Asia-3, Asia-4, Europe, European wildlife, Arctic, Rockbornlike, America-1, America-2, Africa, South America-1, South America-2 và South America-3 (Espinal và cs., 2014; Guo và cs., 2013). 2 Ở châu Á, một số nước đã tiến hành nghiên cứu về đặc điểm phân tử và xác định được nguồn gốc, genotype của các chủng CDV đang lưu hành. Một số nghiên cứu cho thấy, các chủng CDV của Trung Quốc thuộc genotype Asia-1, các chủng của Hàn Quốc thuộc về hai genotype Asia-1 và Asia-2 (An và cs., 2008), trong khi các chủng CDV phân lập tại Ấn Độ lại tách riêng khỏi nhóm Asia-1 và Asia-2, gần gũi với các chủng của Thụy Điển, Hungary và Đức (Cheng và cs., 2015; Swati và cs., 2015). Gần đây đã phát hiện genotype Asia-4 tại Trung Quốc và Thái Lan. Gen H (mã hóa protein H) là một trong những gen biến đổi nhất được dùng để xác định mối liên hệ di truyền giữa các chủng (Gámiz và cs., 2011). Gen H có khả năng biến đổi cao, quyết định tính dinh dưỡng của tế bào và vật chủ bằng cách liên kết với phân tử hoạt hóa tế bào lympho báo hiệu (SLAM) và các thụ thể hoại tử -4 của vật chủ. Tuy nhiên, nhiều sự kiện tiến hóa có thể đã tạo điều kiện cho CDV thích nghi với các vật chủ khác nhau và phải được đánh giá bằng cách giải trình tự bộ gen hoàn chỉnh mới có khả năng xác định được (Duque-Valencia J. và cs., 2019). Xuất phát từ những điều kiện thực tiễn trên, tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Giải mã gen kháng nguyên H, phân tích đặc điểm phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của Canine Distemper virus gây bệnh Care ở chó tại Hà Nội”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được tình hình mắc bệnh Care trên chó tại một số quận trên địa bàn Hà Nội. - Nghiên cứu và xác định được gen kháng nguyên H, phân tích được các đặc điểm phân tử, xác định được phả hệ nguồn gốc của virus CDV, xác định genotype của chủng virus gây bệnh Care trên chó tại địa bàn Hà Nội. 3 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học - Cung cấp tư liệu khoa học về gen kháng nguyên H, đặc điểm phân tử và phả hệ nguồn gốc của virus CDV gây bệnh Care trên chó. - Cung cấp thêm thông tin về thành phần, đặc điểm, cấu trúc gen kháng nguyên H của virus CDV nhằm phát triển vắc xin tái tổ hợp. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Bổ sung thêm tư liệu về tình hình mắc bệnh Care trên chó tại Hà Nội hiện nay. - Là cơ sở khoa học để từ đó có thể lựa chọn vắc xin phòng, bệnh Care có hiệu quả nhất. 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu Bệnh Care được coi là bệnh cổ điển và phổ biến ở chó trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế và là mối lo ngại cho các nhà chăn nuôi và người nuôi chó. Ở Việt Nam trước đây, có thể nói các bệnh về chó chưa được quan tâm đúng mức, ngoại trừ ở các trại nuôi và huấn luyện chó nghiệp vụ. Tuy nhiên ngày nay, các bệnh này ngày càng được quan tâm nhiều hơn do tầm ảnh hưởng của nó trong đời sống xã hội. Có rất nhiều loại chó quý, đắt tiền đã được nhập về Việt Nam; nhiều bệnh viện, bệnh xá thú y, phòng khám và các cơ sở chăm sóc chó mèo đặc biệt đã mọc lên trên cả nước. 1.1.1. Nguyên nhân gây bệnh Virus gây bệnh Care là một siêu virus có cấu trúc rất tinh vi thuộc nhóm paramyxovirus. Bệnh gây hại cho chó ở tất cả mọi lứa tuổi. Chó một tuổi trở xuống (2 6 tháng tuổi) dễ cảm thụ nhất, tỷ lệ mắc bệnh lên đến 70%. Chó đang bú mẹ ít mắc bệnh, nếu chó mẹ có miễn dịch thì chó mẹ có thể truyền miễn dịch thụ động cho chó con qua sữa đầu cho tới hơn 1 tháng, có khi tới 3 tháng. 1.1.2. Con đường xâm nhập và cách lây lan 1.1.2.1. Con đường xâm nhập Virus CDV xâm nhập vào chó qua đường hô hấp, tiêu hóa và da. Chó thường bài thải virus sau 7 ngày cảm nhiễm, virus lẫn vào các hạt bụi trong không khí và có thể tồn tại từ 6 - 22 ngày hoặc lâu hơn ngoài môi trường. Dịch chảy từ mắt, mũi trong cơn sốt đầu tiên của bệnh chứa rất nhiều virus. Mầm bệnh được thải qua dịch tiết mắt, mũi, nước bọt, phân, nước tiểu… 5 1.1.2.2. Cách lây lan Bệnh lây do tiếp xúc trực tiếp với con bệnh, con mắc thể ẩn tính, con mang trùng hoặc gián tiếp do thức ăn, nước uống bị nhiễm những chất bài tiết của con bệnh. Sự lây nhiễm nhanh hay chậm phụ thuộc vào mật độ chó nuôi tại vùng đó và tỷ lệ chó được tiêm phòng. Đặc biệt, virus có thể xâm nhập vào cơ thể qua da qua các vết thương hở (Nguyễn Vĩnh Phước và cs.,1978). Mặc dù virus được bài tiết qua môi trường thông qua hầu hết các chất dịch cơ thể, bệnh này ít có khả năng lây lan qua nước tiểu. Chất bài tiết qua đường hô hấp từ chó bị ho có thể gây bệnh (Hồ Đình Chúc và cs., 1993). Thời gian ủ bệnh của CDV có thể thay đổi từ 1 đến 4 tuần. Ban đầu, CDV lây nhiễm qua mô lympho đường hô hấp. Giai đoạn đầu virus nhân lên và phân bố khắp các mô bạch huyết của toàn thân, dẫn đến ức chế miễn dịch và sốt. Giai đoạn thứ hai xảy ra từ 6 - 9 ngày sau khi nhiễm bệnh, các tế bào nhu mô và biểu mô trên khắp cơ thể bị nhiễm trùng (Pope và cs., 2016). 1.1.3. Cơ chế gây bệnh Khi vào cơ thể vật chủ, đầu tiên, virus nhân lên trong mô lymphoid của hệ thống hô hấp, trong 24 giờ virus sẽ nhân lên ở đại thực bào và phát tán bởi hệ lymphocyte tới hạch amydal và các hạch bạch huyết. 2 - 4 ngày sau số lượng virus tăng lên nhanh chóng và xuất hiện trong máu, amydal, tuyến ức, lá lách, hạch bạch huyết, tủy xương, mô bạch huyết. Trong 4 - 6 ngày tiếp theo, lượng virus sẽ tăng lên nhiều lymphocyte ở lá lách, biểu mô dạ dày và ruột, niêm mạc ruột và tế bào Kuffer trong gan. Sự lan truyền của virus trong hệ bạch huyết gây ra cơn sốt đầu tiên, cùng lúc đó, virus tiếp tục phá hủy các lympho bào (bạch cầu lymphô bào, bạch cầu lympho T) dẫn đến suy giảm bạch cầu (Carter và cs., 1992). Vào ngày 8 - 9 sau khi bị nhiễm, virus theo máu đến hệ thống thần kinh trung ương và chó có biểu hiện thần kinh hay không phụ thuộc vào hệ miền dịch dịch thể và miễn dịch tế bào cua vật chủ. 6 Ngày thứ 9 - 14 sau khi nhiễm trùng, hệ miễn dịch của chó bị suy giảm, sức đề kháng kém, virus sẽ lan tràn trong các mô kể cả da, tuyến nội - ngoại tiết, trong mô dạ dày, ruột, đường hô hấp, niệu quản. Virus tồn tại lâu dài khiến triệu chứng lâm sàng của bệnh trở nặng tới khi con bệnh chết. 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích 1.1.4.1. Triệu chứng lâm sàng Canine distemper virus (CDV) là một bệnh rất dễ lây lan, chủ yếu liên quan đến chó non và các động vật ăn thịt nhạy cảm khác với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao. Nhiễm trùng CDV được đặc trưng bởi tính chất dinh dưỡng lympho, thần kinh và biểu mô dẫn đến nhiễm trùng toàn thân với các dấu hiệu lâm sàng nghiêm trọng và tử vong (Alessia Peserico và cs., 2019). Biểu hiện bệnh và phụ thuộc vào độ tuổi của chó mắc bệnh, giống chó, tình trạng sức khỏe, chế độ chăm sóc, nuôi dưỡng cũng như độc lực của mầm bệnh (Greene và Appel, 1987). Thời gian ủ bệnh chó mệt mỏi, ủ rũ, ít vận động, sốt cao 40 - 41°C kéo dài 1 - 2 ngày, chó bỏ ăn, mắt đỏ, sau đó thân nhiệt trở về 38,5 - 39,5°C; chó tỉnh táo hơn. 3 - 4 ngày sau, xuất hiện đợt sốt thứ 2 kèm theo chảy nước mắt, nước mũi ban đầu loãng sau đặc dần, đôi khi kèm mủ xanh hoặc máu đen. Viêm niêm mạc miệng và hạch amidan. Chó ho do viêm thanh quản, viêm phế quản rồi viêm phổi, ban đầu ho khan, sau ho ướt dẫn đến khó thở, nhịp thở tăng rõ, suy nhược cơ thể, bỏ ăn, bạch cầu (lympho bào) giảm. Chó có biểu hiện nôn khan, nôn liên tục, mệt lả, háo nước. Sau đó ỉa chảy, lúc đầu phân lỏng có màu xám vàng lẫn bọt và niêm mạc dạ dày, ruột lầy nhày kèm lẫn máu màu cà phê hoặc màu hồng nhớt như máu cá, có mùi tanh khẳm điển hình, giai đoạn cuối phân sẽ gần như nước do virus CDV đã làm hỏng hệ tiêu hóa. Chó mất nước và mất chất điện giải nên gầy sút nhanh, mắt trũng, bụng hóp, đi lại không vững, nằm liệt một chỗ, nhiệt độ hạ, loạn nhịp tim. 7 Gương mũi khô và bong tróc, chảy nước mũi có màu xanh, thở khó, thở khò khè. Da dầy lên, nổi các nốt chấm đỏ to bằng hạt đỗ xanh, hạt gạo ở những vùng da mỏng, có thể loét, chảy mủ (gọi là các nốt sài) làm lông bết lại, hôi hám, vết thương nhanh chóng lành, không hình thành sẹo. Màng kết mạc sung huyết, mắt có nhiều ghèn, bị đục, có thể kèm thêm viêm giác mạc mắt. Sau khi bị bệnh từ 10 đến 15 ngày, ở khoảng 80 - 90% số con bị bệnh, da ở gan bàn chân, mõm có hiện tượng tăng sinh dày lên và cứng lại, có khi bị nứt ra làm cho chó đi khập khiễng. Một số trường hợp chó chạy lung tung không định hướng, sủa rống lên, miệng chảy rãi rớt, ngã và dãy dụa, sau đó chó tỉnh táo lại nhưng rất mệt, chệch choạng, co giật và run rẩy liên tục. Chó bài tiết tiểu tiện và đại tiện không tự chủ. Cuối cùng nằm bệt, loạn nhịp tim, thân nhiệt hạ dẫn đến liệt chân rồi chết. Từ khi ủ bệnh cho tới khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng khoảng 14 - 18 ngày, chó thường sốt cao từ 3 - 6 ngày sau khi nhiễm. Carre thể thần kinh khi chữa khỏi vẫn để lại di chứng (đi xiêu vẹo, mù và điếc, gầy còm....) 1.1.4.2. Bệnh tích Theo Appel và Gillespie (1972), bệnh tích đại thể có thể gặp bao gồm sừng hoá da ở mõm và gan bàn chân. Tuỳ theo mức độ kế phát các loại vi khuẩn mà có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột hay mụn mủ ở da... Tế bào thượng bì đường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến nước bọt có thể tìm thấy tiểu thể Lenst trong nguyên sinh chất tế bào. Chó mẹ có thai thời kỳ cuối mắc bệnh thì chó con sau khi sinh thường xuất hiện triệu chứng toàn thân, tổn thương đường hô hấp trên, viêm mũi, viêm phế quản, viêm kết mạc mắt (Carter và cs., 1992). Viêm kẽ phổi lan toả mà đặc trưng là sự tăng sinh và dày lên của biểu mô vách phế nang, lòng phế nang bao gồm các tế bào long vách phế nang và đại thực bào. 8 Xác chết thường gầy, mắt trũng sâu, niêm mạc mũi, miệng viêm cata đỏ mọng, sưng dầy lên, có nhiều chất nhớt. Phổi viêm, sung to, mầu đỏ thẫm, khí quản - phế quản có nhiều bọt, nhiều vùng phổi chắc đặc, hạch lympho sung và xuất huyết, trên vùng da mỏng có nốt sài, xoang bao tim, xoang ngực, xoang bụng tích nước và não sung huyết. Ruột viêm cata xuất huyết khiến thành niêm mạc bong ra lẫn máu với phân. Đây chính là nguyên nhân khiến phân có mùi đặc trưng (Nguyễn Thị Huyền và cs., 2018). Các biến đổi bệnh tích đại thể của chó nghi mắc Care chủ yếu thể hiện ở hệ hô hấp (phổi, họng), ở hệ tiêu hóa (ruột non), hạch là nhiều nhất. Các bệnh tích đặc trưng của bệnh Care trên chó Phú Quốc như sau: Phổi có hiện tượng viêm xuất huyết ở chó C1, C3, C4, sưng hay xốp dai, có trường hợp phổi viêm dính với thành ngực. Bên cạnh đó, sung huyết mạch máu ruột và xuất huyết ruột non ở hầu hết các chó nghiên cứu. Hạch lympho sưng to, xuất huyết, mặt cắt của hạch lồi có dịch màu hồng chảy ra. Các cơ quan còn lại, sung huyết, xuất huyết ở mạch máu, não, lách nhồi huyết, dạ dày sung huyết, gan hơi sưng, túi mật sưng to, thận sưng và màng thận khó bóc (Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam, 2012). 1.1.5. Chẩn đoán và phòng, trị bệnh 1.1.5.1. Chẩn đoán bệnh * Chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng Sốt cao, chán ăn hay bỏ ăn, chảy nước mũi, ho, khó thở, có gỉ mắt, nôn mửa và ỉa chảy nặng đối với chó con, xuất hiện các triệu chứng thần kinh trong thời kỳ cuối của bệnh, co giật cơ chân, cơ mắt, không đi được hoặc đi lại khó khăn, lắc đầu, ho ở chó trưởng thành, có các nốt sài ở bụng, bẹn, ngực, phía trong đùi.... có các triệu chứng trên đường tiêu hóa hoặc triệu chứng thần kinh thì khả năng chó mắc bệnh Care là rất cao (Hồ Đình Chúc, 1993). Chẩn đoán ban đầu chủ yếu dựa vào các dấu hiệu lâm sàng liên quan đến nhiễm trùng. Tuy nhiên, hình thức chẩn đoán này còn gặp nhiều khó 9 khăn vì cần tiến hành phân biệt với các bệnh khác có dấu hiệu hô hấp, thần kinh và/hoặc tiêu hóa, chẳng hạn như bệnh dại, giảm bạch cầu ở mèo, coronavirus, toxoplasmosis, vi khuẩn enteritides và parvovirus (Angelika K Loots và cs., 2017). * Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm Bằng xét nghiệm sinh hóa và phân tích nước tiểu. Xét nghiệm huyết thanh học có thể xác định các, kháng thể dương tính, nhưng xét nghiệm này không thể phân biệt giữa các kháng thể tiêm chủng và kháng thể được cơ thể con vật sản sinh ra khi tiếp xúc với virus độc hại. Chụp X-Quang để xác định con vật có mắc bệnh viêm phổi hay không. Chụp cắt lớp vi tính (CT) và chụp cộng hưởng từ (MRI) có thể được sử dụng để kiểm tra não đối với bất kỳ tổn thương nào có thể phát triển. Xét nghiệm tế bào để phát hiện sự hiện diện protein đặc hiệu của virus hàm trong nguyên sinh chất, chủ yếu trên lớp tế bào biểu mô (Chó còn sống lấy lớp màng nhầy biểu mô màng sinh dục hoặc niệu đạo. Chó đã chết lấy mẫu sớm nhất ở các cơ quan: phổi, bàng quang, thận, não, hạch lâm ba…) * Chẩn đoán virus học Phân lập virus: bệnh phẩm máu, lách, phổi, nước và chất bài tiết của con vật. * Chẩn đoán bằng phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên môi trường tế bào một lớp Vero-DST (tế bào thận khỉ xanh châu Phi có gắn receptor đặc hiệu cho virus CDV), virus CDV chỉ có thể nhân lên và gây bệnh tích tế bào (Cyto pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp. Bệnh tích tế bào do CDV gây ra có thể quan sát được là những thể hợp bào. Tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện nhiều thể vùi. Ở trung tâm vùng tế bào xuất hiện CPE. Sự xuất hiện nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc 10 vào số lượng, độc lực của virus và “tuổi” tế bào. Tế bào mới nuôi cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã nuôi cấy nhiều ngày (Lan và cs., 2005). * Chẩn đoán bằng phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym (ELISA) ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch dựa trên cơ chế liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Trên kháng thể có có gắn enzyme và chất phát quang nhằm phát hiện ra sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2009). * Chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch Nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương pháp có độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết họp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu (Nguyễn Hữu Nam, 2010). * Chẩn đoán bệnh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IF (Immuno Fluorescent test) có độ sáng của bước sóng nhất định sẽ phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể đã được nhuộm bằng chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp với kháng nguyên - kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010). * Chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR/PCR Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction) là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp PCR. Phương pháp này có thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp mà khó có thể phát hiện bằng phương pháp khác. Do Taq polymerase sử dụng trong PCR không hoạt động trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA 11 thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT). Sau đó, cDNA này sẽ được khuếch đại nhờ Taq polymerase. Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gen đặc hiệu của virus. Sự hiện diện của sản phấm này thường được nhận biết qua điện di trên gel agarose (Lan và cs., 2008). Bên cạnh phương pháp RT-PCR, ngày nay phương pháp chuyển đổi cDNA được sử dụng rất rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu giải mã gen. Hệ gen của virus RNA trước tiên được chuyển đổi thành DNA bổ sung (cDNA) sử dụng mồi xác suất hecxamer, bộ hóa chất sinh phẩm của Hãng Fermentas. Tiếp theo sản phẩm cDNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Phương pháp này có ưu điểm là tiết kiệm được lượng khuôn ban đầu và đỡ tốn kém hơn. So với các phương pháp chẩn đoán khác, chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử cho độ chính xác tuyệt đối, ngoài ra bằng giải trình tự gen có thể xác định chính xác các type/genotype của virus gây bệnh. * Chẩn đoán phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn đoán nhanh Về bản chất, đây là phương pháp xét nghiệm ELISA để phát hiện kháng nguyên của virus Care trong máu, gỉ mắt và nước mũi của chó. Hai kháng thể đơn dòng trong thiết bị sẽ kết hợp đặc hiệu với các nhóm quyết định kháng nguyên khác nhau của virus Care. Sau khi cho bệnh phẩm vào vị trí đệm cellulose của thiết bị, virus Care sẽ kết hợp với kháng thể đơn dòng thứ nhất. Rồi phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dòng khác trong màng nitơ - cellulose của thiết bị để tạo thành hợp chất kép hoàn chỉnh. Kết quả xét nghiệm được biểu hiện qua các vạch do thiết bị sử dụng theo phương pháp “sắc ký miễn dịch”. Ưu điểm: có độ nhạy cao, có thế chẩn đoán bệnh sớm trong thời gian đầu của bệnh, dễ dàng thực hiện với nhiều loại mẫu bệnh phẩm như huyết
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan

thumb
Lv duong quy...
95
1486
67

Tài liệu vừa đăng

Tài liệu xem nhiều nhất