Tài liệu Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày

Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Đề tài. Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất nước mắấm ngắấn ngày GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang SVTH: Nhóm 19 Trần Quốc Huy 3005110114 Trần Thị Mỹ Lan 3005110137 Nguyễn Hoàng Linh 3005110145 Trần Thị Tiến 3005110335 Ngô Thị Minh Tuyền 3005110375 Tp.Hồồ Chí Minh-2014 Mục lục 1 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Nội dung Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang trang Lời mở đầu.........................................................................................................4 I. Enzyme protease...........................................................................................5 1. Khái quát về enzyme......................................................................................5 1.1 Enzyme.........................................................................................................5 1.2 Đặc tính chung của enzym............................................................................5 1.3 Cấu tạo của enzym........................................................................................5 2 Tổng quan về enzyme protease........................................................................6 2.1 Giới thiệu......................................................................................................6 2.2 Đặc điểm chung............................................................................................6 2.3 Phân loại.......................................................................................................8 2.4 Cơ chế tác dụng............................................................................................10 2.5 Nguồn cung cấp............................................................................................10 II. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae.....................15 1. Quy trình thu nhận enzyme protease..............................................................15 2. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae...........................16 2.1 Tổng quan về Aspergillus oryzae..................................................................16 2.2. Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.............23 2.2.1. Sơ đồ quy trình.........................................................................................24 2.2.2. Thuyết minh quy trình..............................................................................25 III. Ứng dụng enzyme Protease trong công nghệ sản xuất nước mắm ngắn ngày................................................................................................................... 30 1. Ứng dụng enzyme protease............................................................................30 2. Ứng dụng protease trong sản xuất nước mắm ngắn ngày...............................33 2.1 Giới thiệu.....................................................................................................33 2.2 Phân loại nước mắm.....................................................................................34 2 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang 2.3. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm....................................................36 2.4. Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm..........................................................37 2.5 Nguồn nguyên liệu.......................................................................................37 2.5.1 Cá..............................................................................................................37 2.5.2 Muối..........................................................................................................41 2.5.3 Nguyên liệu phụ........................................................................................43 2.6 Quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày.....................................................45 2.7 Giải thích quy trình.......................................................................................46 2.7.1 Rửa............................................................................................................46 2.7.2 Xử lý..........................................................................................................47 2.7.3 Lên men.....................................................................................................47 2.7.4 Lọc.............................................................................................................51 2.7.5 Cô đặc chân không....................................................................................52 2.7.6 Bổ sung hương...........................................................................................54 2.7.7 Đóng chai..................................................................................................56 IV Sản phẩm.....................................................................................................58 1. Cách tăng hương vị cho nước mắm ngắn ngày...............................................58 2. Tiêu chuẩn của nước mắm thành phẩm..........................................................58 3. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm..................................................................58 4. Một số sản phẩm nước mắm sử dụng phương pháp ngắn ngày trên thị trường.................................................................................................................60 Kết luận..............................................................................................................62 Tài liệu tham khảo..............................................................................................63 3 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang Lời mở đầu Một trong những thành tựu to lớn của khoa học công nghệ trong thời gian gần đây là nghiên cứu về enzyme, nó đặt trưng cho sự phát triển của khoa học tự nhiên trong mấy chục năm qua, và một trong những enzyme được nghiên cứu rất nhiều, đó là enzyme protease, đây là enzyme được thu nhận từ rất nhiều nơi, từ động vật, thực vật cho tới vi sinh vật đều là nguồn gốc của enzyme protease, và điều đặc biệt là enzyme protease đóng vai trò vô cùng quan trọng trong cuộc sống của chúng ta và được ứng dụng trong rất nhiều ngành nghề, một trong số đó là ứng dụng quan trọng trong công nghệ sản xuất nước mắm ngắn ngày. Bài báo cáo về enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày sẽ giúp cho chúng ta hiểu rõ về enzym protease, cách thu nhận cũng như hiểu được tầm quan trọng của enzyme protease trong sản xuất nước mắm ngắn ngày, để có thể tham khảo và áp dụng thực tế một cách tốt nhất khi đi vào thực tế. Với sự góp mặt của các thành viên tích cực, sự kết hợp ưng ý cũng như sự phân công công việc công bằng, hứa hẹn sẽ đem đến một báo cáo hấp dẫn, đầy những kiến thức thú vị và bổ ích. Dù đã cố gắng hết sức, bài báo cáo chắc chắn không tránh khỏi những thiếu xót. Nhóm tác giả rất mong sự đóng góp ý kiến của Cô và toàn thể các bạn nghiên cứu đề tài này để nhóm có được những kiến thức đầy đủ nhất. Xin cảm ơn! 4 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày I. ENZYME PROTEASE 1. Khái quát về enzyme Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang 1.1. Enzym - Enzym có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp nên, tham gia vào các phản ứng hóa sinh học. 1.2. Đặc tính chung của enzym - Enzym được tạo ra trong tế bào sinh vật, không độc hại, thân thiện với môi trường. - Enzym tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi được tách khỏi tế bào sống. - Enzym có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau. - Enzym có thể được thực hiện một phản ứng: xảy ra ngoài tế bào (như trong ống nghiệm) - Phản ứng enzym tiêu hao năng lượng rất ít, hiệu suất và tốc độ cao - Enzyme tính chọn lọc cao - Enzym chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. 1.3. Cấu tạo của enzym Nhóm enzym đơn cấu tử : Thành phần cấu tạo chỉ có protein. Nhóm enzym đa cấu tử : - Gồm 2 phần: + Phần I: protein thuần : apoprotein hay apoenzym + Phần II: thành phần không phải protein : cofactor – chúng có thể gắn chặt (prosthetic) hoặc lỏng lẻo với phần protein (coenzym) 5 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang Ngoài ra còn có một số kim loại giữ vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, giữa apoenzym và coenzym, tham gia vận chuyển điện tử. 2. Tổng quan về enzyme protease 2.1 . Giới thiệu. Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và các amino acid. Chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực. Đặc biệt là công nghiệp thực phẩm, protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ và nâng cao đời sống của con người. Hiện nay trên thế giới, công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn đang phát triển, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme protease. Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng Protease, chủ yếu tập trung vào các protease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại đây. 2.2 . Đặc điểm chung. Ezyme protease là enzyme thủy phân các liên kết pectid (-CO-NH-) trong phân tử protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc dittripepton. Hình 1.1: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein 6 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình phân giải cơ chất dưới tác dụng của các protease. Dạng monomer và dimer của cơ chất dễ phân giải hơn dạng tetramer. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Hình 1.2: cấu trúc không gian enzyme protease 7 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang 2.3. Phân loại. Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) . Hình 1.3: Sơ đồ phân loại protease Với enzym protease thì có nhiều cách phân loại nhưng ta chỉ dựa vào hai đặc điểm sau để phân loại chúng:  Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các peptide trong phân tử protein, người ta chia protease làm 2 nhóm chính: • Exopeptidase: (Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptid,) được phân thành 2 loại: Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi poly peptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid. Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi poly peptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một đipepti. 8 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang • Endo peptidase: (Dựa vào động lực học của cơ chế xúc tác) được chia thành 4 nhóm: Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin. Nhóm chymotripsin bao gồm các enzyme động vật như chymotripsin, tripsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cyteim proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài proteinase động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cystein proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin…. Các asportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở PH trung tính. Metallo proteinase metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA.  Dựa vào thành phần amimo acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia làm các nhóm: - Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động ở vùng pH acid 2-4. - Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt động ở vùng pH kiềm 9- 11. Protease trung tính: như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, … hoạt động ở vùng pH trung tính 7-8  Ngoài ra có thể phân làm 2 loại khác: Enzyme protease nồi bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại biên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kĩ thuật trích ly. 9 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang - Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men hoàn tất hoặc ngay quá trình lên men đang diễn ra. 2.4. Cơ chế tác dụng Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học của enzym người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzym và cơ chất thành hợp chất trung gian. E (enzym) + S (cơ chất)→ ES(hợp chất trung gian) 2.5. Nguồn cung cấp Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của sinh vật; nhưng để thuận lợi về kinh tế, người ta chỉ dùng những vật liệu cho phép thu một lượng lớn enzyme với hiệu suất cao. Hiên chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận protease: các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật a. Nguồn Động vật Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hóa ở người và động vật, có nhiều ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai enzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bê, bò…) Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều ezyme nhất. Trypsin là men phân giải các protein hỗn hợp men này do tuyến tụy tiết ra, tiền thân của nó là Trypsiogen, được hoạt hóa bởi Entorokiaza của ruột. Trypsin là một enzym có chức năng phân cắt các protein. Ngoài ra tuyến tụy còn tiết ra enzyme Chymotrypsin, enzym này góp phần phân giải protein trong ruột non và được chiết xuất từ tụy bò. Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi các casein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có nồng độ Ca2+ (sự đông tụ sữa chua). 10 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như: ở các loài Eudothia parasitica và Mucor purillus. b. Nguồn thực vật Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Caria papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ chế biến thịt nó làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hóa. Ngoài ra còn thu nhận ezyme Ficin tách từ dịch ép thân cây sung. Ezyme được sử dụng để phân hủy protein tự nhiên. Hình 1.4: mô hình phân tử enzyme papain Hình 1.5: nguồn thu nhận ezyme Protease từ thực vật 11 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang c. Nguồn vi sinh vật Hai nguồn nguyên liệu trên không để dùng làm nguyên liệu sản xuất công nghiệp quy mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ. Vì dùng enzyme từ vi sinh vật sẽ khắc phục được các hạn chế sau: - Nguồn nguyên liệu vô hạn. Hệ enzyme phong phú. Hoạt tính mạnh. Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọ giống. Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh. Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ tiền. Ezyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn...gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men. • Vi khuẩn Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59 lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại andopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. Mesentericus, B. Thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. Subtilis có khả năng tổng hợp mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 6) và có khả năng chịu nhiệt thấp.Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. Subtilis, B. Mesentericus, B. Thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. 12 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang Hình 1.6: Clostridium Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000 – 30.000. Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7 – 12. Hình 1.7: Bacillus • Nấm Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng Aspergillus oryzae, A. Terricola, A. Fumigatus, Penicillium chysogenum,... Các loại nấm mốc có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm, trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3. Một số nấm mốc khác như: A. Candidatus, P. Cameberti, P. Roqueforti... cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat 13 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang Hình 1.8: Nấm mốc • Xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. Fradiae,... Hình 1.9: xạ khuẩn Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích như sau: - Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật. Chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16 – 100 giờ nên có thể thu hoạch nhiều lần trong năm. Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng và tăng hiệu suất thu hồi). 14 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày - Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất. Tuy nhiên, trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp. Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết. II. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae 1. Quy trình thu nhận enzyme protease Trong sản xuất các chế phẩm protease, người ta thường chia làm hai giai đoạn: Thu protease thô và tinh sạch protease. Thu chế phẩm protease thô: Với nguồn động vật và thực vật thì ta nghiền , trích ly rồi ly tâm. Còn với nguồn vi sinh vật thì ta nuôi cấy, phá vỡ tế bào rồi đem ly tâm. Tinh sạch protease: Sử dụng phương pháp hóa lý để loại dần các thành phần không phải protease ra khỏi thành phần protease. Sản phẩm cuối cùng là protease tinh khiết. 15 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang Hình 2.1: Quy trình tổng quát thu nhận protease 2. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae. 2.1. Tổng quan về Aspergillus oryzae a. Đặc điểm cấu tạo Aspergillus gồm hơn 185 loài khoảng 20 loài cho đến đã được báo cáo là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng cơ dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme . Trong số này, Aspergillus fumigatus là phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus, versicolor, Aspergillus oryzae… - 16 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase, protease và catalase có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin. Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật. Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc này để sản xuất tương. Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty có nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh lợt có ít vàng. Nấm Aspergillus oryzae có hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi sang màu xanh thẩm. dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia.  Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae. Protease: Ứng dụng trong công nghiệp da giày, y học, công nghiệp chế biến thức an gia súc Amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dixtrin, malt….. Cellulose: ứng dụng trong công nghiệp dệt,công nghệ giấy, xử lý ô nhiễm môi trường…. b. Vai trò của giống Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đống vai trò quyết định đến: Năng suất của nhà máy, chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính của enzyme), vốn đầu tư cho sản xuất, giá thành sản phẩm, có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinh vật. c. Yêu cầu của giống Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo qui mô công nghiệp. Do đó, giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ enzyme cần có những yêu cầu và mục đích nhất định. Giống vi sinh vật phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm phải có số lượng và chất lượng cao.Vì trong quá 17 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang trình trao đổi chất, để chuyển hóa một lượng sinh khối khổng lồ gấp hàng ngàn lần cơ thể mình trong khoảng thời gian ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp rất nhiều chất. + Giống phải cho năng suất sinh học cao + Giống phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp. + Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phương. + Giống sử dụng trong quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh. + Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh các sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách chiết, tinh sạch + Dễ dàng bảo quản và ổn định Để tạo thuận lợi lớn nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên men công nhiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết. d. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae  Nuôi cấy bề mặt Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm, sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… Có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỷ lệ các chất phụ gia phải đảm bảo sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20% có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH 4)2 SO4, (NH4)2 10, phospho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Với phương pháp này nồng độ enzyme cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật.Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng 18 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện quy mô gia đình. Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó. Tuy nhiên, phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều.  Nuôi cấy chìm Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với có chất chủ yếu trong đa số trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon là đường glucoza, saccharoza. Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy chìm một bước gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất. Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ khí hóa, tự động hóa năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh vô trùng.Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn. e. Nguyên liệu sản xuất Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm hãm của chất kìm hãm nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, H, ON. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác như. 19 Nhóm: 19 Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuấất n ước mắấm ngắấn ngày  Th.S Nguyễễn Thị Thu Sang Nguồn cacbon Đối với Asp.oryzae: frucfoza arabinoza glactoza. saccroza maltoza glucoza manit Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease. Chảng hạn như: vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi trường tinh bột lớn hơn 8%. Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonos pora vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25 – 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme.  Nguồn nitơ Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt hơn cả. Các nguyên liệu đã chuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép quả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ đường, sản phẩm phân hủy, nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hòa sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng. f. Phương pháp phân lập Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên, đâu đâu cũng có vi sinh vật. Ở những nơi giàu chất hữu cơ, trong không khí, trong cơ thể động vật, thực vật….Chính vì vậy mà vi sinh vật có khả năng tồn tại và phát triển ở những điều khắc nghiệt nhất. Thông thường chủng vi sinh vật để thu nhận enzyme thường có 3 cách phân lập: + Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên + Phân lập giống trong điều kiện sản xuất + Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng Tùy thuộc vào khả năng và điều kiện thực tế mà chọn cách phân lập phù hợp nhất.Mỗi cách có những ưu điểm riêng .  Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt đáng kể các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự 20 Nhóm: 19