Tài liệu Enzyme phytoene desaturase

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM Môn: Tin Sinh Lớp: Thứ 5 Nhóm: 1 Thành viên: Trịnh Trà My - 20174954 Trần Thu Yên - 20175381 I. Tổng quan đối tượng: 1. Enzyme ​Phytoene desaturase - Là enzyme được tìm thấy trong vi khuẩn cổ, vi khuẩn và nấm có liên quan đến sinh tổng hợp carotenoid. - Chúng xúc tác cho quá trình chuyển đổi 15-cis-phytoene không màu thành lycopene màu đỏ tươi trong con đường sinh hóa-con đường poly-trans. - Ứng dụng: Dựa vào cấu trúc và đặc tính của enzyme để tạo ra chủng vi khuẩn có bộ gene tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp carotenoid. 2. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng) là một loài tụ cầu khuẩn có khả năng sinh tổng hợp carotenoid. - Trong bộ gene của ​Staphylococcus aureus c​ hứa gene mã hóa enzyme Phytoene desaturase. - Có ít biến đổi trong bộ gene. II. Quy trình tiến hành: Bước 1: Tìm các đoạn nucleotit mã hóa gen ​Phytoene desaturase của vi khuẩn Staphylococcus aureus: Vào trang web: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Chọn thanh Protein tìm với từ khóa: Phytoene desaturase Trong mục Top Organisms: Chọn Staphylococcus aureus Đọc và chọn lựa các trình tự phù hợp với điều kiện nghiên cứu Chọn được 4 trình tự có kí hiệu là: >CP029080.1:281269-282774 Staphylococcus aureus strain AR466 chromosome, complete genome CACGCCTTGCTCAATATCTTTAATTATTTCGTCTACAGTTATTTTCGCACTCGTTAAGACAATAGGAAC G CCTGCACCTGGATGCGTACTTGCACCTGCAAAATATAAATCTTTATAATCTCGCGATACATTTTGTGG AC GATAATAATTACTTTGCGATAAAGTTGGCATTAAACCGAATGCCGAACCAAATTTCGCATGATACGTT TG CTCAAAATCATTCGGCGTAAAGATGGTTTCCGATATAATATGCGATTTTATATCTTCAAATGCTTCAA TT GTTGCTAGTTTACGATAAATAACATCTTTTATTTGTTGTGTCAAAGCTTCATCTGACCAATCGATTCCG C TACCTGTTTTAAGTTCCGGAGTCGGCATTAACACATAAATACCAGTTTTGCCTTCTGGCGCAAGTGAT TT ATCAGCGACCGCTGGAACATACACATAAATAGAAGGATCATATGATAAACGTCCCTCAAATATTTCT TCA ATATTGCCTCTAAAATCATCTGAAAAAATAACATTATGAAGTCTCACTTGATCTGTCACATCAATATCT A TACCGATATACATTAAAAATGCTGAACAAGAGTAATCTAAGTCTGCAATTTTATGTGGTGGATACTTT TT AATAGGTGCAAAATCTGGCATTAATGATTCCGCAACACTAGGGAAATCAGCCGTACATAAAATTTTA TCA AATTTTCTTATGTCACGATTCACTTTTATCGCATCGGCCCTTTTGAATTTAGGATCAATAATAATTTGC T CAATTTCAGCATTAAGTTCAATATTAGCGCCTAAGTCTTTATTTAATTGTGCTAGCCCTTGAGCCATGC C ATACATACCGCCTTTAATAAAATGCACACCAAACATCATTTCAATCATAGGAATAATTGAATATAGTG AC GGGCCTCGTTTTGGATCAATTCCTATGTATAACGTTTGAAAGGCTAACAGTTTTTGTATTTTTTCATTA T CAATGTACTGCTCAATTAATTGATCTGCATGATTTAGAGTTTTTAATTTAGCACCTTGCACAAGTGAC GT CATATTATAAAAGTCACTTGGTTTGCGATACGTTCTTTCTAAGAAATAGCGACGTGCAATTTCATATT TT TTATAAACATCTGTTAAAAAGGACATAAAACCATGTGTTGAACCCGGTTCTATACTTTCTAGCATGTG CT GTAATTCAGCTAAATCTGTAGGCACCGTTATACAATCATCGCGGTCAAAATACACGTCGTAAATATA ACG TAATTGTCTCAATTCAATATAATCTTCATAATTTTTACCACACATTGTAAATACATCTTTATAAACATCT GGCATCATGACAATTGTGGGACCCATATCAAATGTAAAGCCGTCTTTCTTTAATTGATTCATACGCCC GC CTACATTTGTATTTTTTTCAAATATCGTCACTTCATGACCTTGAGAAGCAATACGGGCTGCCGCTGCT AA TCCTGTGACACCTGCACCAATTACTGCAATCTTCAT >CP006044.1:2680724-2682229 Staphylococcus aureus CA-347, complete genome CACGCCTTGCTCAATATCTTTAATTATTTCGTCTACAGTTATTTTCGCACTCGTTAAGACAATAGGAAC G CCTGCACCTGGATGCGTACTTGCACCTGCAAAATATAAATCTTTATAATCTCGCGATACATTTTGTGG AC GATAATAATTACTTTGCGATAAAGTTGGCATTAAACCGAATGCCGAACCAAATTTCGCATGATACGTT TG CTCAAAATCATTCGGCGTAAAGATGGTTTCCGATATAATATGCGATTTTATATCTTCAAATGCTTCAA TT GTTGCTAGTTTACGATAAATAACATCTTTTATTTGTTGTGTCAAAGCTTCATCTGACCAATCGATTCCG C TACCTGTTTTAAGTTCCGGAGTCGGCATTAACACATAAATACCAGTTTTGCCTTCTGGCGCAAGTGAT TT ATCAGCGACCGCTGGAACATACACATAAATAGAAGGATCATATGATAAACGTCCCTCAAATATTTCT TCA ATATTGCCTCTAAAATCATCTGAAAAAATAACATTATGAAGTCTCACTTGATCTGTCACATCAATATCT A TACCGATATACATTAAAAATGCTGAACAAGAGTAATCTAAGTCTGCAATTTTATGTGGTGGATACTTT TT AATAGGTGCAAAATCTGGCATTAATGATTCCGCAACACTAGGGAAATCAGCCGTACATAAAATTTTA TCA AATTTTCTTATGTCACGATTCACTTTTATCGCATCGGCCCTTTTGAATTTAGGATCAATAATAATTTGC T CAATTTCAGCATTAAGTTCAATATTAGCGCCTAAGTCTTTATTTAATTGTGCTAGCCCTTGAGCCATGC C ATACATACCGCCTTTAATAAAATGCACACCAAACATCATTTCAATCATAGGAATAATTGAATATAGTG AC GGGCCTCGTTTTGGATCAATTCCTATGTATAACGTTTGAAAGGCTAACAGTTTTTGTATTTTTTCATTA T CAATGTACTGCTCAATTAATTGATCTGCATGATTTAGAGTTTTTAATTTAGCACCTTGCACAAGTGAC GT CATATTATAAAAGTCACTTGGTTTGCGATACGTTCTTTCTAAGAAATAGCGACGTGCAATTTCATATT TT TTATAAACATCTGTTAAAAAGGACATAAAACCATGTGTTGAACCCGGTTCTATACTTTCTAGCATGTG CT GTAATTCAGCTAAATCTGTAGGCACCGTTATACAATCATCGCGGTCAAAATACACGTCGTAAATATA ACG TAATTGTCTCAATTCAATATAATCTTCATAATTTTTACCACACATTGTAAATACATCTTTATAAACATCT GGCATCATGACAATTGTGGGACCCATATCAAATGTAAAGCCGTCTTTCTTTAATTGATTCATACGCCC GC CTACATTTGTATTTTTTTCAAATATCGTCACTTCATGACCTTGAGAAGCAATACGGGCTGCCGCTGCT AA TCCTGTGACACCTGCACCAATTACTGCAATCTTCAT >CP047845.1:1727804-1729309 Staphylococcus aureus strain UP_591 chromosome, complete genome CACGCCTTGCTCAATATCTTTAATTATTTCGTCTACAGTTATTTTCGCACTCGTTAAGACAATAGGAAC G CCTGCACCTGGATGCGTACTTGCACCTGCAAAATATAAATCTTTATAATCTCGCGATACATTTTGTGG AC GATAATAATTACTTTGCGATAAAGTTGGCATTAAACCGAATGCCGAACCAAATTTCGCATGATACGTT TG CTCAAAATCATTCGGCGTAAAGATGGTTTCCGATATAATATGCGATTTTATATCTTCAAATGCTTCAA TT GTTGCTAGTTTACGATAAATAACATCTTTTATTTGTTGTGTCAAAGCTTCATCTGACCAATCGATTCCG C TACCTGTTTTAAGTTCCGGAGTCGGCATTAACACATAAATACCAGTTTTGCCTTCTGGCGCAAGTGAT TT ATCAGCGACCGCTGGAACATACACATAAATAGAAGGATCATATGATAAACGTCCCTCAAATATTTCT TCA ATATTGCCTCTAAAATCATCTGAAAAAATAACATTATGAAGTCTCACTTGATCTGTCACATCAATATCT A TACCGATATACATTAAAAATGCTGAACAAGAGTAATCTAAGTCTGCAATTTTATGTGGTGGATACTTT TT AATAGGTGCAAAATCTGGCATTAATGATTCCGCAACACTAGGGAAATCAGCCGTACATAAAATTTTA TCA AATTTTCTTATGTCACGATTCACTTTTATCGCATCGGCCCTTTTGAATTTAGGATCAATAATAATTTGC T CAATTTCAGCATTAAGTTCAATATTAACGCCTAAGTCTTTATTTAATTGTGCTAGCCCTTGAGCCATGC C ATACATACCGCCTTTAATAAAATGCACACCAAACATCATTTCAATCATAGGAATAATTGAATATAGTG AC GGGCCTCGTTTTGGATCAATTCCTATGTATAACGTTTGAAAGGCTAACAGTTTTTGTATTTTTTCATTA T CAATGTACTGCTCAATTAATTGATCTGCATGATTTAGAGTTTTTAATTTAGCACCTTGCACAAGTGAC GT CATATTATAAAAGTCACTTGGTTTGCGATACGTTCTTTCTAAGAAATAGCGACGTGCAATTTCATATT TT TTATAAACATCTGTTAAAAAGGACATAAAACCATGTGTTGAACCCGGTTCTATACTTTCTAGCATGTG CT GTAATTCAGCTAAATCTGTAGGCACCGTTATACAATCATCGCGGTCAAAATACACGTCGTAAATATA ACG TAATTGTCTCAATTCAATATAATCTTCATAATTTTTACCACACATTGTAAATACATCTTTATAAACATCT GGCATCATGACAATTGTGGGACCCATATCAAATGTAAAGCCGTCTTTCTTTAATTGATTCATACGCCC GC CTACATTTGTATTTTTTTCAAATATCGTCACTTCATGACCTTGAGAAGCAATACGGGCTGCCGCTGCT AA TCCTGTGACACCTGCACCAATTACTGCAATCTTCAT >CP047851.1:2641533-2643038 chromosome, complete genome Staphylococcus aureus strain UP_338 CACGCCTTGCTCAATATCTTTAATCATTTCATCTACAGTTATTTTCGCACTCGTTAAGACAATAGGAAC G CCTGCACCTGGATGCGTACTTGCACCTGCAAAATATAAATCTTTATAATCTCGCGATACATTTTGTGG AC GATAATAATTACTTTGCGCTAAAGTTGGCATTAAACCGAATGCCGAACCAAATTTCGCATGATACGTT TG CTCAAAATCATTTGGCGTAAAGATTGTTTCTGAAACAATATGCGATTTTATATCTTCAAATACTTCAAT A GTTGCTAATTTACGATAAATAACATCTTTTATTTGGTCTGTTAATGCTTCATCTGACCAATCGATTCCG C TACCTGTTTTAAGTTCTGGTGTTGGCATTAAAACATAAATACCTGTTTGTCCTTGTGGTGCAAGAGAT TT GTCAGCAACCGCAGGAACATACACATAAATAGAAGGATCATGCGATAATCGCCCTTCAAATATTTCT TCA ATGTTTCCTCTAAAATCATCTGCAAAAATAACATTATGAAGTCTCACTTGATCTGTCACATCAATATCT A TACCGATATACATTAAAAATGCTGAACAAGAGTAATCTAAGTCTGCAATTTTATGTGGTGGATACTTT TT AATAGGTGCAAAATCTGGCATTAATGATTCCGCAACACTAGGGAAATCAGCCGTACATAAAATTTTA TCA AATTTTCTTATGTCACCATTCACTTTTATCGCATCGGCTCGTTTGAATTTAGGATCAATAATAATTTGC T CAATTTCAGCATTAAGTTCAATATTAACGCCTAAATCTTTATTTAATTGCGCTAGCCCTTGAGCCATGC C ATACATACCGCCTTTAATAAAATGCACACCAAACATCATTTCAATCATAGGAATAATTGAATATAGTG AC GGGCCTCGTTTTGGATCAATTCCTATGTATAACGTTTGAAACGCTAAAAGCTTTTGTATCTTTTCGTTA T CAATATAATGTTCAATTAGCTGATCTGCATGATTTAACGTTTTTAACTTAGCACCTTGCACAAGTGAC GT CATATTATAAAAGTCACTTGGTTTGCGATACGTTCTTTCTAAGAAATAGCGACGTGCAATTTCATATT TT TTATAAACATCCGTTAAAAAGGACATAAAACCATGCGTTGAACCAGGTTCTATACTTTCTAGCATGTG CT GTAATTCAGCTAAATCTGTAGGCACCGTTATACAATCATCGCGGTCAAAATACACATCGTAAATATAA CG TAATTGTCTCAATTCAATATAATCTTCATAATTTTTACCACACATTGTAAATACATCTTTATAAACATCT GGCATCATGACAATTGTGGGGCCCATATCAAATGTAAAGCCATCTTTCTTTAATTGATTCATACGCCC GC CTACATTATTATTTTTTTCAAATATCGTCACTTCATGACCTTGAGAAGCAATACGGGCTGCCGCTGCTA A TCCTGTGACACCTGCACCAATCACTGCAATCTTCAT Bước 2: Tìm vùng bảo thủ: Vào trang web: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ «Enter or paste a set of» -> RNA «Sequences in any supported format» -> paste các chuỗi trình tự nucleotit ở trên. Click vào «submit» ở cuối Bước 3: Thiết kế mồi: ● Đăng nhập vào trang web: https://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi ● Sử dụng trình tự của chủng CP029080.1 là khuôn ảo. ● Chọn vùng bảo thủ để thiết thế mồi. ● Chọn trình tự mồi xuôi và mồi ngược có điều kiện thích hợp: ​Chiều dài đoạn mồi khoảng 18-24 bp, tỉ lệ GC khoảng 40-60%, 5 nucleotide đầu 3’ có ít nhất 2 C hoặc G. Kết quả thu được: Left primer: CGCGGTCAAAATACACGTCG Right primer: TGTCACAGGATTAGCAGCGG Bước 4: Kiểm tra chất lượng đoạn mồi bằng PCR ảo: ● Truy cập vào trang web: https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.html ● Chọn đoạn mồi xuôi, ngược vừa tìm được ở bước 3 vào nhận kết quả PCR. ● Kết quả PCR ảo: CGCGGTCAAAATACACGTCGTAAATATAACGTAATTGTCTCAATTCAATATAATCTTCAT AATTTTTACCACACATTGTAAATACATCTTTATAAACATCTGGCATCATGACAATTGTGG GACCCATATCAAATGTAAAGCCGTCTTTCTTTAATTGATTCATACGCCCGCCTACATTTG TATTTTTTTCAAATATCGTCACTTCATGACCTTGAGAAGCAATACGGGCTGCCGCTGCTA ATCCTGTGACA Bước 5: So sánh tương đồng của mạch ảo so với các chuỗi tương ứng lưu trữ trong ngân hàng gen ● So sánh kết quả PCR ảo với genome của chủng CP006044.1 ● So sánh kết quả PCR ảo với genome của loài khác (LAKG0100037.1) => Có sự tương đồng giữa trình tự kết quả PCR ảo với các chủng khác và các loài khác nhau. => Đoạn bảo thủ được lựa chọn là phù hợp. ● Quay lại BLAST định danh: - Truy cập NCBI => BLAST: Nucleotide => Protein - Chọn Per Ident cao nhất và E value thấp nhất để có sự tương đồng cao nhất. Chọn Protein có sự tương đồng cao nhất với mục tiêu. >SRC83945.1:10-92 Dehydrosqualene desaturase (Diapophytoene desaturase) (4,4-diapophytoene desaturase) [Staphylococcus aureus] VTGLAAAARIASQGHEVTIFEKNTNVGGRMNQLKKDGFTFDMGPTIVMMPDVYKDV FTMCGKNYEDYIELRQLRYIYDVYFDR Buổi 4: 1. Dự đoán pI, khối lượng phân tử: Dùng Expasy: ​https://www.expasy.org/proteomics => Proteomics => Compute pI/MW pI = 5,71 M = ​9568.96​ Da 2. Dự đoán chức năng : - Truy cập: https://www.uniprot.org/uniref/ - BLAST trình tự PCR ảo => Chọn Protein có độ tương đồng cao - Vào mục Funtion => Chức năng Protein: Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp carotene, có vai trò trong chức năng bảo vệ chống lại oxy hóa. Xúc tác ba phản ứng khử hydro để liên kết ba thành liên kết đôi (4,4'-diapophytoene (dehydrosqualene)), với 4,4'-diapophytofluene và 4,4'-diapo-zeta-carotene là chất trung gian và 4,4' 4'4-diaponeurosporene (sắc tố màu vàng đậm trong các chủng staphylococci) là sản phẩm cuối cùng. 3. Tìm vị trí Vào trang : ​http://phobius.sbc.su.se/cgi-bin/predict.pl =>> Enzyme ngoại bào Buổi 5: Cấu trúc không gian 3 chiều: - Sử dụng kết quả đã được BLAST. Tìm Region name. - Tìm Structure : COG1233 - Kết quả: - ​ ownload về máy => ​Sử dụng phần mềm Cn3D 4.3.1 => M ​ ở file D - Vào Style ​=> ​Coloring Shortcuts => Secondary Structure. -