Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực tập tại Viện. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đề tài tốt nghiệp mà còn là hành trang quý báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin.
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi
để tôi thực tập tại Viện. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi
trong suốt 4 năm học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong
quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đề tài tốt nghiệp
mà còn là hành trang quý báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự
tin.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Kim Dung – giảng
viên Viện CNSH Lâm nghiệp đã tận tình định hướng và hướng dẫn tôi trong
suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin kính chúc các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh
học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt được
nhiều thành công trong cuộc sống cũng như trong sự nghiệp nghiên cứu và giảng
dạy.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Giáo viên hướng dẫn
TS. Vũ Kim Dung
123doc : Tài Liệu IT
Sinh viên thực hiện
Tài Liệu IT
1
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU......................................2
1.1. Tổng quan về enzyme pectinase.................................................................2
1.1.1. Cơ chất pectin..........................................................................................2
1.1.2. Hệ Enzyme Pectinase...............................................................................3
CHƯƠNG 2MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....25
2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................25
2.2. Nội dung nghiên cứu.................................................................................25
2.3. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................25
2.3.1. Vật liệu..................................................................................................25
2.3.2. Hóa chất.................................................................................................25
2.3.3. Thiết bị...................................................................................................25
2.3.4. Môi trường nuôi cấy..............................................................................26
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................26
CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.........................................................31
3.1. Hoạt hóa chủng nấm mốc A.niger CF2...................................................31
3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp pectinase...31
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng pectin..........................................................31
3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường.........................................................32
3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ........................................................................33
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian lên men..........................................................34
3.3. Đặc tính của peptinase từ chủng A. niger CF2.........................................36
3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền enzyme............................36
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền enzyme.....................37
123doc : Tài Liệu IT
2
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
3.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme..............................39
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................41
4.1. Kết luận....................................................................................................41
4.2. Kiến nghị...................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
123doc : Tài Liệu IT
3
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase.................................................................4
Bảng 1.2: Tỉ lệ ứng dụng của các loại enzyme trong công nghiệp.....................20
Bảng 1.3: Giá trị kinh tế của các loại enzyme....................................................20
123doc : Tài Liệu IT
4
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của peptin...............................................................3
Hình 1.2: Sơ đồ tinh sạch enzyme từ canh trường nấm mốc...........................16
Hình 1.3: Hình ảnh nấm Aspergillus niger......................................................22
Hình 2.1: Môi trường lên men trước khi được bổ sung dịch khoáng..............27
Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn monogalacturonan..........................................29
Hình 3.1: A. niger sau 3 ngày nuôi cấy trong tủ ấm ở 30oC............................31
Hình 3.2: Ảnh hưởng của pectin đến hoạt độ pectinase..................................31
Hình 3.3: Hỗn hợp (enzyme thu được + pectin 1%) trước khi đo OD
.........................................................................................................................32
Hình 3.4: Ảnh hưởng của độ ẩm đến pectinase từ chủng A.niger CF2...........33
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzyme...................34
Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp
pectinase của A.niger CF2...............................................................................34
Hình 3.7: Môi trường lên men thu enzyme pectinase sau 3,5 và 7 ngày........35
Hình 3.8: Hỗn hợp dung dịch (enzyme thu được + pectin 1%) sau 3, 5 ngày 35
Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme pectinase từ A.niger CF2 36
Hình 3.10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của pectinase từ A. niger CF2.....37
Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ peptinase từ A. niger CF2. .38
Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền pectinase từ chủng A.niger
CF2..................................................................................................................39
Hình 3.13: Ảnh hưởng của tính ion kim loại đến hoạt độ enzyme..................40
123doc : Tài Liệu IT
5
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
ĐẶT VẤN ĐỀ
Enzyme pectinase bao gồm nhiều loại enzyme khácnhaunhư
polygalacturonase, pectinesterase, pectolyase,… xúc tácthủyphân các phân tử
pectin tạo các sản phẩm khác nhau. Ban đầu, enzyme này được phát hiện
trong các dịch chiết trái cây như cà rốt, cà chua hay đại mạch. Đặc biệt phải
kể đến là phát hiện của nhà khoa học người Italia Enrico Fermi năm 1840 trên
đối tượng cà rốt.
Với vai trò quan trọng, pectinase được sử dụng rộng rãi, đem lại lợi ích
khá lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp nhẹ. Trước đây
nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật. Ngày nay, người ta
đã nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú, đa dạng và
mang lại lợi ích kinh tế. Một đặc điểm nổi bật của pectinase là các enzyme
này được dùng không giới hạn trong thực phẩm vì không ảnh hưởng đến sức
khỏe con người. Bằng ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh trưởng và phát triển
nhanh,cho nhiều enzyme trong một thời gian ngắn, vi sinh vật là lựa chọn
hàng đầu của các nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành,
tăng năng suất sản xuất lên cao nhất. Sự sản xuất pectinase quy mô công
nghiệp được thực hiện chủ yếu từ Aspergillus niger(Yogesh, 2009).
Trên cơ sở đó, mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu các điều kiện thích
hợp sinh tổng hợp pectinase từ Aspergillus niger CF2”góp phần nghiên
cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên men nhằm tăng hiệu suất
quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme pectinase từ đó phục vụ nhu cầu sản
xuất trong nước và mang lại giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp.
1
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về enzyme pectinase
1.1.1. Cơ chất pectin
Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, được cấu tạo từ các acid
galacturonic bằng liên kết -1,4 glucoside. Tùy nguồn pectin khác nhau mà
pectin có khối lượng phân tử 80.000 200.000 Da.
Pectin tan trong nước ammoniac, dung dịch kiềm, carbonatte natri,
glycerine nóng.
Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kết
với các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không
tan. Chúng ta có thể phân hủy các protopectin không tan trong tế bào thành
các pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid,
vì vậy các pectin tan này không đồng dạng vớinhau.
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng:
- Pectin hòa tan: là ester methylic của polygalacturonic acid, trong tự
nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester
hóa bằng methanol. Pectin được ester hóa cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch
acid và trong dung dịch đường có nồng độ 65%. Enzyme pectinase tác động
lên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học
không đồng dạng. Cấu trúc hóa học cơ bản của pectin là -D-galacturonan
hay -D-galacturoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vị Dgalactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu -1,4). Mặt khác, mức độ oxy
hóa trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định
các nhóm carboxyl bị ester hóa bởi các nhóm methoxyl. Trong một số trường
hợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường có sự ester hóa giữa các nhóm
carboxyl và các nhóm acetyl.
2
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
- Pectin acid: là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm
carboxyl được ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic acid.
Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vị
galacturonic acid. Pectate là muối của pectic acid.
- Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có
cấu tạo hóa học phức tạp. Trong protopectin có các phân tử pectin, các phân
tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+ các gốc phosphoric acid, acetic acid và
đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng ra pectin hòa
tan.
1.1.2. Hệ Enzyme Pectinase
1.1.2.1. Giới thiệu enzyme pectinase
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer
pectin và sản phẩm của quá trình này là acid galacturonic, galactose,
arabinose, methanol,… đây là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease. Sự phân hủy pectin trong tự
nhiên thường xảy ra khi trái cây chín.Những enzyme này vì vậy có một vai
trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả.
Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của peptin
1.1.2.2. Phân loại
Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng như
bảng 1.1.
3
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
- Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl
ester. Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị
galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy
(COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc
acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có
giá trị pH tối ưu khác nhau. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion
Ca2+ và Mg2+.
Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase
STT
1
Enzym (tên gọi theo
hệ thống)
Pectinpectinhydrolase
2
Poly--1,4
galacturonid-glycano
hydrolase-PG
3
Poly--1,4-Dgalacturonidgalacturo
n-hydrolase
4
Poly--1,4-Dgalacturonidmetilester
-glycanohydrolase
5
Poly--1,4-Dgalacturonid
digalacturonoliase
6
Poly--1,4-Dgalacturonid
glicanoliase
7
Poly--1,4-Dgalacturonid
Enzym(tên
thường gọi)
Phản ứng xúc tác
Pectin + H2O = n metanol +
pectic acid
Thủy phân liên kết -1,4-DEndopoly
galacturonid trong
galacturonase
galacturonid không theo một
(endo-PG)
trật tự nào
Thủy phân liên kết -1,4-DExopoly
galacturonid trong pectat,
galacturonase
trong galacturonic với sự
(exo-PG)
đứt mạch của acid
galacturonic
Thủy phân liên kết -1,4-DEndopolymetilgalacturonid trong pectin
galacturonase
không theo một trật tự nhất
(Endo-PMG)
định.
Thủy phân liên kết -1,4-Dgalacturonid trong pectat với
Exo-pectatliase
sự tạo thành -4,5
(exo-PKTE)
aciddegalacturonic không
theo một trật tự nhất định.
Thủy phân liên kết -1,4-Dgalacturonid trong pectat,
Endopectatlias
trong galacturonic với sự tạo
e (PETE)
thành nối đôi không theo
một trật tự nhất định
Endopectinlias Thủy phân liên kết -1,4-De (Endo-PTE)
galacturonid trong pectin
pectinesterase
4
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
với sự tạo thành nối đôi
không theo một trật tự nhất
định
- Polygalacturonase (PG): còn có tên gọi khác là poly 1,4metylester
glicanoliase
galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết -1,4glycoside. Các exo-PG (exo-poly -1,4-D-galacturonide) galacturonohydrolase,
phân cắt từ đầu không khử, và endo-PG (endo- poly -1,4-D-galacturonide)
glycanohydrolase tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase
là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối
với cơ chất.
- Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate
không không bị ester hóa. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-poly (1,4--Dgalacturonide)lyase) và endo-PEL (endo-poly (1,4--D-galacturonic) lyase)
đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp
cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa
nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động. Pectate lyase
không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các
enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình
gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và
làm mục mô thực vật.
Ngoài ra còn có:
- Pectin-transeliminase (poly 1,4--galaturonid-methylesteglucanolise)
là enzyme tác dụng lên pectin và pectinic acid.
- Polygalactorunate-transeliminase (poly1,4-- galaturonid–
glucanoliase) là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid.
- Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã
bị ester hóa. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme.
1.1.2.3. Ứng dụng của enzyme pectinase
5
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
- Trong sản xuất thực phẩm, người ta sử dụng các chế phẩm pectinase
duới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường
nấm mốc sấy khô. Tỉ lệ chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu
đem chế biến vào khoảng từ 0,03- 0,05 đến 0,10%.
- Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các
nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách hiệu quả. Nhờ
tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và dịch lọc quả rất dễ
dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu
nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép tới 15 – 25%. Bởi lẽ
khi có pectinase phân giải các chất pectinase mà dịch quả trong suốt không bị
đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy, enzyme pectinase còn góp phần
chiết rút được các chất màu, tannin và những chất hoà tan nữa, do đó làm tăng
thêm chất lượng thành phẩm.
- Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng một
trong sáu nhóm enzyme sau:
Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả đục. Mục đích
sử dụng nhóm chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly để thu
được luợng sản phẩm lớn.
Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả trong, không
chứa pectin. Mục đích sử dụng nhóm này là làm tăng hiệu suất trích ly và
thuỷ phân hoàn toàn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt
tiêu nguyên nhân làm đục nước quả.
Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hoá nước
quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả.
Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản suất bán sản phẩm rượu vang
nhằm làm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm.
6
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
Nhóm chế phẩm enzyme dùng để ngăn cản quá trình oxy hoá và làm
cản trở sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả, trong
rượu vang.
Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại đường trong
sản suất siro thành phẩm.
Việc sử dụng các chế phẩm enzyme phải được xem xét kỹ lưỡng trên
cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý. Trong các đặc điểm của trái
cây, người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản
phẩm.Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng enzyme phải đảm bảo giữ được
màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc theoý muốn bằng cách
điều khiển những phản ứng enzyme. Theo màu sắc tự nhiên, các loại trái cây
được chia làm hai loại:
Trái cây có màu nhạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam, xoài, bưởi…
Trái cây có màu sẫm do chứa nhiều antoxian: anh đào, mận đỏ, nho
đỏ, mận đen, dâu…
Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, người ta thường sử dụng một loạt
các enzyme sau:
- Enzym endo-PmG để làm giảm độ nhớt của dịch quả.
- Enzyme PE làm tăng hiệu suất trích ly
- Enzyme khác như cellulose, hemicelluase, protease không bắt buộc.
1.1.2.3.1. Làm trong nước quả
- Việc ứng dụng pectinase để thu nhận nước quả được áp dụng lần đầu
tiên vào năm 1930. Từ đó đến nay việc áp dụng enzyme này đã trở nên rất
phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay
chủ yếu bằng phương pháp ép. Syrup quả nhanh đóng cục là do chứa 1 hàm
lượng pectine đáng kể. Qua phân tích hàm lượng pectinase trong 1 số quả như
sau:
•Syrup mơ: 0,107%
7
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
•Syrup mận: 0,153%
•Nước mận: 0,452%
Lượng pectin này làm cho syrup quả bị keo và đục, có độ nhớt cao,
nhất là khi quả có độ acid và hàm lượng đường cao như các lọai syrup kể trên
- Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì chế phẩm thì
pectinase
phải
có
enzym
endo
và
exo-polygalacturonase,
enzym
pectinestenase. Trong chế phẩm loại này thì những enzym vừa kể trên là
những enzym quyết định hiệu quả của chế phẩm. Vì endo và exopolygalacturonase sẽ làm giảm độ nhớt của dịch quả, còn enzyme PE cũng
góp phần vào tác dụng của enzym này. Enzym proteinase của chế phẩm sẽ
thuỷ phân vỏ protein của vỏ nguyên sinh tế bào, kết quả là làm cho sự thoát
của dịch quả dễ dàng. Sự có mặt của cellulase và hemicellulase ở trong chế
phẩm cũng tốt nhưng không bắt buộc. Khi sử dụng cho các loại quả như táo,
lê thì trong chế phẩm không được phép có enzyme pectinaseliminase và
enzym này sẽ phân huỷ protopectin vốn gắn các tế bào riêng biệt của mô quả
lại với nhau, do đó gây mủn hoá mô quả, làm tăng độ nhớt của dịch quả và
kết quả là làm giảm hiệu suất dịch quả. Ngược lại, khi sử dụng cho các loại
quả mọng như dâu tây thì sự có mặt trong chế phẩm enzym PTE lại cần thiết
vì enzym này sẽ làm mủn hoá tế bào làm cho tính chất thoát nước của tế bào
tăng lên còn độ nhớt của dịch quả lại giảm xuống.
Ngoài ra, đối với các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất nước quả
trong cũng không được phép có các enzym oxidase (ascohatoxydase,
poliphenoloxydase).
Trong chế biến nước quả có thịt thì các enzym PTE, hemicellulase và
cellulase lại là những enzym quyết định hiệu quả tác dụng của chế
phẩm.Trong đó vai trò dẫn động là enzym PTE có tác dụng phân huỷ
protopectin của mô quả. Hemicellulase và cellulase sẽ cùng với PTE làm cho
độ đồng thể của nước quả có màu sáng thì trong chế phẩm không chứa enzym
8
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
oxi hoá, còn cho các nguyên liệu có carotenoid và antoxian thì không chứa
enzym phá huỷ các chất này.
Để thu được nước quả, trong trường hợp có sử dụng enzym pectinase,
người ta cũng phải nghiền nhỏ nguyên liệu quả. Bã nghiền nhanh được đem
xử lý bằng enzym, sau đó mới đem ép hoặc ly tâm. Trong trường hợp có sử
dụng enzyme, người ta có thê nghiền nhỏ tới mức tối đa, cốt sao thuận lợi cho
tác dụng của enzym mà không sợ bị tắc nghẽn kênh dẫn dịch quả trong quá
trình ép sau này.
Dùng pectinase không chỉ làm tăng hiệu suất dịch quả mà còn để làm
trong dịch quả. Phương pháp sử dụng enzym có hiệu quả hơn cả. Bởi lẽ nhờ
tác dụng của các enzyme mà các hệ keo của nước quả sẽ bị phá huỷ hoàn
toàn. Nếu như khi làm trong bằng các phương pháp khác pectin bị kết tủa một
phần thì khi xử lý bằng pectinase, pectin bị phân giải hoàn toàn thành các chất
hoà tan.
Với phương pháp enzym, khi mang một lượng thừa chế phẩm sẽ loại
trừ được trường hợp làm trong không hoàn toàn.
Dịch nước quả được xử lý bằng chế phẩm pectinase thường có vị hoàn
toàn hơn và ít có khuynh hướng bị đục hơn.
Quá trình làm trong dịch quả dưới tác dụng của pectinase có thể
chia làm 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn “bất ổn định hoá” được tiêu biểu bằng sự giảm độ nhớt một
cách sâu sắc và thường được gọi là trạng thái “phá vỡ”
+ Giai đoạn “kết lắng” bắt đầu từ trạng thái “phá vỡ” và kết thúc khi
kết tủa hoàn toàn.
+ Giai đoạn cuối cùng thường được xác định bằng sự vắng mặt các
pectin kết tủa bởi ion canxi
- Để làm trong nước trong quả nên sử dụng chế phẩm enzyme có hoạt
độ 1,950 đvhđ/1g canh trường (theo phương pháp Cu-pectat) hoặc 0,768
9
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
đvhđ/1g canh trường (theo phương pháp so màu). Dưới tác dụng của
pectinase, pectine - một polysacharide được tạo thành từ sự liên kết giữa các
mạch của phân tử acid galacturonic (C 6H10O7) mà một phần đã được este hoá
với rượu metylic (CH3OH) bị phân huỷ hoặc bị phân cắt liên kết glucozic.
Pectine là 1 chất điện ly cao phân tử (polime) mang điện tích âm (-) dọc theo
chiều dài của mạch phân tử có sự sắp xếp các nhóm điện tích cùng dấu (COO-) nên mạch có xu hướng duỗi thẳng tạo nên bề mặt hấp phụ lớn trong
toàn bộ dung dịch có chứa pectin. Nước quả đục là hệ huyền phù trong đó
phần tử thịt quả có kích thước nhỏ, bề mặt riêng lớn và có năng lượng rất lớn
nên không bền vững về mặt nhiệt động học. Mặt khác, chúng là những phân
tử tích điện nên dưới tác dụng của lực hút phân tử chúng liên kết lại tạo thành
những phân tử lớn dễ dàng lắng xuống. Trong nước quả, sự có mặt của hợp
chất polyphenol (đặc biệt là tanin) tạo nên với pectine những kết tủa không
tan v.v... Sự có mặt của pectinase sẽ thúc đẩy nhanh quá trình cơ bản nêu trên.
Xác định giá trị mật độ quang OD (Optical Density) ở λ = 600 nm theo thời
gian để so sánh tốc độ lắng thịt quả giữa các mẫu.
- Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90-95%. Nếu ta chỉ nghiền
sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60-70% là tối đa. Khi ta cho
pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15-30%. Nhiều trường hợp, hiệu suất ép
tăng đến 50%. Liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho vào là 0,030,05% hoặc chế phẩm thô là 0,5 – 2%. Nhiệt độ duy trì cho quá trình thuỷ
phân là 43 – 45%.Thời gian thuỷ phân là 4 – 8 giờ. Dịch quả thu được bằng
pectinase sẽ trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh tế thấy rõ.
1.1.2.3.2. Trong sản xuất rượu vang
Giúp cải thiện kết tủa màu và ổn định các loại rượu vang đỏ. Enzyme
pectin được thêm vào các loại trái cây trước khi bổ sung các men rượu trong
quá trình sản xuất rượu vang đỏ để cải thiện màu sắc và độ đục. Rượu vang
đỏ được bổ sung enzym có màu sắc tốt hơn so với các loại rượu vang không
10
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
được bổ sung enzyme. Những loại rượu này cũng cho thấy sự ổn định lớn hơn
so với các loại rượu vang không được bổ sung enzyme.
1.1.2.4. Một số phương pháp sản xuất enzyme pectinase
1.1.2.4.1. Nguồn gốc thu nhận
Từ vi sinh vật: Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme
thì ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú. Vi sinh vật phân giải
pectine hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:
Nấm mốc: A.niger, A.oryase, A.terreus, A.saito, A.japonicus…
Nấm men: S.ellipsoideus, S.fragilis, S.ludwigii …
Vi khuẩn: B.polymixa, B.felseneus, Clostridium roseum…
1.1.2.4.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Quy trình sản xuất
Môi trường
Dụng cụ nuôi cấấy
Hấấp khử trùng
Hấấp khử trùng
Để nguội
Để nguội
Phôấi vào dụng cụ
Cấấy vào môi trường
Nuôi cấấy trong 36
giờ
11
Thu nhận enzyme
Nhấn giôấng
Giôấng vi sinhvật
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
12
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
Thuyết minh quy trình:
Môi trường nuôi cấy
Là môi trường rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô
mảnh, bột đậu tương… pha thêm muối khoáng. Môi trường rắn thường dùng
nhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng
và khi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra
nhiều enzyme. Có thể bổ sung những thành phần giàu pectin như bã củ cải
đường, bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được hàm lượng pectinase cao.
Bên cạnh đó, chúng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo môi trường thoáng khí
tốt, giúp cho sự phát triển của nấm. Vậy môi trường hoàn chỉnh để nuôi cấy
gồm có: 70% cám mì + 23% trấu + 5% chất cảm ứng + chất dinh dưỡng khác
(mầm mạ, nước khoai tây… để cung cấp thêm nguồn nitơ, photphat, kali…).
Môi trường rắn cần được làm ẩm đến khoảng 60%, nếu độ ẩm quá cao thì
nhiều loại vi khuẩn phát triển gây tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môi
trường nhanh khô, sinh bào tử mạnh.
Nuôi cấy: Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng
nuôi có sẵn các giá.
Dụng cụ: Dụng cụ và môi trường cần được khử trùng ở
1210C/1atm/30 phút để tránh tạp nhiễm.
Để nguội, phối vào dụng cụ: Môi trường được trải mỏng ra các khay
đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2 – 2,5cm và để nguội đến 30 0C thì
tiến hành cấy giống.
Giống
Nấm mốc được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô trùng để tránh
nhiễm tạp. Giống được nhân theo phương pháp bề mặt và cũng trên môi
trường trên để giống quen với điều kiện sản xuất. Khi nhân giống thường để
cho nấm mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào tử được thu theo
phương pháp tách bào tử khỏi môi trường và chứa trong các bình có nút kín.
13
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
Tỉ lệ nhân giống vào khoảng 0,2 – 2%. Mỗi gam bào tử mốc có thể cấy vào
10kg môi trường.
Nuôi cấy
Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn
các giá. Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thổi gió.
Nhiệt độ thích hợp với đa số mốc là 30-32 0C. Nếu nhiệt độ xuống dưới 240C
thì nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài như vậy
sẽ làm giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme.
Quá trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia thành 3
giai đoạn:
Giai đoạn 1: Khoảng 10 – 14 giờ đầu: giai đoạn này có những thay
đổi sau:
Bào tử nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa.
Bắt đầu hình thành enzym, không đòi hỏi phải thông khí nhiều chỉ
cần làm thoáng khoảng 2 – 3 thể tích không khí / thể tích phòng / giờ.
Khối môi trường còn rời rạc, các thành phần dinh dưỡng bắt đầu có
sự thay đổi.
Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 14 – 18 giờ: giai đoạn này có những
thay đổi sau:
Mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát bằng mắt
thường, lúc đầu là lớp lông tơ màu trắng – xám và ngày càng rõ, làm môi
trường kết bánh lại, độ ẩm môi trường giảm dần. Các chất dinh dưỡng trong
môi trường tiêu hao nhanh để phục vụ cho các quá trình trao đổi chất trong tế
bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80 – 90kcal/giờ.
Làm nhiệt độ môi trường tăng lên 40 0 - 450C. Thời kì này cần phải thông khí
mạnh tới 60 thể tích khí/1thể tích phòng/giờ để cung cấp O 2 cho mốc thở và
đuổi CO2 ra khởi môi trường, đồng thời làm giảm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt
14
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2
độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần giữ ở 28 - 30 0 C và độ ẩm trong phòng
khoảng 90%.
Các loại enzyme được hình thành trong giai đoạn này, pectinase được
hình thành nhiều nhất vì có cơ chất cảm ứng.
Giai đoạn 3: kéo dài trong khoảng 10 – 20giờ: giai đoạn này có
những biến đổi
Quá trình trao đổi chất yếu dần vì do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng
sẽ chậm lại. Lượng nhiệt tạo ra giảm, khoảng 15 – 30kcal/kg/giờ.Thông khí
không quá 20 – 25 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ buồng
nuôi duy trì ở 300C.
Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian nuôi cấy
có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa, enzyme vẫn được
hình thành ở giai đoạn này.
Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiền
nhỏ, đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm. Sản phẩm này là chế
phẩm enzyme thô.
1.1.2.4.3. Thu nhận enzyme
a. Phương pháp thu nhận
Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có
phương pháp tách và thu nhận riêng:
Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi
trường nuôi cấy ngoài tế bào, thường hoà tan trong nước do đó dễ trích ly và
tinh sạch.
Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh
vật và không được tiết ra môi trường bên ngoài. Những tế bào vi sinh vật sau
khi được nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào. Mục đích của việc này là
giải phóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm cả enzyme nội bào. Hỗn hợp
thu được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử lượng lớn; còn
15
- Xem thêm -