Tài liệu định lượng iridoid trong ba kích tím quảng ninh

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LÝ MSV: 1301264 ĐỊNH LƯỢNG IRIDOID TRONG BA KÍCH TÍM QUẢNG NINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LÝ MSV: 1301264 ĐỊNH LƯỢNG IRIDOID TRONG BA KÍCH TÍM QUẢNG NINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Thị Kim Vân 2. ThS. Tống Thị Thanh Vượng Nơi thực hiện: 1. Viện Dược liệu 2. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc đến TS Lê Thị Kim Vân - Phó trưởng Khoa Bào chế Viện Dược liệu, ThS Tống Thị Thanh Vượng, giảng viên tại Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian, công sức, tâm huyết và sự kiên nhẫn giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội đặc biệt là các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa phân tích - Độc chất đã trực tiếp giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Hoàng Lê Sơn, DS Nguyễn Thị Lê cùng các anh chị trong Khoa Bào chế, Khoa Phân tích, Khoa Chiết xuất, Khoa Dược lý cùng toàn thể các anh chị trong Viện Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ, kiên nhẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành khóa luận. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua. Hà Nội ngày 18, tháng 5, năm 2018. Nguyễn Thị Lý MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Ba kích ................................................................................................................3 1.1.1. Tên khoa học ..................................................................................................3 1.1.2. Mô tả thực vật ................................................................................................ 3 1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến ..........................................................................3 1.1.4. Tác dụng dược lý của ba kích ........................................................................4 1.1.5. Công dụng, liều dùng, kiêng kị ......................................................................5 1.1.6. Thành phần hóa học trong ba kích ................................................................ 6 1.2. Nhóm hoạt chất iridoid. ......................................................................................6 1.2.1. Định nghĩa ......................................................................................................6 1.2.2. Cấu trúc hoá học ............................................................................................7 1.2.3. Phân loại ........................................................................................................8 1.2.4. Tính chất.........................................................................................................8 1.2.5. Định tính.........................................................................................................8 1.3. Tình hình nghiên cứu về nhóm chất iridoid trong ba kích trên thế giới và tại Việt Nam 1.3.1. Monotropein ...................................................................................................9 1.3.2. Asperuloside .................................................................................................12 1.4. Một số phương pháp hóa lý sử dụng ................................................................ 13 1.4.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................................13 1.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............................................................. 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................15 2.2. Phương tiện nghiên cứu ....................................................................................15 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ ...........................................................................................15 2.2.2. Dung môi, hóa chất ......................................................................................15 2.3. Phương pháp nghiên cứu. .................................................................................16 2.3.1. Tối ưu quy trình chiết xuất iridoid từ rễ cây ba kích tím Quảng Ninh. .......16 2.3.2. Khảo sát điều kiện HPLC trong định lượng iridoid ....................................17 2.3.3. Khảo sát độ ổn định của chất chuẩn........................................................................17 2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích .............................................................. 17 2.3.5. Phương pháp xứ lý số liệu............................................................................18 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Quy trình chiết xuất iridoid từ rễ cây ba kích tím Quảng Ninh ........................19 3.1.1. Chuẩn bị dược liệu .......................................................................................19 3.1.2. Chiết xuất iridoid ........................................................................................19 3.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC .....................................................................19 3.2.1. Cố định thông số ..........................................................................................19 3.2.2. Tiến hành khảo sát các thông số thay đổi ....................................................19 3.2.3. Kết quả .........................................................................................................19 3.2.4. Kết luận ........................................................................................................24 3.3. Khảo sát độ ổn định của monotropein và asperuloside. ...................................25 3.4. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích monotropein trong ba kích tím Quảng Ninh ................................................................................................................26 3.4.1. Chuẩn bị mẫu ............................................................................................... 26 3.4.2. Lựa chọn điều kiện chạy HPLC. ..................................................................26 3.4.3. Thẩm định phương pháp định lượng motropein trong ba kích tím Quảng Ninh. .......................................................................................................................28 3.5. Bàn luận ............................................................................................................32 3.5.1. Phương pháp xử lý mẫu dược liệu ............................................................... 32 3.5.2. Khảo sát độ ổn định của 2 chất chuẩn monotropein và asperuloside trong nghiên cứu. .............................................................................................................33 3.5.3. Khảo sát điều kiện chạy HPLC xây dựng phương pháp định lượng iridoid trong ba kích tím Quảng Ninh................................................................................33 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết quả ..............................................................................................................35 4.2. Kiến nghị...........................................................................................................35 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril ATTP An toàn thực phẩm DĐVN Dược điển Việt Nam DAD Diod Array Detector GLP Good Laboratory Practice HPLC High performance liquid chromatography LOD Limit of Detection LOQ Limit of Qualification MS Mass Spectromecy UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography PA Pure Analysis UV - VIS Ultraviolet Visible RP Reverse Phase RSD Relative Standard Deviation Rf Retention Factor SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Thin Layer Chromatography VDL Viện Dược liệu YHCT Y học cổ truyền DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng Nội dung Trang 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu. 16 3.1 Kết quả khảo sát pha động của 2 chất chuẩn. 21 3.2 Kết quả khảo sát pha động hệ 5, 6, 7. 23 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng acid đến SKĐ của hỗn hợp chuẩn. 24 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng tốc độ dòng đến thời gian lưu của monotropein. 27 3.5 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký. 29 3.6 Kết quả khảo sát độ tuyến tính. 30 3.7 Kết quả khảo sát độ lặp lại. 31 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng. 32 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ. Hình Nội dung Trang 1.1 Rễ cây ba kích tím Quảng Ninh sau khi chế biến. 4 1.2 Cấu trúc hóa học của một số chất chiết từ ba kích. 6 1.3 Cấu trúc hóa học khung cơ bản của iridoid. 7 3.1 Kết quả định tính iridoid bằng phản ứng hóa học. 19 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 Phổ UV - VIS của monotropein (bên trái) và asperuloside (bên phải). Kết quả SKĐ của monotropein khảo sát hệ 5. SKĐ khảo sát độ ổn định của hỗn hợp chuẩn monotropein và asperuloside. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic monotropein. 20 22 25 28 30 ĐẶT VẤN ĐỀ Dược liệu là một nguồn cung cấp các hoạt chất quý giá có tác dụng chữa bệnh bên cạnh thuốc có nguồn gốc hóa dược. Sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược có xu hướng ngày càng gia tăng mạnh trên thế giới trong vài chục năm trở lại. Ngoài ra, thị trường thực phẩm chức năng có nguồn gốc dược liệu đã và đang phát triển mạnh mẽ. Dược liệu đang là đối tượng được nghiên cứu rộng rãi trong thời gian gần đây. Tuy nhiên dược liệu dùng làm thuốc hoặc thực phẩm chức năng thường có nguồn gốc phức tạp, số lượng lớn, khó tiêu chuẩn hóa vì vậy thường xuất hiện các dược liệu giả mạo hoặc kém chất lượng lưu hành trên thị trường ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân. Việt Nam là một trong những quốc gia châu Á bên cạnh Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, có nền YHCT phát triển từ lâu đời với những nguyên tắc và lý luận chặt chẽ. Do điều kiện địa lý và khí hậu, nước ta có nguồn dược liệu đa dạng và phong phú với những vùng trồng dược liệu nổi tiếng. Trong đó, ba kích là một dược liệu có những đặc tính quý giá, đã được sử dụng trong nền YHCT dân tộc với công dụng làm tăng sức dẻo dai, tăng sức đề kháng, chống viêm và tăng cường khả năng sinh dục. Ở nước ta, ba kích tím Quảng Ninh nổi tiếng vì chất lượng và hàm lượng hoạt chất cao. Do có giá trị y học, giá trị kinh tế cao nên việc xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho ba kích là hết sức quan trọng để tránh giả mạo. Ba kích có 3 thành phần chính là anthraquinone, iridoid, polylosaccharide. Tiêu chuẩn hóa dược liệu ba kích bằng cách định lượng các hoạt chất chính có trong dược liệu. Iridoid là một trong những nhóm hoạt chất chính trong ba kích với hàm lượng cao và những tác dụng dược lý đã được nghiên cứu và công bố [9], [10], [13], [16], [19], [26]. Trong iridoid có 2 hoạt chất với hàm lượng lớn là monotropein được biết đến với tác dụng chống viêm [9], chống stress oxy hóa [18], chống loãng xương [22] và asperuloside được biết đến với tác dụng chống béo phì [11]. Trên thế giới có khá nhiều công trình nghiên cứu và định lượng monotropein trong ba kích nhưng có rất ít các báo cáo nghiên cứu định lượng về asperuloside [20], [23], [24]. Ở Việt Nam , việc nghiên cứu về nhóm iridoid trong ba kích còn hạn chế. Xuất phát từ nhu cầu xây dựng công tác tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Định lượng iridoid trong ba kích tím Quảng Ninh”, với 2 mục tiêu chính sau: 1 - Nghiên cứu độ ổn định của 2 chất chuẩn monotropein và asperuloside dùng trong phân tích. - Thẩm định quy trình định lượng iridoid trong ba kích tím Quảng Ninh. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Ba kích 1.1.1. Tên khoa học Cây ba kích có tên khoa học: Morinda officinalis How, họ Cà phê (Rubiaceae) [2], [3]. Một số tên gọi khác: Ba kích thiên, dây ruột già, chẩu phóng xì (Hải Ninh), thau tày cáy (Tày) [2], [3]. Vị ba kích là rễ rút lõi, phơi hay sấy khô của cây ba kích có tên khoa học là Radix Morinda [1], [2], [3]. 1.1.2. Mô tả thực vật Cây ba kích là một cây thân thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn, dài hàng mét. Thân non màu tím, có lông, mặt sau nhẵn. Cành non có cạnh. Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài 6 - 14 cm, rộng 2,5 - 6 cm, cuống ngắn, lúc non có lông dày hơn ở mặt dưới, thường tập trung ở các gân dưới mép lá, màu xanh lục, sau già lá ít lông hơn, lá mỏng kèm, ôm sát vào thân. Hoa nhỏ, màu trắng hoặc hơi vàng, tập trung thành tán ở đầu cành, dài 0,8 - 1,5 cm; đài hoa hình chén hay hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển không đều; tràng hoa hàn liền ở phía dưới thành ống ngắn, nhị 4, bầu hạ. Quả hình cầu, rời nhau hoặc dính liền thành khối, khi chín màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh. Cây ba kích ra hoa thường vào tháng 5 – 6 [1], [2]. 1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến - Phân bố: Trên thế giới, cây ba kích phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Cây mọc nhiều ở Trung Quốc, Hàn Quốc...[21]. Ở Việt Nam, cây mọc hoang và được trồng nhiều ở Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Bắc Giang [1], [3]. - Thu hái: Bộ phận dùng là rễ được rút lõi, thu hoạch quanh năm nhưng tốt nhất vào mùa đông. Rễ dài 10 - 20 cm, đường kính 0,7 - 1,4 cm trở lên. Vỏ ngoài màu nâu, trên mặt có nhiều vân dọc. Thịt rễ màu hồng tím, vị hơi ngọt. Loại rễ to, thịt màu tím là chất lượng nhất tốt [1], [2]. - Chế biến: Rễ sau khi đào, rửa sạch đất cát, phơi hay sấy. Khi gần khô người ta đập dẹp rồi lại phơi lại hoặc sấy cho thật khô sau đó rút lõi. Dược liệu là những mẫu cong queo, thịt đứt thành đoạn để lộ lõi gỗ nhỏ bên trong [1], [2]. 3 Hình 1.1: Rễ cây ba kích tím Quảng Ninh sau khi chế biến. 1.1.4. Tác dụng dược lý của ba kích - Tác dụng tăng lực Dịch chiết nước ba kích với liều 5 – 10g/kg cơ thể, dùng liên tiếp 7 ngày, có tác dụng tăng sức dẻo dai cho chuột thí nghiệm trong thực nghiệm khả năng bơi. Dùng phương pháp gây nhiễm độc cấp bằng NH4Cl trên chuột nhắt trắng, dịch chiết nước với liều 15 - 20 g/kg cơ thể bằng đường uống trước khi tiêm NH4Cl có tác dụng tăng sức đề kháng của cơ thể [10], [26]. - Tác dụng chống viêm Thí nghiệm tiến hành trên chuột cống trắng với mô hình gây phù bàn chân chuột bằng đĩa nóng. Đối tượng thí nghiệm được tiêm dưới da với liều 20 g/kg/ngày monotropein chiết và tinh chế từ cao chiết n-butanol của ba kích trước khi gây phù. Kết quả cho thấy monotropein phân lập từ ba kích có tác dụng chống viêm rõ rệt [9]. - Nghiên cứu một số tác dụng trên nội tiết Với hệ thống nội tiết, thí nghiệm trên chuột cống đực cung cấp bằng chứng chỉ ra ba kích không có tác dụng kiểu androgen nhưng có thể tăng cường hiệu lực của androgen [7]. - Hạ huyết áp và giảm stress Dịch chiết cồn ba kích có tác dụng hạ đường huyết và giảm stress oxy hóa trên chuột cống đái tháo đường, ngăn ngừa các biến chứng của đái tháo đường. Ba kích có 4 tác dụng bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa trên tế bào Leydig TM3 gây ra bởi hydrogen peroxide [12], [16]. Viên nang chứa oligosaccharide chiết xuất từ rễ cây ba kích trong điều trị chứng trầm cảm đã được thử nghiệm trên lâm sàng. Hiệu quả chữa trị tương đương với fluoxetin hydrochlorid, phản ứng phụ rất ít và nhẹ, có thể áp dụng trong chữa trị chứng trầm cảm mức độ nhẹ và vừa [12], [16]. - Tác dụng chống béo phì Các hợp chất anthraquinone được phân lập và tinh chế từ dịch chiết ba kích trong ethanol được dùng tại các nồng độ 10-10, 10-9, 10-8 mol/ml thử trên các chuột béo phì. Kết quả các hợp chất này có tác dụng làm giảm béo phì rõ rệt [19]. - Tác dụng trên xương Anthraquinone và polysaccharide được phân lập từ ba kích có liên quan đến việc điều chỉnh cũng như tăng cường hình thành xương, tăng sinh tế bào tạo xương in vivo, và có tác dụng trong ngăn ngừa và điều trị các bệnh liên quan đến quá trình tiêu xương. Các polysaccharide có tác dụng bảo vệ, chống mất xương, và tính chống oxy hóa do tăng hoạt tính của các enzym chống oxy hóa của cơ thể, làm giảm lượng MDA (Malodialdehyd) trong chuột cống thử nghiệm. So sánh với chuột được kiểm soát bình thường, polysaccharide làm tăng xuất hiện của các gen như BMP-2, Cbfal, Rrankl, Ropg, rPPARγ2 mARN trên chuột được điều trị bằng polysaccharide. Các gen này đều đóng vai trò quan trọng trong phát triển cũng như trao đổi chất của xương và sụn. Anthraquinone đã được báo cáo có tác dụng giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa [13], [25]. Như vậy rễ ba kích vừa tác dụng ức chế tiêu xương, vừa có thể tăng cường tái tạo và hình thành xương [13], [25]. 1.1.5. Công dụng, liều dùng, kiêng kị Ba kích là dược liệu quý trong nền Y - Dược học cổ truyền Việt Nam, được sử dụng riêng hay phối hợp trong các bài thuốc để nâng cao sức khoẻ và điều trị bệnh [1], [2], [3]. - Công dụng: Theo YHCT, ba kích có tác dụng bổ thận, tráng dương cường gân cốt, khu phong, trừ phong, dùng trong các trường hợp liệt dương, di tinh, mộng tinh, thận hư, đau lưng, mỏi gối, cân cốt đau nhứt, gân xương mềm yếu, thần kinh suy nhược…[2], [3]. 5 Ba kích có tác dụng tăng cường sức dẻo dai, mặc dù nó không làm tăng đòi hỏi tình dục, không thấy có tác dụng kiểu androgen. Có tác dụng hỗ trợ và cải thiện hoạt động sinh dục cũng như điều trị vô sinh cho những nam giới có trạng thái suy nhược thể lực và vô sinh tương đối [2], [3], [7]. Người cao tuổi có biểu hiện mệt mỏi, kém ăn ít ngủ, gầy yếu khi sử dụng ba kích với mục đích tăng cường sức khoẻ đã xuất hiện các cảm giác chủ quan như đỡ mệt mỏi, ngủ ngon, ăn ngon miệng và những dấu hiệu khách quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực. Đối với bệnh nhân đau mỏi các khớp sau khi dùng ba kích dài ngày các triệu chứng đau mỏi giảm rõ rệt. Nhóm bệnh nhân dùng phối hợp ba kích và vitamin B1 có kết quả tốt hơn so với dùng ba kích đơn độc [2], [3], [7]. - Liều dùng: 5-12 g/ngày dưới dạng thuốc sắc hoặc cao lỏng. Dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác [3]. - Kiêng kị: Người âm hư hỏa vượng, đại tiện táo kết không nên dùng [3]. 1.1.6. Thành phần hóa học trong ba kích - Thành phần chính: Anthraquinone, iridoid, polysaccharide [1], [21]. Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của một số chất chiết từ ba kích. - Thành phần hóa học khác: đường, vitamin C, acid succinic, nystose, 1-F-frutosefuranosylnystose...[1], [7], [21]. 1.2. Nhóm hoạt chất iridoid. 1.2.1. Định nghĩa Monoterpenoid glucoside gồm những glycoside có bộ khung của phần aglycon cấu tạo từ 2 đơn vị hemiterpen nối với nhau theo quy tắc đầu - đuôi, ví dụ 2 chất acid picrocinic và gardenoside có trong cây dành dành - Gardenia jasminoides Ellis, cho vị thuốc chi tử [1]. 6 Trong thực vật các monoterpenoid glycoside được gặp nhiều nhất là nhóm iridoid. Cho đến nay người ta đã biết đến trên 600 chất [1]. 1.2.2. Cấu trúc hoá học Về cấu tạo iridoid là những glycoside có bộ khung của phần aglycon gồm 2 đơn vị isopren. Chúng gồm 1 vòng cyclopentan nối với 1 vòng hydropyran theo dây nối acetal [1]. Tên iridoid xuất phát từ nhóm iridoidal, iridomyrmecin là những chất phân lập từ giống kiến châu Úc - Iridomyrmex. Iridodidal là chất tiết ra bởi kiến để tự vệ. Trong thực vật thì có rất nhiều chất có nhân iridan và đa số ở dạng glycoside [1]. Nhân cơ bản là cyclopentapyranic gồm một vòng cyclopentan nối với một vòng hydropyran. Các chất gặp trong thực vật, thường ở vị trí 4 có đính nhóm methyl hoặc nhóm chức oxy hóa của nó như CH2OH, CHO, COOH, thường ở mức độ oxy hóa cao tức là COOH [1]. Hình 1.3: Cấu trúc hóa học khung cơ bản của iridoid. Nhóm chức này trong nhiều trường hợp ở dạng ester hoặc ester nội do đóng vòng lacton với OH ở vị trí 6. Một số chất thiếu carbon ở C-H cũng có trường hợp thiếu carbon ở C-10, đây là những chất nor-iridoid. Ở vị trí 8 thường đính nhóm methyl hoặc nhóm chức oxy hóa của nó, hay gặp mức oxy hóa thấp. Trong một vài trường hợp đặc biệt cũng ở vị trí này lại đính một mạch có 4 hoặc 5 carbon, đây là những chất homo-iridoid có bộ khung trên 10 carbon. Vòng hdropyran thường có nối đôi ở vị trí 3-4. Vòng cyclopentan có thể có nối đôi ở vị trí 3-4. Vòng cyclopentan có thể có nối đôi ở vị trí 7-8 hoặc 6-7, một số ít có thể ở vị trí 5-6. Sự oxy hóa (gắn nhóm có oxy) thường xảy ra ở vị trí 1, 5, 6, 7, 8. Trong trường hợp vòng cyclopentan mở vòng ở vị trí 7-8 hoặc mở rồi lại đóng lại thành vòng lacton 6 cạnh hoặc thành vòng tetrahydropyran hoặc tetrahydropyron thì ta có các dẫn chất seco-iridoid. Cho đến nay người ta đã biết có trên 60 chất seco-iridoid [1]. Khi tạo thành glycoside, phần đường thường gặp là glucose nối vào vị trí 1 theo dây nối acetal. Có một số trường hợp là đường đôi: glucose 1-6 glucose, glucose 1-2 7 glucose, apiose 1-6 glucose, xylose 1-6 glucose, galactose 1-3 glucose. Mạch đường cũng có thể nối vào vị trí 11 nhưng hiếm. Có trường hợp có 2 mạch đường, ví dụ rehmaniosid B, C, D, 10-O-β-glucosyl aucubosid [1]. 1.2.3. Phân loại Iridoid gồm các nhóm [1]: - Iridoid có aglycon gồm đủ 10 carbon. - Iridoid có aglycon gồm không đủ 10 carbon. - Iridoid có phần aglycon trên 10 carbon. 1.2.4. Tính chất - Iridoid glycoside dễ tan trong nước, cồn loãng, methanol. Thường dùng cồn 50 %, hoặc methanol để chiết xuất, butanol là dung môi để hạn chế tạp [1]. - Dưới tác dụng của enzym có sẵn trong cây, iridoid glycoside bị biến đổi thành các sản phẩm màu đen. Ngoài enzym, iridoid glycoside cũng dễ bị thủy phân bằng acid. Dưới tác dụng của kiềm như NaOH, Ba(OH)2 thì các nhóm ester bị cắt [1]. 1.2.5. Định tính - Phản ứng hóa học: Sử dụng thuốc thử Trim – Hill: 10 ml acid acetic + 1ml CuSO4 0,4% + 0,5% ml HCl. Dược liệu tươi 2 g cắt nhỏ, cho vào ống nghiệm, thêm 5ml, lắc. Sau vài giờ gạn lấy dịch chiết, thêm 1ml thuốc thử, đun nóng sẽ xuất hiện màu xanh dương hoặc tím đỏ [1]. - Sắc kí lớp mỏng [1] • Dịch chấm sắc kí: dược liệu đun sôi 1 phút với methanol, lọc, dịch lọc đem chấm sắc kí. • Các thuốc thử phát hiện ❖ T1: Antimoin trichlorid: SbCl3 (27g) hòa tan trong 100ml ethanol ở 40 - 50°C. Thêm 5-10 g natri sulfat khan, lắc. Gạn lấy lớp trong ở trên dùng ngay. Sấy 2 phút ở 100°C. ❖ T2: Anialdehyd - sulfuric acid: 1 ml H2SO4 đậm đặc thêm vào dung dịch mới chế gồm 0,5 ml anisaldehyd trong 50ml acid acetic. Quan sát sau khi phun 0,5 - 1 giờ. ❖ T3: 5 - 10% H2SO4 trong ethanol: sấy 2 phút ở 100°C. ❖ T4: Benzidin - trichloracetic acid: Benzidin (0,5g) hòa tan trong 10 ml acid acetic rồi trộn với 10 ml dung dịch acid trichloacetic 40% trong nước và 80ml ethanol. Sấy 5 phút ở 100°C. 8 ❖ T5: Paradiethylaminobenzaldehyd 1% trong ethanol có chứa 1% HCl. Sấy 2 phút ở 100°C. • Bản mỏng: Silicagel GF254. • Hệ dung môi chạy sắc kí ❖ S1: Ethanol - chloroform (1:1). ❖ S2: Ethanol - Chloroform (3:7). ❖ S3: Ethanol - Ethyl acetat (1:1). - Quang phổ [1]: • Hấp thụ tử ngoại ở vùng bước sóng 233 - 238 nm. • Phổ IR: thường có tín hiệu ở 1722 cm-1 và 1660 cm-1. 1.3. Tình hình nghiên cứu về nhóm chất iridoid trong ba kích trên thế giới và tại Việt Nam Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về nhóm hoạt chất iridoid, tuy nhiên có khá ít các nghiên cứu định lượng về iridoid trong rễ của cây ba kích mà thường tập trung vào tác dụng dược lý. Tại Việt Nam, tác giả Bùi Quốc Thái đã nghiên cứu và phân lập và tinh chế monotropein một trong những hoạt chất chính từ rễ cây ba kích trồng tại Lục Ngạn, Bắc Giang thành chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm. Trong nhóm hoạt chất iridoid, người ta đã tìm ra có 6 hoạt chất chính là monotropein, asperuloside, morindolide, moroffinaloside, acid asperulosidic và deacetyl asperuloside [21]. Do monotropein và asperuloside là 2 hoạt chất có hàm lượng cao trong cây và đã có các tài liệu công bố về tác dụng dược lý của chúng [9], [11], [17], [18], [22]. Vì vậy trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi tập trung nghiên cứu chính về monotropein và asperuloside là 2 hoạt chính chính nhóm iridoid trong ba kích. 1.3.1. Monotropein a) Đặc điểm và tính chất [14] - Công thức phân tử: C16H22O11. - Khối lượng phân tử: 390,341 g/mol. - Tên khoa học: (1S,4aS,7R,7aS)-7-hydroxy-7-(hydroxymethyl)-1- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4a,7a-dihydro1H-cyclopenta[c]pyran-4-carboxylic acid. - Công thức cấu tạo: 9 - Tính chất • Dạng tồn tại: Tinh thể màu trắng, không mùi. • Tính chất vật lý: Dễ tan trong nước, cồn, methanol. • Tính chất hóa học: Có tính acid yếu. - Nhiệt độ nóng chảy: 175°C. - Cực đại hấp thụ: 235 nm trong ethanol, 234 nm trong methanol. - Hàm lượng trong ba kích: Khoảng 1%. - Bảo quản: Tránh ánh sáng, bảo quản ở nhiệt độ thấp. b) Tác dụng dược lý - Tác dụng chống viêm Các nghiên cứu gần đây cho thấy monotropein có tác dụng chống viêm. Monotropein được phát hiện ức chế biểu hiện của nitric oxid synthase (NOS), cyclooxygenase (COX-2), yếu tố hoại tử TNF-α và interleukin-1β marna trong dòng tế bào chuột gây viêm bởi tác nhân lipopolysaccharide (LPS). Việc xử lý bằng monotropein đã làm giảm tác dụng kết dính AND của nhân кB (NF-кB). Monotropein cũng ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa và suy giảm ức chế кB-α (IкB-α) và do đó hoán vị NF-кB. Trong mô hình viêm ruột kết gây bởi dextran sulfate sodium, monotropein làm giảm chỉ số hoạt động bệnh, hoạt động myeloperoxidae và các biểu hiện protein liên quan đến viêm thông qua ngăn chặn hoạt hóa NF-кB ở niêm mạc ruột [9]. Tóm lại, những phát hiện này gợi ý tác dụng chống viêm của monotropein chủ yếu liên quan đến sự ức chế các biểu hiện của chất trung gian gây viêm, thông qua khử hoạt tính NF-кB và hỗ trợ vai trò chữa bệnh của nó trong viêm ruột kết [9]. - Tác dụng chống stress oxy hóa Một nghiên cứu trên chuột cho thấy giảm bớt sự tổn thương do stress oxy hóa và thúc đẩy sự phân hóa tế bào tiền thân là rất quan trọng đối với các chấn thương do 10