Tài liệu định lượng fructose trong tinh dịch theo phương pháp roe ở nam giới vô sinh

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội, PGS.TS. Trần Đức Phấn cùng các thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên trong bộ môn đã tạo điều kiện và tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện nghiên cứu tại bộ môn. Ban giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, phòng đào tạo Đại học đã tạo điều kiện để tôi có thể thuận lợi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Trang. Cô không chỉ dìu dắt, hướng dẫn, truyền đạt kiến thức mà cônhư một người thân trong gia đình đã luôn quan tâm chia sẻ những khó khăn, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, tình yêu thương đến bố mẹ và hai chị, những người luôn ở bên ủng hộ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận cũng như trong suốt 6 năm học qua. Tôi xin cảm ơn sự quan tâm, chia sẻ và động viên của bạn bè tôi, đặc biệt là bạn Ú. Mọi người luôn là chỗ dựa vững chắc, giúp tôi có thêm động lực và quyết tâm hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày tháng6 năm 2015 Nguyễn Thị Hồng Thịnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận “Định lượng fructose trong tinh dịch theo phương pháp ROE ở nam giới vô sinh” dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Trang là hoàn toàn do tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng công bố trước đây. Hà Nội, ngày tháng 6năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Thịnh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AND : Acid deoxyribonucleic CBAVD : Congenital bilateral absence of the vas deferens (bất sản hệ thống ống dẫn tinh) NST : Nhiễm sắc thể TDĐ : Tinh dịch đồ WHO : World health organization (Tổ chức Y tế Thế giới) MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 2 1.1. Tình hình vô sinh và vô sinh nam ....................................................... 2 1.1.1. Khái niệm vô sinh nam ................................................................... 2 1.1.2. Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên thế giới .............................. 3 1.1.3. Tình hình vô sinh và vô sinh nam tại Việt Nam ............................. 4 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến các chỉ số TDĐ ........................................ 5 1.2.1. Độ tuổi sinh sản .............................................................................. 5 1.2.2. Các yếu tố nội tiết ........................................................................... 5 1.2.3. Các yếu tố di truyền ........................................................................ 6 1.2.4. Môi trường ...................................................................................... 8 1.2.5. Bệnh lý ............................................................................................ 9 1.3. Fructose và các yếu tố sinh hóa khác .................................................. 9 1.3.1. Fructose ........................................................................................... 9 1.3.2. Các yếu tố hóa sinh khác .............................................................. 12 1.4. Các phương pháp định lượng fructose hiện nay ............................... 13 1.4.1. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp................................................... 13 1.4.2. Phương pháp enzyme .................................................................... 13 1.4.3. Phương pháp indole ...................................................................... 14 1.4.4. Phương pháp resorcinol (ROE) .................................................... 16 Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 18 2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 18 2.1.1. Lựa chọn đối tượng nghiên cứu .................................................... 18 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ........................................................................ 18 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 19 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ...................................................................... 19 2.2.2. Quy trình nghiên cứu .................................................................... 19 2.2.3. Định lượng fructose bằng phương pháp ROE .............................. 20 2.2.4. Các chỉ tiêu nghiên cứu ................................................................ 21 2.2.5. Xử lí số liệu ................................................................................... 21 2.2.6. Đạo đức nghiên cứu ...................................................................... 21 Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................... 22 3.1. Xác định nồng độ fructose trong tinh dịch ở nam giới vô sinh theo phương pháp ROE ....................................................................................... 22 3.1.1. Xác định nồng độ fructose trong tinh dịch ở các nhóm nghiên cứu theo phương pháp ROE ............................................................................ 22 3.1.2. Đặc điểm nồng độ fructose trong tinh dịch ở các trường hợp không có tinh trùng.............................................................................................. 24 3.2. Tương quan giữa nồng độ fructose trong tinh dịch với một số chỉ số TDĐ ........................................................................................................... 26 3.2.1. Một số chỉ số TDĐ ở các nhóm nghiên cứu ................................. 26 3.2.2. Tương quan giữa nồng độ fructose trong tinh dịch với một số chỉ số TDĐ ..................................................................................................... 27 Chương 4 - BÀN LUẬN ................................................................................. 30 4.1. Xác định nồng độ fructose trong tinh dịch ở nam giới vô sinh theo phương pháp ROE ....................................................................................... 30 4.1.1. Xác định nồng độ fructose trong tinh dịch ở các nhóm nghiên cứu theo phương pháp ROE ............................................................................ 30 4.1.2. Đặc điểm nồng độ fructose trong tinh dịch ở các trường hợp không có tinh trùng.............................................................................................. 32 4.2. Tương quan giữa nồng độ fructose trong tinh dịch với một số chỉ số TDĐ ........................................................................................................... 36 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 39 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. TDĐ theo tiêu chuẩn WHO 2010 Bảng 3.1. Nồng độ fructose trung bình ở các nhóm nghiên cứu 22 Bảng 3.2. Một số chỉ số TDĐ ở các nhóm nghiên cứu 25 Bảng 3.3. Một số đặc điểm của tinh dịch ở những bệnh nhân được 33 chẩn đoán CBAVD 3 DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1. Sơ đồ quá trình chuyển hóa của fructose 10 Hình 3.1. Nồng độ fructose ở các nhóm nghiên cứu 21 Hình 3.2. Đặc điểm nồng độ fructose trong tinh dịch ở các trường hợp 24 azoospermia Hình 3.3. Tương quan giữa nồng độ fructose trong tinh dịch với mật độ 26 tinh trùng Hình 3.4. Tương quan giữa nồng độ fructose trong tinh dịch với tỉ lệ 27 sống của tinh trùng Hình 3.5. Tương quan giữa nồng độ fructose trong tinh dịch với độ di động của tinh trùng 27 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm gần đây,công tác chăm sóc sức khỏe sinh sản ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm của xã hội. Ở nước ta, tỉ lệ vô sinhnói chung, tỉ lệ nam giới vô sinh nói riêng đang ở mức cao [1]. Có nhiều nguyên nhân gây vô sinh nam. Để chẩn đoán nguyên nhân vô sinh ở nam giới, tại các phòng khám nam khoa và các trung tâm chăm sóc sức khỏe sinh sản, xét nghiệm tinh dịch đồ đã trở thành xét nghiệm thường quy.Tuy nhiên, chỉ với các chỉ số tinh dịch đồ như mật độ, tỉ lệ sống, độ di động và hình thái tinh trùng thì chưa đủ để chẩn đoán nguyên nhân vô sinh ở nam giới. Do vậy, ngay từ đầu thế kỉ XX, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các yếu tố sinh hóa trong tinh dịch. Trong đó, xét nghiệm định lượng fructose trong tinh dịch đóng vai trò quan trọngvì fructose là nguồn cung cấp năng lượng chính cho mọi hoạt động sống của tinh trùng [2]. Hơn nữa trong một số trường hợp, xét nghiệm này có thể thay thế cho phương pháp chọc mào tinh để chẩn đoán nguyên nhân vô sinh ở nam giới. Ở Việt Nam, xét nghiệm định lượng fructose mới được đưa vào ứng dụng tại Bệnh viện Việt Đức từ tháng 8/2011 [3]. Tại bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội, xét nghiệm định lượng fructose trong tinh dịch được ứng dụng từ cuối năm 2013. Do đó, các nghiên cứu về mối liên quan của fructose đến chất lượng tinh dịch và khả năng sinh sản nam giớicòn rất hạn chế. Xuất phát từ tình hình thực tế này, chúng tôi tiến hành đề tài “Định lượng fructose trong tinh dịch theo phương pháp ROE ở nam giới vô sinh” với 2 mục tiêu sau: 1. Xác định nồng độ fructose trong tinh dịch của nam giới vô sinh bằngphương pháp ROE. 2. Đánh giá mối tương quan giữa nồng độ fructose trong tinh dịch với một số chỉ số tinh dịch đồ như mật độ, tỉ lệ sống, độ di động của tinh trùng. 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình vô sinh và vô sinh nam 1.1.1. Khái niệm vô sinh nam Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), vô sinh (infertility) được định nghĩa là tình trạng một cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ, khi chung sống cùng nhau trên một năm, có quan hệ tình dục thường xuyên, không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thai nào, mà không thể có con [4]. Vô sinh được phân thành 2 loại:  Vô sinh nguyên phát (vô sinh I) là trường hợp cặp vợ chồng chưa bao giờ có thai, mặc dù sống với nhau trên một năm và không dùng biện pháp tránh thai nào.  Vô sinh thứ phát (vô sinh II) là trường hợp cặp vợ chồng đã từng có con hoặc đã có thai, nhưng sau đó không thể có thai lại mặc dù đang sống với nhau trên một năm và không dùng biện pháp tránh thai nào. Vô sinh nam (male infertility) là trường hợp mà nguyên nhân được xác định do người nam (chồng hoặc đối tác). Tại các cơ sở y tế, xét nghiệm TDĐ từ lâu đã trở thành một xét nghiệm cơ bản và đầu tay trong chẩn đoán vô sinh nam. Từ năm 1978, WHO đã tiến hành biên soạn tài liệu hướng dẫn đánh giá TDĐ và các chỉ số liên quan đến tinh trùng. Năm 1999, tài liệu này xuất bản phiên bản thứ IV [4]. Mới đây, năm 2010, phiên bản V ra đời, đưa ra những chỉnh sửa về tiêu chuẩn đánh giá các chỉ số trong TDĐ [5].Theo tiêu chuẩn WHO 2010, số ngày kiêng quan hệ trước khi làm xét nghiệm TDĐ từ 2-7 ngày. Nếu kết quả phân tích tinh dịch bình thường thì chỉ cần làm 1 lần, trường hợp kết quả xét nghiệm bất thường thì cần làm ít nhất 2 lần. Trong 3 nghiên cứu này, chúng tôi phân tích TDĐ theo tiêu chuẩn WHO 2010- bảng 1.1. Bảng 1.1. TDĐ theo tiêu chuẩn WHO 2010[5] Chỉ số TDĐ WHO 2010 Thế tích tinh dịch (ml) ≥ 1,5 pH tinh dịch ≥ 7,2 Mật độ tinh trùng (106/ml) ≥ 15 Di động (%) PR ≥ 32 Hình thái bình thường (%) ≥4 Tỉ lệ sống (%) ≥ 58 Bạch cầu (106/ml) ≤1 Chú thích:PR. Tiến tới (Progessive). 1.1.2. Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên thế giới Vấn đề vô sinh và vô sinh nam đã được thế giới quan tâm và nghiên cứu nhiều. Theo WHO (1985), trong các trường hợp vô sinh có khoảng 80% xác định được nguyên nhân và 20% không rõ nguyên nhân. Đến năm 1991, WHO ước tính trên thế giới có khoảng 12 - 15% cặp vợ chồng bị vô sinh[6]. Tại Mỹ, theo một nghiên cứu của Hội Y học sinh sản Hoa Kỳ, có khoảng 6,1 triệu người bị vô sinh, một phần ba trong số này có nguyên nhân do nữ giới, một phần ba có nguyên nhân từ nam giới và còn lại có nguyên nhân từ cả hai phía hoặc không rõ nguyên nhân [7]. Tại châu Âu, thống kê năm 1988 - 1989 ở Pháp, tỉ lệ vô sinh nam chiếm đến 13,5%; trong đó nguyên nhân do nam chiếm khoảng 20% [8]. Theo Irvine 4 D.S. (2002) thì vô sinh là một vấn đề phổ biến trên thế giới, chiếm tỉ lệ 1417% ở các cặp vợ chồng, trong đó nguyên nhân do nam giới khó xác định [9].Krauz và cộng sự lại cho rằng nguyên nhân gây vô sinh nam lên đến 50%, trong số này có 40 - 50% trường hợp bất thường về cả số lượng và chất lượng tinh trùng [10]. Ở các nước châu Á,theo Aribarg A. vô sinh tại Thái Lan chiếm 12%các cặp vợ chồng vô sinh trong lứa tuổi sinh đẻ [11]. Nhằm mục đích nghiên cứu tỉ lệ vô sinh nguyên phát và thứ phát, năm 2000, Larsen và cộng sự tiến hành nghiên cứu tình hình vô sinh ở 10 trong số 28 quốc gia châu Phi, đã công bố có 3% các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát trong lứa tuổi sinh đẻ; trong khi tỉ lệ vô sinh thứ phát còn cao hơn nhiều [12]. Năm 2011, Lee J.Y. khi nghiên cứu trên các cặp vợ chồng vô sinh đã chỉ ra tỉ lệ vô sinh nguyên phát là 78% và vô sinh thứ phát là 22% [13]. Như vậy, tỉ lệ vô sinh trên thế giới thay đổi từ 10 - 20%, tỉ lệ này có xu hướng ngày càng tăng, trong đó nguyên nhân vô sinh do nam và nữ có tỉ lệ tương đương và tỉ lệ vô sinh không rõ nguyên nhân còn nhiều. 1.1.3. Tình hình vô sinh và vô sinh nam tại Việt Nam Ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu về vô sinh cho thấy tỉ lệ vô sinh có xu hướng tăng. Theo điều tra dân số năm 1980, tỉ lệ này chỉ ở mức 7 10%; đến năm 1982, tỉ lệ vô sinh chung ở Việt Nam đã lên đến 13%, trong đó vô sinh nữ chiếm 54%, vô sinh nam chiếm 36%, vô sinh không rõ nguyên nhân chiếm 10% [1]. Theo Phan Văn Quyền (2000) tỉ lệ vô sinh là 10- 15% [14]. Còn nghiên cứu của Ngô Gia Hy (2000) cho rằng trong số các cặp vợ chồng bị vô sinh thì nguyên nhân do người chồng là 40%, do người vợ là 50% và do cả hai vợ chồng là 10% [15]. 5 Trần Thị Trung Chiến và cộng sự (2002) công bố tỉ lệ vô sinh chiếm 5%, trong đó vô sinh do nam giới chiếm 40,8% [16]. Theo Trần Thị Phương Mai (2001), vô sinh nguyên nhân do nữ giới thường chiếm khoảng 30- 40% các trường hợp. Vô sinh nam giới chiếm khoảng 30% các trường hợp. Khoảng 20% các trường hợp tìm thấy nguyên nhân vô sinh ở cả hai vợ chồng. Bên cạnh đó, có khoảng 20% các cặp vợ chồng không tìm thấy nguyên nhân gây vô sinh [17]. Nghiên cứu của Trần Đức Phấn (2001) cho thấycó 44%kết quả tinh dịch đồ bất thườngở các cặp vợ chồng vô sinh[18]. 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến các chỉ số TDĐ 1.2.1. Độ tuổi sinh sản Các nghiên cứu đã chứng minh tuổi có liên quan chặt chẽ đến khả năng sinh sản không chỉ ở nữ mà cả ở nam. Nam giới trên 45 tuổi có mức độ đứt gãy ADN tinh trùng cao hơn rất nhiều so với nam giới trẻ tuổi [19]. Theo Sharon A.K. nghiên cứu cho thấy kết quả TDĐ của nam giới trên 50 tuổi có đến 22% giảm thể tích tinh dịch và 37% có tinh trùng giảm khả năng vận động [20]. 1.2.2. Các yếu tố nội tiết Vùng dưới đồi GnRH (Gonadotropin releasing hormone) có bản chất là một peptid, tham gia quá trình sản xuất tinh trùng thông qua tác dụng kích thích thùy trước tuyến yên tổng hợp và bài tiết 2hormone LH và FSH. Thùy trước tuyến yên GH (Growth hormone)là một protein có chức năng kiểm soát chuyển hóa của tinh hoàn và quá trình phân chia các tinh nguyên bào. Ở những bệnh nhân lùn tuyến yên, sự sinh sản tinh trùng giảm hoặc không có. 6 LH (Luteinizing hormone)có bản chất là một glycoprotein, có chức năng kích thích các tế bào Leydig ở khoảng kẽ của tinh hoàn bài tiết testosterone. FSH (Follice stimulating hormone)cũng là một glycoprotein. FSH có chức năng kích thích sự phát triển của ống sinh tinh, kích thích tế bào Sertoli phát triển và bài tiết các chất dinh dưỡng giúp cho sự phát triển tinh trùng. Mặt khác, FSH còn kích thích Sertoli bài tiết một loại protein gắn với androgen, giúp vận chuyển các androgen này vào trong lòng ống sinh tinh phục vụ quá trình trưởng thành của tinh trùng. Tinh hoàn Testosteronelà một hợp chất steroid do tế bào Leydig và một phần nhỏ do tủy thượng thận tiết ra. Testosterone kích thích sự hình thành tinh nguyên bào, sự phân chia giảm nhiễm lần 2 từ tinh nguyên bào II thành tiền tinh trùng, sự tổng hợp protein và bài tiết dịch từ tế bào Sertoli. Inhibindo tế bào Sertoli tiết ra với bản chất là glycoprotein. Inhibin thông qua quá trình điều hòa ngược âm tính đối với sự bài tiết FSH của tuyến yên để điều hòa quá trình sinh sản của tinh trùng. 1.2.3. Các yếu tố di truyền  Các yếu tố di truyền ở mức độ tế bào Bất thường di truyền nói chung và bất thường nhiễm sắc thể (NST) nói riêng đã được đề cập và nghiên cứu từ lâu trên thế giới. Các bất thường về số lượng hay cấu trúc NST có thể gặp ở cả NST giới tính và NST thường. Các bất thường này làm giảm quá trình sinh tinh dẫn đến hậu quả suy giảm chức năng sinh sản của nam giới. Tại Việt Nam, theo Trần Cúc Ánh (2012) nghiên cứu trên 187 cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát thì có 15% người chồng mang bất thường NST, trong số này; có 89,3%là bất thường NST giới tính [21]. 7  Các yếu tố di truyền ở mức độ phân tử Mất đoạn AZF trên NST Y Việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán nguyên nhân vô sinh ở nam giới do mất đoạn nhỏ (microdeletion) trên nhánh dài của NST Y (Yq) đang trở nên phổ biến trên thế giới. Mất đoạn nhỏ chủ yếu xảy ra ở vùng AZF (azoospermia factor) -nơi có chứa nhiều gen liên quan tới quá trình sinh tinh, được coi là nguyên nhân bất thường di truyền thứ hai sau hội chứng Klinefelter gây vô sinh ở nam giới [22]. Vùng AZF được xác định gồm 4 khu vực: AZFa, AZFb, AZFc, AZFd. Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Việt Hà (2012), có 8% trường hợp vô sinh nam có mất đoạn ở vùng AZF trên NST Y. Trong đó mất đoạn nhỏ trênAZFc chiếm tỉ lệ cao nhất (57,90%); tiếp đến là mất đoạn trên AZFa (31,58%); mất đoạn trên vùng AZFb chỉ chiếm tỉ lệ 5,26% [23]. Đột biến gen AR (Androgen receptor) Androgen là hormone steroid quan trọng trong sự biểu hiện kiểu hình nam. Để thực hiện chức năng này, androgen thông qua một thụ thể duy nhất là androgen receptor (AR). Thụ thể AR được mã hóa bởi một gen duy nhất nằm trên nhánh dài của NST X. Đột biến gen AR dẫn đến các bất thường chức năng của AR và hậu quả là có cơ quan sinh dục không rõ ràng hoặc bị nữ hóa hoặc vẫn mang cơ quan sinh dục nam nhưng ảnh hưởng đến khả năng sinh sản [24]. Trong đó, đột biến lặp bộ ba CAG ≥ 26 lần gặp ở 25% số trường hợp vô sinh nam không có tinh trùng [25]. Đột biến gen gây bệnh xơ nang CFTR (Cyctic fibrosis transmembrance conductance regulator) Xơ nang (CF-cyctic fibrosis) là một bệnh di truyền do gen lặn trên NST thường (nhánh dài NST số 7), đồng thời cũng là nguyên nhân thường gặp gây vô sinh ở nam. CF gây ra bởi một đột biến trên gen CFTR, dẫn đến rối loạn 8 sản xuất protein CFTR chức năng, teo một hoặc cả hai bên tinh hoàn, mất chức năng của ống dẫn tinh và không có tinh trùng [26]. Có 80 - 90% các trường hợp vô sinh không có tinh trùng có liên quan đến CF [27]. Tuy nhiên khoảng 97% bệnh nhân CF vô sinh nhưng vẫn có tinh trùng và có thể có con nhờ các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản [28]. Sự đứt gãy ADN tinh trùng Sự đứt gãy ADN tinh trùng là hiện tượng tổn thương ADN tinh trùng, có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn nào trong quá trình sinh tinh.Chỉ số đánh giá mức độ đứt gãy ADN tinh trùng là DFI (DNA fragmentation index), chỉ số này càng cao thì mức độ đứt gãy càng lớn. Theo Sheena E. và cộng sự (2013), có 80% số cặp cợ chồng vô sinh không rõ nguyên nhân là do chất lượng tinh trùng quá yếu hay đứt gãy ADN tinh trùng [29]. Nghiên cứu của Utsuno H. (2013) đã chứng minh đứt gãy ADN có liên quan đến hình thái bất thường của tinh trùng [30]. DFI cao là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến chất lượng phôi kém và hỏng thai tự nhiên cũng như ảnh hưởng đến tỉ lệ thành công của các phương pháp hỗ trợ sinh sản [31]. 1.2.4. Môi trường Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến chất lượng và số lượng tinh trùng. Phải kể đến các yếu tố như nhiệt độ, dinh dưỡng, bức xạ (tia X), stress hay các chất kích thích như thuốc lá, rượu, ma túy. Nhiệt độ Bình thường, nhiệt độ lý tưởng cho sự sản sinh tinh trùng thấp hơn nhiệt độ cơ thể khoảng 2 - 3oC, tức là ở nhiệt độ khoảng 35oC. Khi nhiệt độ tăng làm gián đoạn quá trình sản xuất tinh trùng và ảnh hưởng đến khả năng di 9 động củatinh trùng. Ở nhiệt độ bìu là 37oC, độ di động của tinh trùng giảm đến một nửa [32]. Dinh dưỡng Ở những người đàn ông béo phì (BMI ≥ 30 kg/m2) thì tổng số tinh trùng giảm cùng vớisự đứt gãy ADN tinh trùng cũng cao hơn những người đàn ông có cân nặng bình thường [33].Ngược lại, tình trạng một số chất như vitamin A, nhóm B, E, các acid amin và kẽmcũng làm ảnh hưởng đến sự sản xuất, nuôi dưỡng, độ di động của tinh trùng. 1.2.5. Bệnh lý Các bệnh lý ảnh hưởng đến chất lượng và cả số lượng tinh dịch thường gặp là giãn tĩnh mạch tinh, biến chứng của bệnh quai bị và xuất tinh ngược dòng. Hậu quả của các bệnh lý này là ứ trệ tuần hoàn gây tăng nhiệt độ tinh hoàn, viêm teo tinh hoàn hay xuất tinh ngược vào bàng quang và thoát ra ngoài cùng nước tiểu. 1.3. Fructose và các yếu tố sinh hóa khác 1.3.1. Fructose 1.3.1.1. Nguồn gốc và chuyển hóa fructose trong tinh dịch Từ năm 1946, Mann đã phát hiện fructose trong tinh dịch dưới dạng Methyl phenyl fructosazone [34]. Fructose được hình thành trong túi tinh dưới tác động của testosteronevà được bài xuất ra ngoài cùng tinh trùng qua ống dẫn tinh trong mỗi lần xuất tinh. Fructose trong tinh dịch cần phải được nhắc đến với vai trò quan trọng nhất là nguồn cung cấp năng lượngchủ yếu cho mọi hoạt động sống của tinh trùng. Fructose là cacbohydrat chính được tìm thấy trong plasma tinh dịch. Mặc dù glucose, galactose hay acid citric có mặt trong tinh dịch cũng với vai tròcung cấp năng lượng, tuy nhiên nồng độ thấp hơn nhiều [34]. 10 Qua quá trình chuyển hóa (fructolysis), một phân tử fructose sẽ được tạo thành 2 phân tử glyceraldehid - 3 - phosphate; tiếp tục đi vào chu trình chuyển hóa trong tế bào chất và hệ thống ti thể của tinh trùng, tạo ra năng lượng dự trữ dưới dạng ATP (Hình 1.1). Hình 1.1.Sơ đồ quá trình chuyển hóa của fructose 1.3.1.2. Vai trò của fructose trong tinh dịch Vai trò của fructose trong tinh dịch đã được nhiều nghiên cứu trên thế giới chứng minh. Nồng độ fructose trong tinh dịch có liên quan mật thiết đến các chỉ số TDĐ.  Vai trò của fructose trong tinh dịch đối với tổng số và mật độ tinh trùng đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Theo Rajalakhshmi M. (1989) và Gonzales G.F. (2001), sự gia tăng mật độ tinh trùng thường đi kèm với sự giảm nồng độ fructose trong tinh dịch do tinh trùng sử dụng fructose là nguồn năng lượng chủ yếu [35], [36]. Tuy nhiên, cũng có nghiên cứu chỉ ra nồng độ fructose trong tinh dịch của những bệnh nhân ít tinh trùng (oligozoospermia) và không có tinh trùng (azoospermia) giảm hơnkhi so với người nam bình thường [2]. 11  Vai trò của nồng độ fructose trong tinh dịch đối với tỉ lệ sống và độ di động của tinh trùng rất quan trọng. Năng lượng từ fructose là cơ sở dinh dưỡng chủ yếu cho tinh trùng, đảm bảo sự sản sinh, phát triển từ đó ảnh hưởng đến tỉ lệ sống và khả năng di động của tinh trùng. Hoạt lực của tinh trùng liên quan chặt chẽ đến nồng độ fructose trong tinh dịch [2]. Độ di động của tinh trùng đã được chứng minh có mối tương quan tỉ lệ nghịch với nồng độ fructose [37].  Được hình thành trong túi tinh và bài tiết qua các ống dẫn tinh nên fructose được coi là chất sinh hóa phản ánh trung thực chức năng của các thành phần này. Fructose trong tinh dịch cũngphản ánh tình trạng của tuyến tiền liệt nhưng vai trò không rõ nét như kẽm, acid citric và phosphatase acid [2]. Nồng độ fructose trong tinh dịch bình thường khẳng địnhvai trò của các testosterone và chức năng của túi tinh, ống dẫn tinh bình thường, không gặp hiện tượng tắc nghẽn [38]. Theo WHO 2010, fructose trong tinh dịch thấp là đặc trưng của tình trạng tắc nghẽn hệ thống ống dẫn tinh gặp trong bất sản ống dẫn tinh, bất sản túi tinh, thiếu hụt androgen hay xuất tinh ngược dòng [5], [39].  Do sự bài tiết của fructose trong túi tinh chịu sự ảnh hưởng của testosterone nên nồng độ fructose trong tinh dịch còn phản ánh hoạt động của testosterone trong huyết thanh [40]. 71% bệnh nhân có nồng độ testosterone trong huyết thanh thấp, có kèm theo nồng độ fructose hiệu chỉnh (true corrected seminal fructose = log (mật độ tinh trùng) x nồng độ fructose) trong tinh dịch thấp [40].  Ngoài ra, tương quan giữa fructose trong tinh dịch với hình thái tinh trùng cũng được nhiều nghiên cứu quan tâm. Schoenfeld và cộng sự (1979) nghiên cứu về mối tương quan nghịch giữa nồng độ fructose và bất thường ở 12 đuôi tinh trùng tiếp tục chứng minh sự cần thiết của fructose như một nguồn năng lượng cho sự vận động có hiệu quả của tinh trùng [41]. Fructose cũng có mối tương quan nghịch với bất thường đầu tinh trùng, điều này cho thấy rằng fructose trong tinh dịch còn có chức năng duy trì hoạt động của acrosome và chromatin nhân [42]. 1.3.2. Các yếu tố hóa sinh khác Bên cạnh fructose, có nhiều yếu tố sinh hóa khác cũng ảnh hưởng đến các chỉ số TDĐ, hơn nữa các yếu tố sinh hóa này còn phản ánh chức năng của các tuyến sinh dục tiết ra chúng [43]. α - glucosidase, L - carnitine do mào tinh hoàn tiết ra. Trong khi đó, kẽm, acid citric, phosphatase acid lại có mối tương quan chặt chẽ với nhau vì cùng được tiết ra bởi tuyến tiền liệt và phản ánh chức năng của tuyến này [5].  Kẽm (Zinc) Kẽm có nồng độ bình thường trong tinh dịch từ 3,0 - 15,0 g/l. Thiếu hụt kẽm được chứng minh có mối tương quan với sự giảm khả năng sinh sản ở nam [44]. Kẽm đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của tinh hoàn, tiền liệt tuyến và khả năng di động của tinh trùng [45], [46]. Trong tinh dịch, kẽm cònliên quan đến sự giãn xoắn của chất nhiễm sắc trong nhân, đồng thời có vai trò ổn định cấu trúc bậc bốn của NST tinh trùng [47]. Ngoài ra, kẽm còn tham gia vào quá trình tổng hợp testosterone tại tế bào Leydig [48].  α - glucosidase α - glucosidase là một enzyme trong tinh dịch,giảm có ý nghĩa thống kê ở những nam giới vô sinh [49]. Trong nghiên cứu năm 2001, α - glucosidase còn liên quan đến độ di động tiến tới cũng như ảnh hưởng đến mật độ tinh trùng và nồng độ androgen trong huyết thanh [50]. 13  Phosphatase Trong tinh dịch, phosphatase tồn tại ở 2 dạng: phosphatase acid và phosphatase kiềm, với cấu trúc và hoạt tính khác nhau. Sự gia tăng hoạt tính của phosphatase acid liên quan chặt chẽ đến giảm mật độ tinh trùng và khả năng sinh sản ở nam giới [51]. Trong khi đó, những nghiên cứu mới đâychứng minh phosphatase kiềm giảm rõ rệt trong những trường hợp tắc ống dẫn tinh [52].  Acid citric Acid citric trong tinh dịch được các nghiên cứu quan tâm từ những năm 40 - 50 của thế kỷ trước. Acid citric liên quan đến chuyển hóa năng lượng thông qua glucose. Cùng với fructose thì acid citric cũng được chứng minh có vai trò quan trọng trong sự di động cũng như mật độ tinh trùng [49]. 1.4. Các phương pháp định lượng fructose hiện nay 1.4.1. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp Đây là phương pháp ít sử dụng trong phòng thí nghiệm khi định lượng fructosevới nồng độ nhỏ. Nhược điểm của phương pháp này là kĩ thuật và hệ thống máy móc cồng kềnh, đắt tiền, sử dụng nhiều hóa chất hữu cơ phức tạp. 1.4.2. Phương pháp enzyme Kĩ thuật đơn giản, khi so sánh với phương pháp resorcinol thì phương pháp enzyme có hệ số tương quan lên đến 0,96 với độ tin cậy 95%, nhưng lại cho kết quả nhanh chóng hơn [53]. Phương pháp này đang có xu hướng được áp dụng rộng rãi, không chỉ để xác định nồng độ fructose trong tinh dịch mà còn giúp định lượng fructosemáu trong một số bệnh lý về tụy như ung thư