Tài liệu định lượng coliforms – e.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Đề tài: Định lượng Coliforms – E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc GVHD: Hoàng Xuân Thế Nhóm: 12 MSSV 1.Nguyễn Thị Thảo Trang 2.Trương Thị My 3.Nguyễn Thị Loan 4.Nguyễn Ngọc Mai Trâm 2205112096 2205112043 2205112028 2205112097 NỘI DUNG  Coliform  Định nghĩa gram âm - Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24- 48 giờ. - Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37oC trong môi trường canh Laury Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt. Nhuộm gram Năm 1884 H.Christian Gram đã khám phá ra một phương pháp nhuộm VSV bằng phẩm nhuộm pararosaniline. Thông qua việc sử dụng theo trình tự 2 loại phẩm nhuộm có 2 màu khác nhau, ông đã nhận thấy vi khuẩn được chia thành 2 nhóm: nhóm vi khuẩn Gram dương (giữ màu phẩm nhuộm đầu tiên: crystal violet) và nhóm vi khuẩn Gram âm (bị mất màu phẩm nhuộm đầu tiên sau khi được rửa bằng một dd tẩy màu rồi được tiếp tục nhuộm bằng phẩm nhuộm thứ 2 là safranin hay carbon fuchsin). Nhuộm gram Đó là do có sự khác biệt về thành phần hóa sinh của thành tế bào vi khuẩn. Phương pháp nhuộm Gram về sau được sử dụng rộng rãi khi định loại vi sinh vật. Thành phần hoá học của 2 nhóm này khác nhau chủ yếu như sau : Thành phần Peptidoglycan Acid teicoic Lipid Protein Gram dương Gram âm Tỷ lệ % đối với khối khô của thành tế lượng bào 30-95 5-20 Cao 0 Hầu như không có 20 Không có hoặc có ít Cao Nhuộm gram Nhuộm gram Nhuộm gram GRAM + GRAM - Không màu Fixation Không màu Màu tím Crystal Violet Màu tím Màu tím Iodine treatment Màu tím Màu tím Decolorization Không màu Màu tím Counter stain (safranin) Màu hồng Sự bắt màu của tế bào vi khuẩn khi nhuộm Gram Nhuộm gram Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng E.coli, Gram (-) Staphylococcus epidermidis, Gram (+) Bacillus cereus, Gram (+) - Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: +Escherichia (E.coli) +Citrobacter. +Klebsiella. +Enterobacter. Escherichia coli Citrobacter freundii Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Enterobacter sakazakii  Coliform - Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges- Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt chung là IMViC.  Coliforms chịu nhiệt: - Là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24h khi được ủ ở 44oC trong môi trường EC.  Coliforms phân (E.coli giả định): Là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24h ở 44.5oC trong môi trường Trypton. Feacal Coliform E.coli Là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++-- (Indol +, Methyl Red +, Voges Proskauer -, Citrate -). E.coli el on Sa lm – Coliforms là trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, lên mem lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ. – Coliforms chịu nhiệt = coliforms + lên men lactose và sinh hơi trên môi trường canh EC ở 44oC trong 24 giờ. – Coliforms phân = coliforms chịu nhiệt + sinh indol trong canh Trypton ở 44,5oC trong 24 giờ – E.coli = coliforms phân + IMViC la Tóm lại  Định lượng Coliforms, Coliform phân bằng pp đếm khuẩn lạc:  Nguyên tắc: -Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose & sinh acid sau khi ủ ở 37±1oC trong 24-48h. Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị như neutral red, crystal violet. -Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5mm. Xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật.  Định lượng Coliforms, Coliform phân bằng pp đếm khuẩn lạc:  Nguyên tắc: -Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL. Để định lượng Coliforms phân, thực hiện tương tự nhưng thay đổi nhiệt độ ủ là 440C. -Mật độ Coliforms hay Coliforms phân được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỉ lệ khẳng định và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa.