Tài liệu Dinh dưỡng ở vi sinh vật

Nội dung chuyên đề: Dinh dưỡng ở vi sinh vật Người viết: Ngô Thị Phương Thanh – Chuyên Yên Bái. I. Các chất dinh dưỡng của vi sinh vật 1. Các chất dinh dưỡng cần thiết 1.1. Nguyên tố đa lượng C, H, O, N, P, S và K. Các nguyên tố này có mặt trong tất cả các hợp chất (như protein, axit nucleic…) cấu tạo nên tế bào, cơ thể vi sinh vật. Riêng các nguyên tố C, H, O, N chiếm tới 90% đến 96% toàn bộ chất khô của tế bào. 1.2. Nguyên tố vi lượng Gồm các nguyên tố mà vi sinh vật cần với hàm lượng rất nhỏ nhưng không thể thiếu cho sự tăng trưởng, sinh sản của vi sinh vật. Các nguyên tố đó tham gia vào cấu tạo enzim, hoạt hóa enzim…đóng vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa. Ví dụ như: Mo, Mn... Lượng các nguyên tố cần ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau, tương ứng với các giai đoạn phát triển khác nhau, lượng các nguyên tố cần trong cùng một loài vi sinh vật cũng không giống nhau. 1.3. Nhu cầu về chất sinh trưởng của vi sinh vật Một số vi sinh vật muốn phát triển cần phải được cung cấp những chất sinh trưởng nhất định gọi là nhân tố sinh trưởng. Nhân tố sinh trưởng là những chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống của một loài vi sinh vật nào đó mà chúng không tự tổng hợp được từ các chất khác. Như vậy những chất được coi là nhân tố sinh trưởng của loại vi sinh vật này hoàn toàn có thể không phải là nhân tố sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật khác. Vi sinh vật tự dưỡng và một số vi sinh vật dị dưỡng (như Escherichia coli) thậm chí có thể sinh trưởng mà không cần bất kỳ nhân tố sinh trưởng nào. Mặt khác, cùng một loài vi sinh vật nhưng nhu cầu đối với nhân tố sinh trưởng cũng thay đổi tuỳ theo điều kiện môi trường. Ví dụ Mucor rouxii khi sinh trưởng trong điều kiện kị khí thì cần thiamin (B1) và biotin (H), nhưng trong điều kiện hiếu khí thì lại tự tổng hợp được các vitamin này. Thông thường, bổ sung vào môi trường các chất hữu cơ như cao nấm men, cao thịt, dịch đun động thực vật (nhộng, giá đỗ…) là có thể đáp ứng được nhu cầu về nhân tố sinh trưởng. Nhân tố sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật nào đó có thể là một trong các chất sau đây: các gốc kiềm purin, pirimidin và các dẫn xuất của chúng, các axit béo và các thành phần của màng tế bào, các vitamin thông thường... Câu hỏi vận dụng Câu 1: Nêu khái niệm vi sinh vật nguyên dưỡng, vi sinh vật khuyết dưỡng. Làm thế nào để nhận ra được vi sinh vật khuyết dưỡng. Hiểu về vi sinh vật khuyết dưỡng có ứng dụng gì trong thực tiễn. Trả lời: - Khái niệm + Vi sinh vật nguyên dưỡng là vi sinh vật có khả năng tự tổng hợp các nhân tố sinh trưởng cho chu kỳ sống của chúng. + Vi sinh vật khuyết dưỡng là vi sinh vật không có khả năng tổng hợp được nhân tố sinh trưởng (1 hoặc nhiều) cho chu trình sống của chúng. - Phương pháp + Tạo các môi trường nuôi cấy trong đó mỗi môi trường nuôi cấy thiếu một nhân tố sinh trưởng. Ở những môi trường nuôi cấy mà không thấy xuất hiện khuẩn lạc của vi sinh vật thì sẽ biết được vi sinh vật khuyết dưỡng về nhân tố sinh trưởng đó. - ứng dụng + Sử dụng vi sinh vật khuyết dưỡng người ta có thể xác định được loại thực phẩm giàu chất dinh dưỡng nào hoặc nghèo chất dinh dưỡng nào. + Hiểu được vi sinh vật khuyết dưỡng về nhân tố sinh trưởng nào mà người ta có thể tạo môi trường nuôi cấy thích hợp cho vi sinh vật phục vụ cho sản xuất sinh khối vi sinh vật. Câu 2. Nuôi vi khuẩn lactic trên các môi trường tổng hợp khác nhau chứa một dung dịch cơ sở (CS), rồi bổ sung thêm các thành phần, người ta thu được các kết quả sau: Môi trường 1: CS + axit folic + piridoxin: không mọc Môi trường 2: CS + riboflavin + piridoxin: không mọc Môi trường 3: CS + axit folic + riboflavin + piridoxin: mọc Môi trường 4: CS + axit folic + riboflavin: không mọc a.Cho biết các chất thêm vào môi trường cơ sở có vai trò như thế nào với vi khuẩn lactic? b. Người ta muốn định lượng hàm lượng axit folic trong cao nấm men bằng cách sử dụng chủng vi khuẩn trên. Có thể sử dụng môi trường nào? Trả lời: a. Các chất thêm vào môi trường CS là nhân tố sinh trưởng của vi khuẩn lactic, vì thiếu 1 trong 3 hợp chất trên vi khuẩn lactic không thể phát triển được. b. Vì trong cao nấm men có axit folic nên có thể sử dụng môi trường 2 khi đó môi trường nuôi cấy có đủ các nhân tố sinh trưởng thì vi khuẩn sẽ phát triển. Câu 3. Để nghiên cứu tác động của tryptophan lên sinh trưởng của vi trùng thương hàn, người ta cấy song song dịch huyền phù vi sinh vật này lên môi trường dinh dưỡng không chứa tryptophan và môi trường dinh dưỡng có chứa 30mg/l tryptophan. Sau 24 giờ nuôi ở nhiệt độ phù hợp người ta chỉ thấy có sự sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường có chứa tryptophan. a. Tryptophan là loại hợp chất gì đối với trùng thương hàn? b. Từ vi khuẩn thương hàn bằng cách chiếu tia tử ngoại (UV) với liều lượng hạn chế người ta thu được chủng 2 có khả năng tự tổng hợp được tryptophan. Vì sao? c. Để xác định nhu cầu tryptophan đối với vi trùng thương hàn có người nói nên sử dụng chủng 2 có đúng không? Trả lời: a. Tryptophan là nhân tố sinh trưởng của vi trùng thương hàn, vì thiếu hợp chất này chúng không phát triển được. b. Đã tạo chủng đột biến có khả năng tự tổng hợp được tryptophan c. Không nên sử dụng chủng 2 mà phải dùng chủng 1 là chủng khuyết dưỡng với tryptophan. Câu 4 a. Vi khuẩn lactic chủng 1 tự tổng hợp được axit folic và không tự tổng hợp được pheninalanin, còn vi khuẩn lactic chủng 2 thì ngược lại. Có thể nuôi 2 chủng này trên môi trường thiếu axit folic và pheninalanin nhưng đủ các chất dinh dưỡng khác được không? vì sao? b. Để vi khuẩn của chủng tụ cầu vàng sinh trưởng phát triển bình thường cần có nhân tố sinh trưởng là tiamin (VTM B1). Khi nuôi chủng tụ cầu vàng trong môi trường gồm nước, muối khoáng và nước thịt, chúng vẫn sống được. Hãy cho biết môi trường trên là môi trường gì? Giải thích tại sao chủng tụ cầu vàng lại sống được trên môi trường đó Trả lời: a. Hai chủng vi khuẩn lactic 1 và 2 là chủng vi khuẩn khuyết dưỡng. Khi nuôi trong cùng một môi trường không có nhân tố sinh trưởng là axit foclic và pheninalanin, chúng có thể phát triển được... b. Môi trường nuôi chủng tụ cầu vàng là môi trường bán tổng hợp vì thành phần của môi trường này gồm có muối khoáng và nước thịt. - Tiamin là nhân tố sinh trưởng của tụ cầu vàng, tuy nhiên trong nước thịt đã có nhân tố sinh trưởng nên chủng tụ cầu vàng này vẫn sống được trong môi trường gồm có muối khoáng và nước thịt. 2. Các nguồn dinh dưỡng thường sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật. 2.1. Nguồn thức ăn cacbon của vi sinh vật Căn cứ vào nguồn thức ăn cacbon người ta chia sinh vật thành các nhóm tự dưỡng và dị dưỡng. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể là các chất vô cơ (CO2...) hoặc chất hữu cơ (C6H12O6…). Thường sử dụng cacbohydrat làm nguồn cacbon khi nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Ví dụ: Xenlulo được đưa vào các môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân giải xenlulo dưới dạng giấy lọc, bông hoặc các dạng xenlulo; Trong công nghiệp lên men, rỉ đường là nguồn cacbon rẻ tiền và rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Ngoài ra, người ta có thể sử dụng các nguồn hữu cơ khác như lipit, protein làm nguồn cacbon. Ví dụ: Khi sử dụng lipit, parafin, dầu mỏ... làm nguồn cacbon nuôi cấy một số loài vi sinh vật, phải thông khí mạnh để tạo từng giọt nhỏ có thể tiếp xúc được với thành tế bào của vi sinh vật. Các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu...) có thể sử dụng vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với vi sinh vật. 2.2. Nguồn thức ăn nitơ của vi sinh vật Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NO 3- và NH4+. NH4+ sau khi được tế bào hấp thu có thể được trực tiếp sử dụng, còn NO 3- sau khi được hấp thụ cần khử thành NH4+ rồi mới được vi sinh vật sử dụng. Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp đối với nhiều loại nấm men và vi khuẩn. Thường sử dụng muối NH4NO3 để làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật. Nguồn nitơ dự trữ nhiều nhất trong tự nhiên chính là nguồn khí nitơ tự do (N2) trong khí quyển. Vi sinh vật còn có khả năng đồng hoá rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton loại chế phẩm thuỷ phân không triệt để của một nguồn protein nào đấy. 2.3. Nguồn thức ăn khoáng của vi sinh vật Khi tạo các môi trường tổng hợp (dùng nguyên liệu là hoá chất) bắt buộc phải bổ sung đủ các nguyên tố khoáng cần thiết. Nhu cầu khoáng của vi sinh vật cũng không giống nhau đối với từng loài, từng giai đoạn phát triển. II. Phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật Kiểu nuôi cấy chỉ chứa một loại vi sinh vật được gọi là nuôi cấy thuần khiết, còn nuôi cấy hỗn hợp là kiểu nuôi cấy chứa nhiều hơn một loại vi sinh vật. Các bước cần thiết cho nuôi cấy vi sinh vật như sau: - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy phù hợp với vi sinh vật, giúp cho sự sinh trưởng tốt nhất. - Tiệt trùng môi trường nuôi trước đó để loại bỏ các sinh vật sống không mong muốn có sẵn trong môi trường nuôi cấy. - Cấy vi sinh vật vào môi trường đã chuẩn bị. Thông thường môi trường nuôi cấy được chuẩn bị trong các bình nuôi phổ biến như ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri, nồi lên men… Môi trường dinh dưỡng thường khác nhau về tỷ lệ thành phần các chất dinh dưỡng. Ngoài ra về trạng thái môi trường nuôi cấy có hai dạng phổ biến là dạng rắn và dạng lỏng, dạng lỏng thường được áp dụng cho hệ thống nuôi cấy liên tục trong công nghiệp. * Căn cứ vào thành phần môi trường ta có 4 loại môi trường nuôi cấy: môi trường tự nhiên, môi trường tổng hợp, môi trường bán tổng hợp và môi trường sống. Các loại môi trường này khác nhau rất nhiều về hình thức và thành phần tùy theo loài vi sinh vật cần nuôi cấy cũng như tùy thuộc vào mục đích của công tác nuôi cấy. 1. Môi trường nuôi cấy tự nhiên Môi trường thuộc nhóm này được phân lập ra dựa trên kinh nghiệm hơn là dựa vào sự hiểu biết về thành phần dinh dưỡng đối với vi sinh vật nuôi cấy. Các môi trường tự nhiên được dùng phổ biến là: sữa, nước thịt bò, nước các loại rau củ hoặc ngũ cốc … Các loại môi trường này thường chứa đựng nhiều chất hữu cơ và vô cơ tan trong nước có thể đáp ứng yêu cầu về dưỡng chất của một số lớn vi sinh vật (không phải là tất cả). Ưu điểm: Dễ chuẩn bị và có thể sử dụng cho nhiều mục đích thông thường trong nghiên cứu vi sinh vật. Nhược điểm của loại môi trường tự nhiên là không biết chính xác thành phần dinh dưỡng cũng như thành phần dinh dưỡng của những lần chuẩn bị khác nhau sẽ rất khác nhau. Do đó kết quả nuôi cấy của các lần chuẩn bị môi trường khác nhau có thể sẽ không giống nhau. 2. Môi trường nuôi cấy tổng hợp Để khắc phục nhược điểm của môi trường nuôi cấy tự nhiên, người ta đã thiết lập các môi trường nuôi cấy tổng hợp, trong đó các thành phần dinh dưỡng của môi trường được xác định rõ về số lượng và chất lượng. Ưu điểm của các loại môi trường nuôi cấy tổng hợp là ta có thể biết rõ cũng như điều khiển thành phần dinh dưỡng của môi trường một cách dễ dàng. Với biện pháp tăng thêm hoặc bỏ bớt chất dinh dưỡng trong môi trường, chúng ta có thể biết rõ tác động của chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật. Ngoài ra, đây là loại môi trường rất chính xác nhờ đó tránh được sự thay đổi trong các lần chuẩn bị môi trường, cũng như sẽ là môi trường rất tốt cho các loại vi sinh vật đã được biết rõ nhu cầu dinh dưỡng của chúng. Nhược điểm của môi trường tổng hợp là giá thành cao, chuẩn bị khá phức tạp và mất thời gian hơn đối với môi trường tự nhiên và chỉ sử dụng cho từng loài vi sinh vật xác định được nhu cầu dinh dưỡng. Trường hợp vi sinh vật chưa xác định, không thể nuôi cấy trên môi trường loại này một cách bảo đảm. Kiểu môi trường này thích hợp sử dụng trong phạm vi phòng thí nghiệm. 3. Môi trường nuôi cấy bán tổng hợp Môi trường nuôi cấy bán tổng hợp là môi trường nuôi cấy tự nhiên được bổ sung thêm với một số chất dinh dưỡng được xác định. Ví dụ: khi nuôi cấy vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. oryzae người ta thường dùng môi trường tự nhiên. Tuy nhiên trong lúc cần phân lập và tách dòng vi khuẩn từ một tế bào thì vi khuẩn này mọc không được tốt trên môi trường đó. Để thực hiện công tác này người ta phải thêm vào môi trường một số lượng rất nhỏ Fe. Vi khuẩn sẽ mọc thành các khuẩn lạc rất tốt trên môi trường mới này. 4. Môi trường nuôi cấy sống Dùng để nuôi cấy một số vi sinh vật đặc biệt có tính kí sinh bắt buộc. Ví dụ: Virut không nuôi cấy được trên môi trường nuôi cấy nhân tạo, do đó cần nuôi cấy chúng trên sinh vật đang sống. Ví dụ: đối với virut gây bệnh đậu mùa, người ta nuôi cấy chúng trên con bò còn sống và sau đó thu thập virut trên con bò ấy để làm vacxin chủng bệnh đậu mùa. Phần lớn các virut ký sinh trên động vật chúng ta phải nuôi cấy trong phôi của trứng gà lộn hoặc trên chuột, thỏ… * Các loại môi trường chuyên dụng dùng cho các mục đích khác nhau như: - Môi trường chọn lọc: dùng cho sinh trưởng của một loại vi sinh vật bởi vì có chứa hóa chất ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật khác. Ví dụ: đưa bicromat kali vào môi trường để ức chế vi khuẩn nhằm phân lập xạ khuẩn dễ dàng hơn. - Môi trường làm giàu: Dùng cho sinh trưởng của một loại vi sinh vật, vì có chứa hóa chất rất cần cho sự sinh trưởng của vi sinh vật ấy. Vi sinh vật này có thể rất hiếm trong tự nhiên. Việc sử dụng môi trường này có thể tạo điều kiện cho chúng sinh trưởng tốt hơn lấn át các vi sinh vật khác, tới nồng độ quan sát được hoặc có thể phân lập được. Ví dụ: trong cát có rất ít vi sinh vật phân giải dầu mỏ so với các vi sinh vật khác. Để phân lập, người ta dùng dầu mỏ là nguồn cacbon duy nhất. Sau một thời gian ủ, số lượng các vi sinh vật phân giải dầu mỏ sẽ tăng lên. - Môi trường phân hóa: Môi trường có chứa thuốc nhuộm hoặc các hợp chất khác có thể tác động khi vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi chất, làm nổi bật đặc điểm đặc trưng giúp chúng ta định loại được vi sinh vật đó một cách dễ dàng. Ví dụ: một loại thuốc nhuộm hydrocacbon nhạy cảm với pH sẽ làm đổi màu khi vi khuẩn chuyển hóa đường sản sinh ra các sản phẩm thải có tính axit. * Căn cứ vào trạng thái của môi trường, người ta chia thành môi trường đặc và môi trường lỏng. - Môi trường đặc: là loại môi trường được làm đông đặc lại nhờ có bổ sung thêm thạch (agar), gelatin hay silica gel. - Môi trường lỏng là các môi trường không bổ sung các chấy làm đông đặc môi trường. Để thông khí phải dùng tới máy lắc hay các nồi lên men có hệ thống thổi khí vô trùng và hệ thống khuấy đảo làm tan đều bọt khí. Môi trường lỏng ngoài việc sử dụng trong nghiên cứu tại phòng thí nghiệm còn được sử dụng rộng rãi trong sản xuất lớn tại các nhà máy lên men công nghiệp. Câu hỏi vận dụng Câu 5. Làm thế nào để nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường đặc? - Để nuôi cấy VSV trên môi trường đặc, người ta thêm vào môi trường lỏng 1.52% thạch – aga. Đây là loại polisaccarit phức tạp chiết rút từ tảo đỏ ở biển và có một số ưu điểm phù hợp với việc nuôi cấy VSV. - Thạch không bị VSV phân giải, nóng chảy ở 100 oC, đông đặc khi để nguội 40- 40oC. Câu 6. Người ta cấy vi khuẩn Proteus vulgaris trên các môi trường lỏng có thành phần tính theo đơn vị g/l: NH4Cl – 1; FeSO4.7H2O - 0,01 ; K2HPO4 – 1; CaCl2 - 0,01; MgSO4.7H2O - 0,2; H2O - 1 lít; Các nguyên tố vi lượng (Mn, Mo,Cu, Zn): mỗi loại 2. 10-5 Bổ sung thêm vào mỗỗi loại mỗi trường: Các loại môi trường M1 M2 Glucose 0 5g Axit nicotinic 0 0 Cao nấm men 0 0 Chất bổ sung M3 5g 0,1mg 0 M4 5g 0 5g Sau 24h nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ phù hợp, người ta thấy có sự sinh trưởng của vi khuẩn trên các môi trường M3, M4 còn trên môi trường M1 và M2 không có vi khuẩn phát triển. - Các môi trường M1, M2, M3 và M4 thuộc loại môi trường gì? - Nêu vai trò của axit nicotinic đối với vi khuẩn Proteus vulgaris? - Vai trò của cao nấm men trong môi trường nuôi cấy là gì? Trả lời: - M1: MT tối thiểu. - M2, M3: MT tổng hợp. - M4: MT bán tổng hợp. - Axit nicotinic là nhân tố sinh trưởng vì thiếu nó (môi trường M1, M2) vi khuẩn không phát triển. - Cao nấm men: giàu các hợp chất vitamin ( nhất là vitamin nhóm B) và các axit amin quan trọng khác trong đó có thành phần axit nicotinic, do đó cũng đóng vai trò cung cấp nhân tố sinh trưởng cho vi sinh vật III. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 1. Phương pháp nghiên cứu virut. * Môi trường nuôi cấy virut - Nuôi cấy trong cơ thể sinh vật là vật chủ của virut. - VR không nuôi cấy được ở trong các môi trường khác: vì virut thiếu các enzim dành cho chuyển hóa vật chất, không có riboxom và các thành phần khác của bộ máy tổng hợp protein, nên phải dựa hoàn toàn vào tế bào chủ => VR sống kí sinh nội bào bắt buộc. * Ứng dụng: - Nuôi cấy virut nhằm phục vụ các công tác như nghiên cứu để sản xuất vacxin, sử dụng virut trong kĩ thuật di truyền với vai trò là vectơ chuyển gen… * Chu trình nhân lên của virut: Gồm 5 giai đoạn: Hấp phụ, xâm nhập, sinh tổng hợp, lắp ráp và phóng thích. Câu hỏi vận dụng Câu 7. Năm 1957, Franken và Conrat đã tiến hành thí nghiệm chứng minh vật chất di truyền của virut là axit nucleic như thế nào? Trả lời: - Thí nghiệm của franken và conrat: + Chọn 2 chủng virut A và B đều có khả năng gây bệnh khảm thuốc lá, nhưng khác nhau ở các vết tổn thương trên lá. + Tách lõi ARN ra khỏi vỏ protein của hai chủng virut A và B. + Lấy axit nucleic của chủng A trộn với protein của chủng B →virut lai. + Cho nhiễm chủng virut lai vào cây → cây bị bệnh. + Phân lập từ lá cây bị bệnh sẽ được chủng virut A. Câu 8. Có một loài virut gây bệnh mới được phát hiện, virut này có thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm bằng cách cho lây nhiễm vào các tế bào vi khuẩn. Hãy mô tả thí nghiệm dùng để xác định xem virut này có vật chất di truyền là ADN hay ARN trên cơ sở sử dụng phương pháp dùng đồng vị phóng xạ. Trả lời: - Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên hai môi trường: + Môi trường 1: được bổ sung uracil (U) đánh dấu phóng xạ. + Môi trường 2: được bổ sung thymine (T) đánh dấu phóng xạ. - Rồi cho virut lây nhiễm vào vi khuẩn ở hai môi trường. Sau khi virut đã lây nhiễm vào tế bào vi khuẩn và tạo ra các hạt virut mới, thu các hạt virut được tổng hợp mới (từ các vết tan). - Xác định xem mẻ nuôi cấy trong môi trường nào phát xạ. Nếu virut chứa ARN thì các virut thu được tử mẻ nuôi cấy trong môi trường 1 sẽ phát phóng xạ, trong khi các virut thu được ở môi trường 2 thì không. Nếu virut chứa ADN thì virut thu được từ mẻ nuôi cấy trong môi trường 2 sẽ phát phóng xạ, trong khi các virut thu được từ môi trường 1 thì không. Câu 9. Chứng minh phagơ chỉ đưa axit nucleic vào mà không đưa vỏ protein. Trả lời: Sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ, dùng virut có lõi axit nucleic P 32, vỏ S35 cho tấn công Ecoli. Khi virut nhân lên trong tế bào chủ thì thế hệ virut con mang vỏ protein mới không chứa chất đồng vị phóng xạ => chỉ có axit nucleic P 32 trong tế bào vi khuẩn, vỏ nằm ngoài thành tế bào chủ. Câu 10. Bằng cách gây đột biến, người ta có thể tạo ra các tế bào hồng cầu của người mang thụ thể CD4 trên bề mặt. Điều gì sẽ xảy ra nếu đưa các tế bào này vào bệnh nhân nhiễm HIV? Trả lời: - Virut chỉ xâm nhập vào tế bào nếu chúng tìm được thụ thể phù hợp. Trong quá trình biệt hoá từ tế bào gốc, tế bào hồng cầu bị mất nhân, tức là không có ADN. Nếu virut xâm nhập vào tế bào hồng cầu thì không nhân lên được. Đây có thể là một giải pháp chống HIV trong tương lai. Câu 11. Vacxin là gì? Cơ chế tác động của vacxin. + Vacxin là những vi sinh vật gây bệnh đã được làm suy yếu, tiêm vào cơ thể, vacxin đóng vai trò kháng nguyên kích thích các tế bào tủy xương tăng cường sản xuất bạch cầu limpho. Các bạch cầu có chức năng sản xuất kháng thể đặc hiệu chống lại kháng nguyên gây bệnh. Phản ứng được ghi nhớ trong tế bào tủy xương. + Khi có vi sinh vật thực sự xâm nhập vào cơ thể thì tế bào nhớ nhanh chóng sản xuất ra một số lượng lớn bạch cầu limpho → sản xuất ra nhiều kháng thể tiêu diệt kháng nguyên gây bệnh. Kháng nguyên + kháng thể → phản ứng miễn dịch đặc trưng. 2. Phương pháp nghiên cứu các vi sinh vật khác a. Phương pháp tạo chủng vi sinh vật thuần khiết - Để tách một tế bào vi sinh vật ra và nuôi cấy thành một chủng thuần khiết hiện nay người ta sử dụng phương pháp Roberkoch. - Roberkoch là người sáng lập ra phương pháp tách biệt vi khuẩn bằng cách dùng môi trường đặc. - Các bước: Bước 1: Chế tạo môi trường dinh dưỡng thích hợp: môi trường có pha thêm thạch hoặc gelatin. Bước 2: Pha loãng mẫu trong nước vô trùng rồi cấy lên môi trường đặc. Bước 3: Nuôi cấy mẫu ở nhiệt độ thích hợp từ một tế bào sinh sản tạo khuẩn lạc là những đốm nhỏ, mỗi khuẩn lạc gồm nhiều cá thể bắt đầu từ một tế bào ban đầu. - Dựa vào khuẩn lạc người ta có thể: + Đếm khuẩn lạc xác định số lượng vi khuẩn ban đầu. + Tách biệt từng loại vi khuẩn để nghiên cứu riêng. Bước 4: Dùng đũa cấy vô trùng cấy khuẩn lạc sang môi trường mới là ống thạch để nghiêng được chủng vi sinh vật thuần khiết. * Ứng dụng: - nhờ phân lập mà ta thu được các chủng vi sinh vật thuần khiết từ môi trường tự nhiên hoặc từ các ống giống đã bị nhiễm các vi sinh vật khác. - Nhờ các chủng vi sinh vật thuần khiết mà ta nghiên cứu được các mặt hình thái, sinh lý, sinh hóa, di truyền của vi sinh vật để chủ động ứng dụng vào sản xuất. Câu hỏi vận dụng Câu 12. Dưới kính hiển vi người ta có thể quan sát được 1 đơn vị diện tích chứa trung bình 50 tế bào nấm men. Sau 4 giờ dung dịch được pha loãng 10 lần. Người ta lại làm tiêu bản hiển vi như cách làm ban đầu. Lần này trên 1 đơn vị diện tích trung bình có 80 tế bào. Hãy cho biết thời gian thế hệ là bao nhiêu giờ? (nguồn: đề Yên Bái 2010 – 2011) Trả lời: Áp dụng công thức: Nt = N0. 2x  Dung dịch pha loãng 10 lần => số tế bào sau 4 giờ trên 1 đơn vị diện tích là: Nt = 80 x 10 = 800 =>50. 2x = 800 => x = 4 (thế hệ) Thời gian thế hệ là: 4 giờ : 4 = 1 giờ Từ 5 tấn tôm nguyên liệu mới nhập về, nhân viên phòng TN đã lấy 1 kg mẫu đem xác định vi sinh vật. Câu 13. Có 250 g nguyên liệu được đem nghiền nát trong máy chuyên dụng sau đó được bổ sung nước cất vô trùng cho đủ 500 ml Nhân viên phòng thí nghiệm chuẩn bị 5 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất vô trùng. Lấy 1ml dịch nghiền cho vào ống nghiệm thứ nhất rồi lắc đều ống nghiệm, sau đó lại hút 1 ml huyền phù từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2 và tiếp tục làm như thế cho tới khi 1 ml huyền phù từ ống nghiệm 4 được cho vào ống nghiệm 5. Lấy 3 hộp petri mỗi hộp cho vào 1 ml huyền phù từ ống nghiệm 5 để nuôi cấy với mục đích xác định vsv tổng số. Kết quả đĩa 1 có 78 khuẩn lạc, đĩa 2 có 57 khuẩn lạc, đĩa 3 có 60 khuẩn lạc, hãy cho biết a. Mục đích của việc sử dụng 5 ống nghiệm nói trên. b. So sánh mật độ vi khuẩn giữa các ống nghiệm. c. Số vi khuẩn có trong 1 kg tôm nguyên liệu. d. Nhân viên thu mẫu nhưng để qua đêm mới làm thì kết quả kiểm nghiệm còn ý nghĩa không? Tại sao. Trả lời: a. việc sử dụng 5 ống nghiệm nước cất nhằm mục đích pha loãng VSV từ mẫu ban đầu. b.mật độ vi khuẩn của ống nghiệm sau bằng 1/10 mật độ ở ống nghiệm liền trước c. ở VSV qua quá trình nuôi cây bằng phương pháp pha loãng 1 khuẩn lạc có nguồn gốc từ 1 VK - số VK trong 1ml huyền phù từ ống nghiệm 5 là (78 + 57 + 60)/3 = 65 - Số VK có trong 1 ml dịch nghiền là 65 x 105 - Số VK có trong 250 g mẫu là 65 x 105 x 500 - số VK có trong 1 kg mẫu là 65 x 105 x 500 x 4 d. Nếu không bảo quản lạnh, thời gian giữ mẫu qua đêm kết quả kiểm tra không còn ý nghĩa. Số VSV đếm được có thể tăng nhiều so với thời điểm lấy mẫu Câu 14. Từ một dịch nuôi phagơ T4 (lây nhiễm vi khuẩn E. coli) có mật độ chưa biết (ống ), người ta tiến hành pha loãng theo dãy như hình dưới đây. Từ ống cuối (ống ), dùng pipet hút ra 3 lần, mỗi lần 0,1 mL (mililít) rồi tiến hành cấy trải trên 3 đĩa Petri chứa môi trường giàu dinh dưỡng. Qua đêm, người ta xác định được số lượng vết tan trên 3 đĩa Petri lần lượt là 11, 12 và 16. Giả sử mỗi vết tan tương ứng với một phagơ T4, thì mật độ phagơ T4 trong 1,0 mL dịch nuôi ban đầu (ống ) là bao nhiêu? Nêu cách tính. (Đề QG 2013) 0,1 mL ỐỐng  0,1 mL 1,0 mL 9,9 mL mỗi trường lỏng 9,9 mL mỗi trường lỏng ỐỐng  ỐỐng  3,1 mL 9,0 mL mỗi trường lỏng ỐỐng  0,1 mL 6,9 mL mỗi trường lỏng ỐỐng  Trả lời: - Mức pha loãng từ ống  đến ống  là: 10-2 x 10-2 x 10-1 x 3,1 x 10-1 = 3,1 x 10-6 - Nếu coi mỗi vết tan tương ứng với 1 (đơn vị lây nhiễm) phagơ T4 thì từ kết quả thí nghiệm xác định được mật độ phagơ trong ống  là: Số tế bào trung bình (11, 12, 16) x 101 = 13 x 10 Vậy mật độ của phagơ T4 ở ống  là: [13x10/3,1] x 106  4,2 x 107 phagơ / ml b. Phương pháp nhuộm màu tế bào sinh vật Phương pháp được sử dụng khi muốn xác định hình dạng tế bào, nhận biết vi khuẩn gram dương, vi khuẩn gram âm hoặc quan sát NST qua tiêu bản tế bào vi sinh vật…v.v… * Phương pháp nhuộm đơn tế bào Chuẩn bị: thuốc nhuộm xanh metilen, fucshin, dung dịch nấm men. Cách tiến hành: Bước 1: Dùng que cấy lấy một ít dịch nấm men cho vào ống nghiệm có sẵn 5ml nước, khuấy đều Bước 2: Dùng que cấy lấy một giọt dung dịch này cho lên lam kính → hong khô. Bước 3: Dùng pipet nhỏ một giọt fucshin vào vị trí đã nhỏ giọt dung dịch khô. Bước 4: Để 1 phút rồi nghiêng phiến kính đổ fucshin đi. Bước 5: Rửa nhẹ tiêu bản → hong khô, soi kính. * Phương pháp nhuộm Gram Chuẩn bị: Dung dịch tím kết tinh, dung dịch lugol, dung dịch tẩy màu: cồn 95 o; dung dịch nhuộm bổ sung fucshin. - Đèn cồn, lam kính, lamen, kính hiển vi, que cấy. Cách tiến hành Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào một giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. Bước 2: Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Bước 3: Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Bước 4: Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô => iot tạo phức với tím kết tinh -> giúp bền màu Bước 5: Nhỏ dịch tẩy màu (cồn), giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. => gram – không màu; gram + màu tím. Bước 6: Nhuộm bổ sung bằng dung dịch fucshin đỏ trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Bước 7: Soi kính: dùng vật kính dầu 100´. Kết quả: G + màu tím, Gram – màu đỏ Giải thích: bản thân PG không bị nhuộm màu, nhưng ngăn cả sự thất thoát của tím kết tinh. Khi tẩy bằng cồn, G+ do có thành dày nên giữ được màu, G- lớp PG mỏng nên khi tẩy cồn làm mất màu, màu hồng của G – là màu của thuốc nhuộm bổ sung Câu 15. Nêu cơ sở hóa học của phương pháp nhuộm Gram? Ý nghĩa của phương pháp nhuộm Gram? Trả lời: - Phương pháp nhuộm Gram là phương pháp nhuộm kép. Một lần nhuộm bằng thuốc nhuộm màu tím, một lần bằng thuốc nhuộm màu đỏ. - Cơ sở hóa học: Do cấu tạo thành TB VK Gram (–) và Gram (+) khác nhau nên bắt màu thuốc nhuộm khác nhau. + VK Gram (-): Có lớp peptidoglucan mỏng, nằm giữa lớp màng sinh chất và màng ngoài. Màu tím kết tinh dễ dàng bị rửa trôi khỏi tế bào chất và TB có màu hồng hoặc đỏ của thuốc nhuộm bổ sung. + VK Gram (+): có thành TB dày, được tạo thành từ peptidoglucan. Hợp chất này giữ màu tím kết tinh trong tế bào chất. Việc rửa cồn không loại bỏ được tím kết tinh, ngăn chặn màu hồng hoặc đỏ. - Ý nghĩa: + sinh học: Phân loại được vi khuẩn dựa trên sự khác biệt về thành phần thành tế bào. + thực tiễn: Ứng dụng điều trị. Phần lipit của lớp LPS trong thành của vi khuẩn Glà độc, gây sốt hoặc gây sốc; màng ngoài giúp bảo vệ tế bào khỏi hàng rào bảo vệ của cơ thể. Vi khuẩn G- có xu hướng kháng lại kháng sinh tốt hơn vi khuẩn G+ do lớp màng ngoài ngăn cản thuốc vào trong tế bào. c. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật Điểm phân biệt Đặc điểm Mục đích Kết quả Nuôi cấy không liên tục Môi trường nuôi cấy: không bổ sung thêm chất dinh dưỡng không lấy đi các chất tạo thành. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Xảy ra pha suy vong. Tuy nhiên, một số tế bào có thể hình thành bào tử. Nuôi cấy liên tục Liên tục bổ sung chất dinh dưỡng và lấy đi các sản phẩm tạo thành. Thu nhận sinh khối, sản xuất chất kháng sinh… Không xảy ra pha suy vong. Câu 16. Nuôi vi khuẩn E.coli trong môi trường có cơ chất là gluco cho đến khi đang ở pha log, đem cấy chúng sang các môi trường sau: - Môi trường 1: có cơ chất là gluco. - Môi trường 2: có cơ chất là manto. - Môi trường 3: có cơ chất là gluco và manto. Các môi trường đều trong hệ thống kín. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn E.coli gồm những pha nào trong từng môi trường nói trên? Giải thích. Trả lời: - Các môi trường đều trong hệ thống kín, có nghĩa là cơ chất chỉ được cung cấp một lần và chất thải không được lấy ra. - Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trong hệ thống kín gồm 4 pha: pha lag, pha log, pha cân bằng, pha suy vong. - Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn tương ứng với các môi trường như sau: + Môi trường 1: cơ chất là gluco, đường cong sinh trưởng gồm 3 pha: pha log, pha cân bằng, pha suy vong. Vì môi trường cũ và mới đều có cơ chất là gluco, mà ở môi trường cũ vi khuẩn đang ở pha log, nên cấy sang môi trường gluco mới, vi khuẩn không phải qua giai đoạn thích ứng với cơ chất mới nên không có pha lag. + Môi trường 2: Đường cong sinh trưởng gồm đầy đủ cả 4 pha: pha lag, pha log, pha cân bằng, pha suy vong. Vì manto là cơ chất mới, nên vi khuẩn phải trải qua giai đoạn thích ứng, tiết ra các enzim phân giải cơ chất mới nên có pha lag. + Môi trường 3: Đường cong sinh trưởng gồm 1 pha lag, 2 pha log, 1 pha cân bằng, 1 pha suy vong. Vì vi khuẩn đang ở pha log trong môi trường gluco ban đầu được cấy sang môi trường mới có đồng thời hai cơ chất gluco và manto thì vi khuẩn sẽ sử dụng gluco trước, nó sẽ sinh trưởng theo pha log, khi sử dụng hết gluco thì chúng phải thích ứng với cơ chất mới nên các pha tiếp theo là pha lag, pha log, pha cân bằng và pha suy vong. IV. Các kiểu dinh dưỡng ở vi sinh vật 1. Dinh dưỡng Cacbon Vi sinh vật có thể được chia thành các loại khác nhau về kiểu dinh dưỡng. Các cơ thể hấp thu năng lượng từ ánh sáng được gọi là quang dưỡng và các cơ thể hấp thu năng lượng từ các hợp chất hóa học được gọi là hóa dưỡng. Các cơ thể chỉ cần các hợp chất vô cơ như CO2 làm nguồn cacbon được gọi là tự dưỡng. Trái lại các cơ thể dị dưỡng đòi hỏi ít nhất một chất dinh dưỡng hữu cơ như glucô để hình thành các hợp chất hữu cơ khác. Kết hợp các khả năng trên về nguồn năng lượng và nguồn cacbon người ta chia các hình thức dinh dưỡng thành 4 kiểu được tóm tắt ở sơ đồ dưới đây: Hóa học Nguồn năng lượng Ánh sáng HÓA DƯỠNG QUANG DƯỠNG Nguồn Cacbon Nguồn Cacbon Chất hữu cơ HÓA DỊ DƯỠNG Nấm, động vật nguyên sinh, phần lớn vi khuẩn không quang hợp. CO2 HÓA TỰ DƯỠNG Chất hữu cơ QUANG DỊ DƯỠNG Các vi khuẩn oxi hóa hidro, vi khuẩn nitrat hóa, vi khuẩn sắt, vi khuẩn oxi hóa lưu huỳnh. CO2 QUANG TỰ DƯỠNG Vi khuẩn không chứa lưu huỳnh màu lục, màu tía Vi khuẩn lam, tảo đơn bào, vi khuẩn lưu huỳnh màu lục, màu tía. a. Các con đường trao đổi chất cơ bản ở vi sinh vật tự dưỡng * Quang tự dưỡng (quang hợp): Quang hợp là quá trình sử dụng năng lượng ánh sáng để tổng hợp chất hữu cơ từ các nguyên liệu vô cơ. Quá trình quang hợp ở vi khuẩn tương tự như ở thực vật, cũng gồm hai pha: pha sáng (pha quang photphoril hóa) và pha tối (pha cố định CO2). Ở pha sáng: năng lượng ánh sáng được truyền sang ATP; electron từ nguồn vô cơ (chất cho e) truyền sang NAD+, khử NAD+ thành NADH. Tuy nhiên vi khuẩn quang hợp được chia thành hai loại: vi khuẩn quang hợp th ải oxi và vi khu ẩn quang h ợp khỗng th ải oxi. S ự khác nhau giữa hai loại quang hợp này được thể hiện trong bảng sau: Tiêu biệt chí phân QUANG TỰ DƯỠNG Quang hợp thải oxi Quang hợp không thải oxi Đại diện Vi khuẩn lam, tảo lục Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục, màu tía Sắc tô quang hợp Chlorophin a Khuẩn diệp lục Quang hệ II Có Không Chất cho electron H2O H2S hoặc S Giải phóng oxi Sản phẩm thành Có Không tạo ATP và NADH ATP Quang hợp thải oxi ở vi khuẩn lam và tảo lục giống như ở thực vật, phương trình tổng quát có dạng như sau: CO2 + H2O (ánh sáng)  (CH2O) + O2. Quang hợp không thải oxi đã được Van Niel chứng minh năm 1931 và đưa ra phương trình chung: CO2 + 2H2A (ánh sáng)  (CH2O) + H2O + 2A. Trong đó: H2A là chất cho điện tử, ở vi khuẩn lưu huỳnh là H 2S, do đó khi oxi hóa H2S sẽ dẫn đến giải phóng S hoặc H2SO4: CO2 + 2H2S (ánh sáng)  (CH2O) + H2O + 2S 2CO2 + H2S + 2H2O (ánh sáng)  2(CH2O) + H2SO4 Ngoài ra nhóm vi khuẩn này còn có thể dùng S làm chất cho điện tử: 3CO2 + 2S + 5H2O (ánh sáng)  3(CH2O)+ 2H2SO4. Năng lượng thu được từ quá trình quang photphoril hóa được vi sinh vật tự dưỡng dùng để cố định CO2 ở pha tiếp theo. * Hóa tự dưỡng: Hóa tự dưỡng là quá trình sử dụng năng lượng hóa học từ các chất vô cơ như H2S, NH3, Fe2+... để tổng hợp chất hữu cơ từ chất vô cơ là CO2. Kiểu dinh dưỡng này chỉ có ở một số sinh vật nhân sơ. Phương trình tổng quát: A (Chất vô cơ) + O2 -> AO2 + Q CO2 + RH2 + Q -> chất hữu cơ Phân biệt các nhóm vi khuẩn hóa tổng hợp Nhóm vi Đặc điểm khuẩn hóa tự dưỡng Nhóm khuẩn Phương trình tổng quát vi Oxi hóa H2S tạo ra 2H2S + O2 -> 2H2O + 2S + Q lấy năng lượng rồi sử Vai trò Góp làm phần sạch năng lượng từ các hợp chất chứa lưu huỳnh dụng một phần 2S + 2H2O + 3O2 -> 2H2SO4 + Q nhỏ năng lượng đó CO2 + 2H2S + Q -> 1/6C6H12O6 + H2O + 2S để tổng hợp chất hữu cơ. môi trường nước Nhóm vi khuẩn lấy năng lượng từ các hợp chất chứa nitơ Vi khuẩn nitrit 2NH3 + 3O2 -> 2HNO2 + 2H2O + Q. hóa(nitrosomanas: CO2 + 4H + Q -> 1/6C6H12O6 + H2O oxi hóa NH3 thành axit nitrơ để lấy năng lượng. Đảm bảo chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Nhóm vi khuẩn lấy năng lượng từ các hợp chất chứa sắt Oxi hóa Fe2+ thành 4FeCO3 + O2 + 6H2O -> 4Fe(OH)3+ 4CO2+ Q. Fe3+ để lấy năng CO2 + 4H + Q -> 1/6C6H12O6 + H2O lượng. Vi khuẩn nitrat 2HNO2 + O2 -> 2HNO3 + Q. 6 – 7 % hóa (nitrobacter): CO + 4H + Q -> 1/6C H O + H O 2 6 12 6 2 năng lượng oxi hóa HNO2 giải phóng thành HNO3. được sử dụng để tổng hợp đường. Nhóm khuẩn hidro Một phần năng lượng được sử dụng để tổng hợp chất hữu cơ. Tạo Fe(OH)3 lắng đọng  mỏ sắt. vi Oxi hóa H2 và sử dụng một phần năng lượng được sử dụng để tổng hợp chất hữu cơ. b. Các con đường trao đổi chất cơ bản ở vi sinh vật dị dưỡng * Hóa dị dưỡng