Tài liệu Dịch tễ học phân tử bệnh lao tại việt nam (2003-2009)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ Công trình được hoàn thành tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Đặng Đức Anh 2. GS. TS. Trần Văn Sáng NGUYỄN THỊ VÂN ANH Phản biện 1: PGS. TS. Đoàn Huy Hậu, Học viện Quân Y DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ BỆNH LAO TẠI VIỆT NAM (2003-2009) Phản biện 2: PGS. TS. Bùi Đức Dương, Bộ Y tế Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Thị Tuyến, Đại học Y Hà Nội Chuyên nghành:Y tế công cộng Luận án sẽ được bảo vệ tạị hồi đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Mã số: 62.72.03.01 Vào hồi 9 giờ sáng, ngày 19 tháng 9 năm 2012 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y TẾ CÔNG CỘNG Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện quốc gia 2. Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 3. ............. HÀ NỘI - 2012 1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFB AIDS CAS CR DR EAI EMB INH IS LAM LSP MIRUsVNTR MPTR SNP PAUP PCR PGRS Acid Fast Bacillus Arquired Immunodeficiency Syndrom Central Asian Clustering rate Direct Repeat East African Indian Ethambutol Isoniazid Insertion Sequence Latin American and Mediterranean large-Sequence Polymorphisms Mycobacterial Interspered Repetitive Units - Variable Number of Tandem Repead Major Polymorphic Tandem Repeat Synonymous Single Nucleotide polymorphisms Phylogenetic Analysis Using Parsimony Polymerase Chain Reaction RMP SM SpolDB4 Polymorphic GC-rich Repetitive Sequence Restriction Fragment Length Polymorphism Rifampicin Streptomycin Spoligotyping database 4 ST VNM WHO Spoligotype Vietnam World Health Organization RFLP Trực khuẩn kháng axit Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải Trung Á Tỷ lệ tạo cụm Lặp lại trực tiếp Đông Phi Ấn Ethambutol Isoniazid Đoạn xen Mỹ la tinh và Địa trung hải Đa hình trình tự lớn Đoạn lặp rải rác chứa đơn vị lặp lại liên tiếp đa dạng thuộc Mycobacteria Trình tự lặp lại liên tiếp đa dạng chủ yếu Điểm đa hình Phân tích phả hệ sử dụng Parsimony Phản ứng chuỗi polymerase Trình tự lặp lại đa dạng giầu GC Đa hình độ dài đoạn giới hạn Rifampicin Streptomycin Cơ sở dữ liệu spoligotyping 4 Typ spoligo Viet Nam Tổ chức Y tế Thế giới ĐẶT VẤN ĐỀ Đến nay bệnh lao vẫn là nguyên nhân gây tử vong thứ hai, sau bệnh AIDS trong số bệnh nhiễm khuẩn, gây ra khoảng 2 triệu ca tử vong mỗi năm trên toàn thế giới. Theo báo cáo của WHO năm 2010, ước tính Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao nhất toàn cầu. Trong khu vực Tây - Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philippin về số lượng ca lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm. Các phác đồ điều trị hiệu quả đã làm giảm nhanh tỷ lệ mắc lao ở các nước phát triển. Vì vậy 85% số ca bệnh trên toàn cầu hiện nay tập trung tại các nước đang phát triển. Trên thực tế, cùng với tăng dân số, biến động chính trị, di cư, sự phát triển của lao kháng thuốc và đại dịch HIV/AIDS, số ca mắc lao ở thời điểm hiện tại lớn hơn số ca mắc lao tại bất kỳ thời điểm nào trong lịch sử loài người. Đáng buồn là phương tiện để khống chế bệnh lao hiện nay là một kỹ thuật xét nghiệm đã 100 năm tuổi, một vắc xin sử dụng cách đây 80 năm và những loại thuốc đã được áp dụng từ 50 năm trước. Những công cụ này không đáp ứng được mục tiêu thanh toán lao, vì thế cần phải có những công cụ hiệu quả hơn. Trong công cuộc loại trừ bệnh lao, dịch tễ học phân tử bệnh lao đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp nền tảng cơ sở khoa học cho xây dựng và phát triển các công cụ mới đồng thời xây dựng chiến lược kiểm soát phù hợp và hiệu quả. Các cơ sở khoa học bao gồm sự khác biệt về cấu trúc quần thể vi khuẩn lao lưu hành tại mỗi mỗi khu vực ảnh hưởng như thế nào tới hiệu quả của chiến lược phòng chống bệnh trong đó có điều trị, phát triển vắc-xin, thuốc chống lao và các phương tiện chẩn đoán; Vi khuẩn lao trẻ em có khác biệt gì so với vi khuẩn lao người lớn; Sự khác biệt này có ảnh hưởng gì tới chiến lược phát triển vắc-xin; Các chủng lao thuộc các dòng các typ phân tử khác nhau có vai trò thế nào trong dịch tễ học bệnh lao tại mỗi khu vực địa lý; Động năng của quá trình lây truyền bệnh trong cộng đồng như thế nào; Nhóm nào là nhóm nguy cơ cao. Những yếu tố nguy cơ nào gây ra sự lan truyền bệnh lao.Yếu tố nguy cơ nào có thể dự phòng được. Dịch tễ học phân tử bệnh lao đã được nghiên cứu tại nhiều nơi trên thế giới. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật phân tử để phân loại, xác định đặc tính phân tử chủng vi khuẩn lao để đánh giá tình hình bệnh lao, sự phân bố của vi khuẩn lao kiểu gen Bắc Kinh và mối liên quan đến tính kháng thuốc. Nghiên cứu này đã phân tích tình hình dịch tễ học phân tử của bệnh lao trên nhiều khía cạnh ở Việt Nam dựa trên phân 2 tích yếu tố căn nguyên vi khuẩn và thông tin dịch tễ. Nghiên cứu sử dụng các công cụ phân tích phân tử cập nhật nhất hiện thời và các kỹ thuật phân tích thống kê mạnh nhất nhằm đạt được các mục tiêu sau: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Mô tả đặc điểm phân bố dòng, dưới dòng của vi khuẩn lao lưu hành tại một số tỉnh khu vực đồng bằng Bắc bộ và vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2003-2009. 2. Xác định mức độ kháng thuốc của các dòng, xác định phân bố dòng của quần thể theo mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2005-2008. 3. Tìm hiểu đặc điểm chủng vi khuẩn lao phân lập từ trẻ em, giai đoạn 2005-2009. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đa dạng phân tử vi khuẩn lao một số tỉnh khu vực đồng bằng Bắc bộ. - Phát hiện các trường hợp tái nhiễm lao. - Điểm khác biệt dịch tễ học phân tử bệnh lao giữa ba khu vực nghiên cứu tại ba miền Bắc, Trung và Nam. - Mức độ kháng thuốc của các dòng vi khuẩn lao tại 3 miền Bắc, Trung và Nam. - Phân bố dòng và typ phân tử theo mức độ kháng thuốc. - Tương quan của các kháng thuốc trong vi khuẩn lao Việt Nam. - Đặc điểm chủng vi khuẩn lao phân lập từ trẻ em, so sánh với chủng lao người lớn. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Mô tả được đặc điểm phân bố dòng/ dưới dòng của vi khuẩn lao đang lưu hành tại khu vực đồng bằng Bắc bộ và vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2003-2009. Ảnh hưởng của khu vực, (thành phố, nông thôn), vùng, miền (đồng bằng Bắc bộ, miền Bắc, Trung, Nam), và cách chọn mẫu (Bệnh viện, cộng đồng) đến phân bố của vi khuẩn lao. - Phát hiện về tái nhiễm lao trong điều trị và quản lý bệnh lao. - Cho biết mức độ kháng thuốc của các dòng lao khác nhau tại ba miền Bắc, Trung và Nam;Cấu trúc quần thể vi khuẩn lao ở các mức độ kháng thuốc khác nhau;Sự phối hợp của các kháng thuốc trong công thức kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam. - Mức độ kháng thuốc và đặc điểm phân tử của chủng vi khuẩn lao trẻ em; Điểm khác nhau giữa vi khuẩn lao trẻ em và vi khuẩn lao người lớn. 3 CẤU TRÚC LUẬN ÁN Đặt vấn đề: 3 trang Chương 1. Tổng quan: 58 trang Chương 2. Đối tượng và phương pháp: 24trang Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 39 trang Chương 4. Bàn luận: 40 trang Kết luận: 2 trang Kiến nghị: 1 trang Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Dịch tễ học bệnh lao Bệnhlao gây bởi vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Vi khuẩn lao có kích thước 0,5 x 2-5µm, không vỏ, không lông và không sinh nha bào, hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển nội bào. Thời gian cho một chu trình phân chia từ 12 đến 18 giờ. Bệnh lao lây theo đường hô hấp, ăn uống và tiếp xúc qua da tuy hiếm gặp. Nguồn lây chủ yếu là bệnh nhân lao phổi soi kính có AFB dương tính. Mỗi năm có khoảng 9 triệu trường hợp lao mới và 2 triệu ca tử vong, trong đó 0,4 triệu là bệnh nhânHIV dương tính. Bệnh lao có mặt ở tất cả các quốc gia trên thế giới nhưng tập trung chủ yếu tại châu Phi (30%) và châu Á (55%). Tám mươi phần trăm tổng số ca trên toàn cầu thuộc về 22 nước có tỷ lệ bệnh lao cao nhất. Số lao kháng đa thuốc khoảng 0,4-0,5 triệu, số lưu hành lớn gấp 2-3 lần.Tính tới tháng 1/ 2010, số quốc gia thông báo có lao siêu kháng thuốc là 58. Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao nhất toàn cầu, thứ ba sau Trung Quốc và Philippin trong khu vực Tây - Thái Bình Dương.Năm 2010, tỷ lệ tử vong do lao là 36/100.000, tỷ lệ mắc lao các thể là 333/100.000 tỷ lệ lao mới mắc các thể là 200/100.000 và tỷ lệ phát hiện đạt 54%. Tỷ lệ HIV dương tính trong số bệnh nhân lao năm 2002 khoảng 3,2%, năm 2007 là 4,4%. Tỷ lệ kháng thuốc chung năm 2002 là 32,5%, tỷ lệ đa kháng là 3% ở bệnh nhân mới và 23,5% ở bệnh nhân tái trị. Năm 2009, tỷ lệ này là 2,7% và 19%. 1.2. Cấu trúc quần thể vi khuẩn gây bệnh lao 1.2.1. Cấu trúc di truyền nhiễm sắc thể vi khuẩn lao Các yếu tố di truyền lặp lại, các điểm đa hình và các đoạn đa hình trong vi khuẩn lao M. tuberculosis là marker quan trọng sử dụng cho phân loại vi khuẩn. Đoạn xen (IS) là các trình tự di động nhỏ hơn 2,5kb xuất hiện phổ biến trên nhiễm sắc thể. Trình tự lặp lại đa dạng giầu GC (PGRS)gồm nhiều đoạn dài 96 bp giầu GC lặp lại liên tiếp cùng chiều, có 4 5 mặt tại ít nhất 26 vị trí. Vùng lặp lại trực tiếp (vùng DR)bao gồm những đoạn lặp lại trực tiếp, cấu tạo bởi một trình tự ngắn dài 36bp lặp lại với tần suất lặp lại khác nhau ở mỗi đoạn. Xen giữa các đoạn lặp lại là các đoạn trung gian dài 35- 41 bp không lặp lại.Trình tự lặp lại liên tiếp đa dạng chủ yếu (MPTR)làtrình tự lặp lại của một đoạn ngắn dài 10 bp, phân tách nhau bởi đoạn trung gian dài 5 bp, có số lượng có thể lên tới 80 copy. Đoạn lặp rải rác chứa đơn vị lặp lại liên tiếp đa dạngthuộc Mycobacteria (MIRU- VNTR)chứa các đơn vị có kích thước từ 40-100 bp lặp lại liên tiếp, với tần suất lặp lại đa dạng nằm rải rác.Điểm đa hình (SNP)là điểm mà tại vị trí nucleotide đó người ta phát hiện thấy sự đa dạng khi so sánh các cá thể trong quần thể. Đoạn đa hình (LSP)xuất hiện chủ yếu do đột biến mất đoạn và sắp xếp lại. 1.2.2. Phân nhánh dòng trong cấu trúc quần thể của vi khuẩn lao Tất cả các nghiên cứu đều đưa ra kết quả khá thống nhất là vi khuẩn lao có cấu trúc quần thể phân bố theo dòng. 1.2.3. Vi khuẩn lao có tính đặc trưng theo khu vực địa lý Tại mỗi khu vực địa lý khác nhau, phân bố dòng của vi khuẩn lao mang tính đặc trưng khác nhau. 1.3.3. Ứng dụng và thành tựu trong lĩnh vực dịch tễ học phân tử bệnh lao 1.3.3.1. Quản lý bệnh lao bằng dịch tễ học phân tử:Dịch tễ học phân tử cho biết tình trạng hiện thời, dự báo được tiến triển của dịch tễ bệnh lao và cảnh báo yếu tố nguy cơ. 1.3.3.2. Xác định chỉ số lây bệnh lao:Phát hiện các dây truyền dịch tễ bằng phân tích typ phân tử vi khuẩn lao,từ đó xác định chỉ số lây bệnh. 1.3.3.3. Điều tra tiếp xúc, nguồn lây và đường lây truyền:Sự giống nhau về typ phân tửcho phép xác định các trường hợp trong cùng dây truyền dịch tễ, từ đó cho phép điều tra tiếp xúc, nguồn lây và đường lây truyền. 1.3.3.4. Điều tra khả năng lây truyền lao kháng thuốc:Khả năng lây truyền của chủng kháng thuốc có thể xác định bằngtần suất xuất hiện của chủng kháng thuốc trong cụm phân tử. 1.3.3.5. Theo dõi chủng lao gây dịch hay chủng có đặc tính đặc trưng:Sự phát tán của chủng gây dịch hay chủng có đặc tính sinh học đặc trưng có thể theo dõi bằng các marker di truyền. 1.3.3.6. Điều tra đa nhiễm vi khuẩn lao: Một bệnh nhân lao có thể bị đa nhiễm bởi hơn một chủng lao trong cùng một thời điểm. Phân tích phân tử có thể xác định sự tồn tại của đa nhiễm vi khuẩn lao 1.3.3.7. Đánh giá gánh nặng bệnh lao gây bởi tái nhiễm lao: Tái nhiễm lao là trường hợp bị nhiễm một chủng vi khuẩn lao mới sau khi đã bị nhiễm lao trước đó. Phân tích phân tử có thể xác định tái nhiễm vi khuẩn lao. 1.3.3.8. Điều tra cấu trúc quần thể vi khuẩn lao và tầm quan trọng dịch tễ của các dòng vi khuẩn lao khác nhau:Phân tích phân tử đã định danh các dòng vi khuẩn lao chính hiện đang lưu hành trên thế giới như Beijing, Haarlem, CAS, EAI, LAM, Manu, S, T, X, các dưới dòng đặc thù theo quốc gia như Manila, Delhi, VNM (Việt Nam), Northaburi, SOM (Somali), BDG (Bangladesh) v.v.. Các dòng hay dưới dòng khác nhau có vai trò và ảnh hưởng khác nhau đến tình hình và biến động dịch tễ bệnh lao tại mỗi khu vực. 1.3.3.9. Phát triển công cụ chẩn đoán:Khác nhau về di truyền trong vi khuẩn lao cần phải được cân nhắc khi lựa chọn marker phân tử hay kháng nguyên vi khuẩn sử dụng trong chẩn đoán bệnh lao.Hiệu quả chẩn đoán có thể bị ảnh hưởng bởi các đột biến và tính đa dạng của cấu trúc di truyền quần thể. 1.3.3.10. Phát triển thuốc chống lao:Phát triển thuốc mới cần phải quan tâm đến cấu trúc quần thể của vi khuẩn lao.Việc tìm hiểu xem liệu có dòng vi khuẩn lao nào có thể chứa các điểm hay đoạn đa hình trên nhiễm sắc thể gây nên tính kháng thuốc tự nhiên của vi khuẩn đóng vai tròquan trọng để đưa ra quyết định sử dụng đối với mỗi loại thuốc. 1.3. Dịch tễ học phân tử bệnh lao - Ứng dụng và thành tựu 1.3.1. Khái niệm dịch tễ học phân tử bệnh lao Là một lĩnh vực xuất hiện khi kết hợp các lĩnh vực sinh học phân tử, y sinh lâm sàng, thống kê và dịch tễ làm một. Dịch tễ học phân tử sử dụng phương pháp tiếp cận đa chiều để xác định yếu tố căn nguyên, quá trình tiến triển, phát tán và phân bố của bệnh theo thời gian và không gian, xác địnhvai trò của yếu tố căn nguyên ở khía cạnh di truyền, tương tác với môi trường và vật chủ ở mức độ phân tử và xác định phân bố của yếu tố căn nguyên trong quần thể vật chủ. 1.3.2. Lịch sử phát triển của dịch tễ học phân tử bệnh lao Phân loại phân tử vi khuẩn lao được áp dụng từ những năm 90 của thế kỷ XX, lúc đầu được sử dụng để điều tra dịch và lây truyền bệnh lao trong phạm vi nhỏ,sau đó để xác định chỉ số lây và các yếu tố nguy cơ trong các nghiên cứu ở phạm vi cộng đồng và đa cộng đồng. Những ứng dụng sau đó được mở rộng bao gồm xác định nhiễm chéo phòng thí nghiệm, tỷ lệ tái phát, tái nhiễm trong số các trường hợp tái mắc lao, khả năng lây của bệnh nhân AFB âm tính, truy tìm nguồn lây, điều tra tiếp xúc, điều tra lan truyền chủng kháng thuốc, chủng độc tính cao, nghiên cứu cấu trúc quần thể, mối liên quan giữa biến đổi cấu trúc quần thể với thay đổi môi trường, khí hậu, biến động dân số và các biện pháp can thiệp, khống chế. 6 7 1.3.3.11. Phát triển vắc-xin phòng lao mới:Đánh giá hiệu quả dự phòng của vắc-xin ở mỗi khu vực phải tính đến ảnh hưởng cấu trúc quần thể vi khuẩn, khả năng sinh miễn dịch khác nhau của mỗi quần thể vật chủ. Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1.4. Các kỹ thuật phân tử phân loại vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử bệnh lao 1.4.1. Kỹ thuật IS6110- RFLP Enzyme giới hạn PvuII được dùng để cắt nhiễm sắc thể vi khuẩn tại vị trí trên IS6110. Sau đó các đoạn cắt được lai với đoạn mồi có đánh dấu mang trình tự bổ sung.Sau khi lai, tất cả các đoạn có mang trình tự bổ sung với đoạn mồi sẽ được hiển thị trên film quang học, tạo nên hình vạch RFLP đặc trưng cho vi khuẩn. IS6110- RFLP được công nhận là tiêu chuẩn vàng trong phân loại vi khuẩn lao. Tuy nhiên kỹ thuậtkhá phức tạp, tốn kém, không thể sử dụng trong đáp ứng nhanh và thiếu hiệu quả trong phân loại chủng lao có ít hoặc không chứa IS6110. 1.4.2. Kỹ thuậtspoligotyping Spoligotyping dựa trên phát hiện 43 đoạn trung gian trong vùng DR. Các đoạn này được tổng hợp bằng PCR với cặp mồi Dra và Drb, trong đó Dragắn biotin.Sản phẩm PCR sau đó được lai với màng gắn 43 oligonucleotide có trình tự bổ sung với 43 đoạn trung gian. Các đoạn trung gian có mặt sẽ gắn với các oligonucleotide trên màng và được phát hiện khi bộc lộ với phim quang học.Hình vạch spoligo (psoligotype)đặc trưng cho mỗi vi khuẩnvà được sử dụng cho phân loại. Spoligotyping có lợi thế nhanh, đơn giản và cókhả năng phát hiện chủng lao dòng Beijing nhưng khả năng phân biệt nhìn chung kém hơn IS6110-RFLP. Dữ liệu spoligotyping và phân mềm phân tích bao gồmSpolDB4, SITVIT WEB,SPOTCLUST, SpolTools. 1.4.3. Kỹ thuật MIRU- VNTR Các trình tự lặp lại tại mỗi MIRU-VNTR được nhân lên và điện di trên gel agarose. Dựa trên kích thước sản phẩm, số lần lặp lại của đơn vị lặp lại tại mỗi locus được xác định. MIRU-VNTR type được thể hiện dưới dạng 12, 15 hay 24 số tự nhiên khi sử dụng bộ phân loại 12, 15 hay 24 MIRUVNTR, mỗi số tương ứng với số lần lặp lại của một MIRU-VNTR.Trong một số trường hợp, số lần lặp lại tại mỗi MIRU-VNTR co thể lên tới 10 hoặc hơn, dẫn đến 2 số tự nhiên tương ứng với 1 MIRU-VNTR.Phân loại MIRUVNTR cho độ phân biệtcao. MIRU-VNTR phối hợp với spoligotyping có thể thay thếphân loại chuẩn vàngIS6110-RFLP. Chương trình phân tích số liệu bao gồm: MIRU-VNTRplus,eBURST, Bionumerics và PAUP. 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là 5 bộ chủng lao. Bộ thứ nhất gồm 221 chủng phân lập tại 8 trung tâm chống lao quận huyện của hai tỉnh Hà Tây và Hà Nội vàtrên cộng đồng dân cư tỉnh Hưng Yên. Bộ thứ hai gồm 300 chủng thu thập ngẫu nhiên (sử dụng số đăng kýnhập viện liên tiếpcủa bệnh nhân)từ ba bệnh viện điều trị lao tuyến Trung ươngthuộc ba miền Bắc, Trung và Nam. Bộ thứ ba gồm400 chủng thu thập theo tiêu chuẩn kháng thuốc từ hai bệnh viện điều trị lao tuyến Trung ương tại hai miền Bắc và Nam. Bộ thứ tư gồm19 chủng lao trẻ em và bộ thứ năm gồm7 cặp chủng lao phân lập trước và sau 6 tháng điều trị trên cùng bệnh nhân thuộc huyện Chương Mỹ, Hà Tây. Toàn bộ chủng nghiên cứu được phân lập trong giai đoạn 2003-2009. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu được thiết kế là nghiên cứu mô tả, kết hợp phân tích sử dụng các phần mềm chuyên biệt phân tích sinh học phân tử. Các kỹ thuật sử dụng cho định dòng vi khuẩn và định typ phân tử vi khuẩn lao là spoligotyping và MIRU-VNTR. 2.2.2. Cỡ mẫu Công thức tính cỡ mẫu được áp dụng cho dự đoán tỷ lệchủng dòng Beijing trong quần thể(là dòng vi khuẩn lao đóng vai trò quan trọng trong dịch tễ học phân tử bệnh lao tại Việt Nam). Cỡ mẫu được áp dụng giống nhau cho mỗi mục tiêu nghiên cứu 1 và 2. n: Cỡ mẫu tối thiểu ε = 10% (Sai số tương đối ) Z(1-/2) = 1,96 (Hệ số tin cậy, với độ tin cậy 95%) P = 54% (Tỷ lệ chủng Beijing ở Việt Nam. Anh D. D., Emerg Infect Dis, 2000) Theo công thức thì cỡ mẫu nghiên cứu tối thiểu là 328 cho mỗi mục tiêu nghiên cứu. 2.2.4. Biến số nghiên cứu và chỉ số kết quả - 2.2.4.1. Biến số nghiên cứu Dòng vi khuẩn lao và typ spoligo dựa trên phân loại phân tử bằng kỹ thuật spoligotyping. Typ MIRU-VNTR của vi khuẩn lao dựa trên phân loại bằng kỹ thuật MIRU-VNTR. Công thức kháng thuốc của vi khuẩn lao dựa trên kết quả xác định tính kháng thuốc với 4 loại thuốc điều trị lao dòng một RMP,INH, SM và EMB. 8 9 2.2.4.1. Chỉ số kết quả kết quả * Đáp ứng mục tiêu 1:“Mô tả đặc điểm phân bố dòng, dưới dòng của vi khuẩn lao lưu hành tại một số tỉnh khu vực đồng bằng Bắc bộ và vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2003-2009.” - Phân bố dòng, dưới dòng trong quần thể chủng vi khuẩn lao. - Mối liên quan giữa tỷ lệ chủng thuộc các dòng, dưới dòng vi khuẩn lao khác nhau với các yếu tố dịch tễ,nhằm phát hiện yếu tố ảnh hưởng đến sự lan truyền của các dòng, dưới dòng lao khácnhau. - Mối liên quan giữa tỷ lệ tạo cụm phân tử với các yếu tố dịch tễ, nhằm xác định yếu tố ảnh hưởng đến sự lan truyền bệnh lao. - Tỷ lệ tạo cụm của các dòng vi khuẩn lao khác nhau dưới ảnh hưởng của các yếu tố dịch tễ, nhằm xác định khả năng lây truyền của các dòng, dưới dòng vi khuẩn lao khác nhau. - Các trường hợp tái nhiễm lao. * Đáp ứng mục tiêu 2:“Xác định mức độ kháng thuốc của các dòng, xác định phân bố dòng của quần thể theo mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2005-2008.” - Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao theo dòngdưới ảnh hưởng của các yếu tố dịch tễ, nhằm phát hiện dòng có khả năng kháng thuốc mạnh và yếu tố nguy cơ gây ra tính kháng thuốc. - Phân bố dòng và cấu trúc quần thể theo mức độ kháng thuốc của vi khuẩn dưới ảnh hưởng của các yếu tố dịch tễ, nhằm phát hiện sự biến đổi của cấu trúc quần thể dưới áp lực của thuốc chống lao. - Tương quan của các kháng thuốc với nhau trong quần thể vi khuẩn lao thuộc các dòng lao khác nhau và tại các khu vực khác nhau. * Đáp ứng mục tiêu 3:“Tìm hiểu đặc điểm phân tử vi khuẩn lao phân lập từ trẻ em, giai đoạn 2005-2009.” - Đặc điểm phân tử và đặc điểm kháng thuốc của vi khuẩn lao trẻ em. - Điểm khác biệt giữa vi khuẩn lao trẻ em và vi khuẩn lao người lớn. 2.2.5. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 2.2.5.4.Kỹ thuật spoligotyping Phân loại bằng spoligotyping được thực hiện theo thường quy chuẩn quốc tế. 2.2.5.1. Kỹ thuật thu thập số liệu Thông tin chủng lao trích từ hồ sơ bệnh nhân, phiếu xét nghiệm vi sinh. 2.2.5.2. Kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn lao Vi khuẩn lao được nuôi cấy phân lập từ bệnh phẩm đờm theo phương pháp Petroff cải tiến. 2.2.5.3. Kỹ thuật xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn lao Đánh giá mức độ nhạy cảm của vi khuẩn theo phương pháp tỷ lệ Canetti-Grosset. 2.2.5.5.Kỹ thuật MIRU-VNTR Phân loại bằng bộ 12 và bộ 15 MIRU-VNTR được thực hiện theo thường quy chuẩn quốc tế. 2.2.6. Kỹ thuật phân tích số liệu Cây phân loại NJ và khoảng tán xạ tối thiểu được xây dựng dựa trên số liệu MIRU-VNTR typing,bằng phần mềm MIRU-VNTRplus.Cụm phân tử là cụm có it nhất từ hai chủng laotrở lêncó cả typ spoligo và typ MIRUVNTR giống nhau. Lây nhiễm hiện thời được xác định dựa trên tỷ lệ tạo cụm phân tử (CR) và được tính bằng công thứcCR = (nc-c)/n, trong đó nc là tổng số chủng thuộc cụm phân tử, c là tổng số cụm, và n là tổng số chủng. Chủng vi khuẩn lao nghiên cứu được phân thành 3 nhóm tương ứng với 3 giá trị của biến thống kê “dòng lao” bao gồm “Beijing”, “EAI4VNM” và “KHÁC” (là nhóm không thuộc dòng Beijing, và cũng không thuộc dưới dòngEAI4-VNM) hoặc “Beijing”, “EAI” và “KHÁC” (là nhóm không thuộc dòng Beijing, và cũng không thuộc dòng EAI). Phân tích đa biến hồi quy logistic (với đường cong logit) và phương sai được sử dụng để tìm hiểu mối tương quan giữa tỷ lệ chủng, tỷ lệ chủng thuộc cụm của các dòng hoặc typ phân tử với tuổi, giới của bệnh nhân, tính kháng thuốc của vi khuẩn, khu vực nghiên cứu (thành phố vs. nông thôn) và chiến lược chọn mẫu (bệnh viện vs. cộng đồng). Tương quan của các kháng thuốc khác nhau trong vi khuẩn lao được phân tích bằng cách sắp xếp vi khuẩntheo công thức kháng thuốc đối với bốn loại thuốc chống lao dòng một bao gồm RMP,INH, SM và EMB. Quá trình sắp xếp được thực hiện bằng phương pháp áp dụng cho sinh thái học quần thể (Atmar & Patterson, 1993 và Almeida-Neto et al., 2008). Mức độ ý nghĩa thống kê của phân bố được tính bằng phép hoán vị ngẫu nhiên giá trị kháng thuốc của mỗi chủng vi khuẩn. Quá trình thử nghiệm được thực hiện 1000 lần cho phép đưa ra phân bố thống kê, từ đó đưa ra giá trị p (ý nghĩa thống kê) của phân bố. Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bởi phần mềm R (R Development Core Team, 2010). 2.3. Hạn chế của nghiên cứu Đối tượng của nghiên cứu là chủng vi khuẩn lao. Do việc thực hiện kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn lao ở Việt Nam còn nhiều hạn chế, mẫu vi khuẩn lao trong nghiên cứu hầu hết được thu thập từ các bệnh viện. 10 2.4. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện dựa trên phân tích mẫu vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao do đó không gây ra bất kỳ rủi ro nào cho bệnh nhân. Thông tin bệnh nhân được giữ theo nguyên tắc bảomậtthông tin cho đối tượng nghiên cứu.Nghiên cứu được thực hiện bởi các cán bộ đáp ứng yêu cầu về trình độ chuyên môn, kết quả phân tích đều dựa trên các kỹ thuật tiêu chuẩn tiên tiến, được tiến hành tại các cơ sở hàng đầu Việt Nam và Cộng hoà Pháp về chuyên nghành nên có độ tin cậy cao. Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đa đạng phân tử vi khuẩn lao lưu hành tại một số tỉnh khu vực đồng bằng Bắc bộ và vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2003-2009 3.1.1. Đa dạng phân tửvi khuẩn lao một số tỉnh khu vực đồng bằng Bắc bộ Bảng3.2.Phân bố dòng/ dưới dòng dựa trênphân loại spoligotying của vi khuẩn laoM. tuberculosisphân lập từ một số tỉnh đồng bằng Bắc bộ Chủng bệnh viện Chủng cộng đồng Dòng dưới dòng Thành phố Nông thôn Nông thôn Tổng số # (%) # (%) # (%) # (%) Beijing 33 (58,9) 30 (28,8) 19 (31,1) 82 (37,1) Beijing-Like 2 (3,6) 1 (1,6) 3 (1,4) Beijing 35 (62,5) 30 (28,8) 20 (32,8) 85 (38,5) EAI1_SOM 3 (2,9) 3 (1,4) EAI4_VNM 9 (16,1) 32 (30,8) 15 (24,6) 56 (25,3) EAI5 3 (5,4) 11 (10,6) 12 (19,7) 26 (11,7) EAI 12 (21,4) 46 (44,3) 27 (44,3) 85 (38,5) H H3 2 (3,6) 1 (1,6) 3 (1,4) LAM LAM9 3 (2,9) 1 (1,6) 4 (1,8) MANU1 2 (1,9) 1 (1,6) 3 (1,4) MANU2 2 (1,9) 2 (0,9) MANU 4 (3,8) 1 (1,6) 5 (2,3) T1 4 (7,1) 9 (8,6) 1 (1,6) 14 (6,3) T2 2 (3,3) 2 (0,9) T2-T3 1 (1,8) 1 (1) 2 (0,9) T 5 (8,9) 9 (8,6) 3 (4,9) 17 (8,1) 11 X ZERO U Tổng số X3 2 (3,6) 56 (100) 12 (11,5) 104 (100) 2 (3,3) 1 (1,6) 5 (8,2) 61 (100) 2 (0,9) 1 (0,5) 19 (8,6) 221 (100) 221 chủng vi khuẩn lao M. tuberculosis được phân thành 53 typ spoligo, 38 typ đã có và 15 typ chưa có trong cơ sở dữ liệu trong cơ sơ dữ liệu quốc tếSITVIT. Các typ chưa có được đặt tên từ nvn1 đến nvn15 và được xác định dòng/ dưới dòng nhờ chương trình SPOTCLUST và được kiểm tra lại bằng chương trìnhMIRU-VNTRplus.Có 6chủngthuộc huyện Chương Mỹ, Hà Tây có cùng typ spligo nvn7. Có 8 dòng lao và 13 duới dòng lưu hành tại khu vực nghiên cứu. Chủng lao dòng Beijing và EAI phổ biến nhất. Spoligotyping xác định được 21 cụm spoligo và 32 typ spoligo duy nhất.Cụm lớn nhất là SIT1 thuộc dòng Beijing và SIT139 thuộc dưới dòng EAI4-VNM. Phân loại bằng 12 MIRU-VNTR phân 21 cụm spoligo thành 113 typ MIRUVNTR, gồm 21 cụm và 92 typ MIRU-VNTR duy nhất. Tỷ lệ tạo cụm là 34,4%. 21 cụm phân tử tạo ra từ phân loại 12 MIRU-VNTR tiếp tụcđược phân loại bằng 15 MIRU-VNTR, chora 61 typ 15 MIRU-VNTR, trong đó có 16 cụm (52 chủng) và 45typ duy nhất. Tỷ lệ tạo cụm giảm còn 16.3%.Độ lớn các cụm phân tử lớn dòng Beijing và dưới dòng EAI4-VNM đều giảm.Phân loại bằng 15 MIRU-VNTR tạo ra 14 cụm phân tử nhỏ bao gồm 2 đến 3 chủng.Chủng thuộc mỗi cụm trong tất cả 14 cụm được phát hiện phân lập từ bệnh nhân sống trong cùng một huyện.Toàn bộ chủng thuộc cụmspoligonvn7 thuộc huyện Chương Mỹvẫn giữ nguyên cụm.Typ 15 MIRU-VNTR của cụm này không giống với typ MIRU-VNTR của bất kỳ chủng nào khác vàđược đặt tên là M_CMY. Typ MIRU-VNTR của chủng lao thuộc hai dòng chính Beijing và EAI rất khác nhau. Hai dòng này có thể phân biệt dựa trênMIRU4 (2 lặp lại cho Beijing/ 6 lặp lại cho EAI), hoặc MIRU24 (1 lặp lại cho Beijing/ 2 lặp lại cho EAI) hoặc MIRU26 (4-10 lặp lại cho Beijing/ 2-3 lặp lại choEAI).Chủng lao thuộc hai dòng Beijing và EAI tập trung thành hai nhánh trên cây phân loại khoảng tán xạ tối thiểu tạo bởi MIRU-VNTRplus dựa trên phân loại 12 MIRU-VNTR. 3.1.2. Ảnh hưởng của khu vực và chọn mẫu tới đa dạng phân tử vi khuẩn lao khu vực đồng bằng Bắc bộ Kết quả phân tích cho thấy sự phân bố dòng/ dưới dòng của vi khuẩn lao không có sự khác nhau giữa mẫu bệnh viện và mẫu cộng đồng. Tuy nhiên tỷ lệ tạo cụm (CR) của chủng bệnh viện (17,9% ở thành phố và 19,2% ở nông thôn) cao hơn chủng cộng đồng (0%) (p<0,001). CR của chủng dòng 12 13 Beijing (25,9%) cao hơn CR của chủng dưới dòng EAI4-VNM (10,7%),với p<0,001 và cao hơn CR nhóm KHÁC (10.0%),(p<0,01). Tỷ lệ chủng lao dòng Beijing cao hơn có ý nghĩa ở khu vực thành phố so với khu vực nông thôn (OR: 3,8 [95%CI: 1,9 -7,6]), với p<0,001. Tỷ lệ chủng Beijing tăng khi tuổi bệnh nhân giảm, tỷ lệ chủngEAI4-VNM tăngkhi tuổi bệnh nhân tăng,với p<0,05(hình 3.5). Tỷ lệ chủng dòng Beijing cao ở miền Bắc (70,4%) và miền Nam (68%), thấp hơn ở miền Trung (28%).Tỷ lệ chủng dòng EAI và dưới dòng EAI4_VNM cao ở khu vực miền trung (59% và 27%), và thấp ở khu vực miền Bắc (7,1% và 6,1%) và miền Nam (17% và 11%).Sự khác nhau giữa các miền có ý nghĩathống kê (p<0,01).Tỷ lệ chủng thuộc dòng Beijing cũng có xu hướng tăng lên khi tuổi bệnh nhân giảm (p<0,001).Tỷ lệ chủng thuộc dòng EAI và dưới dòng EAI4_VNM có xu hướngtăngkhi tuổi bệnh nhân tăng (p<0,001). Kết quả phân loại 15MIRU-VNTR cho thấy typ MIRU-VNTR của chủng lao phân lập từ ba miền tương đối khác nhau. Chủng lao trong cùng một miền có xu hướng giống nhau và tập trung với nhau trên cây phân loại(hình 3.8). Chủng lao dòng Beijing và EAI phân bố tập trung trên hai nhánh chính của cây phân loại khoảng tán xạ tối thiểu tạo bởi MIRU-VNTRplus dựa trên phân loại 15 MIRU-VNTR. Trên nhánh dòng EAI có rất nhiều chủng Uphân bố xen kẽ. Trong số 3 dòng lao phổ biến nhất, ở dòng Beijing và EAI, số lần lặp lại tại mỗi MIRU-VNTR ít đa dạng, vàtần suất xuất hiện của một lặp lại nhất định thường chiếm đa số so với các lặp lại khác trong tổng số chủng thuộc dòng đó.Trong khi đó ở dòng T, số lặp lần lặp lại tại mỗi MIRUVNTR đa dạng hơn và thường có 3-4 lặp lại cùng đồng thời phổ biến. Hình3.5.Tỷ lệ chủng dòng Beijing (A), EAI4-VNM (C) và KHÁC (B) theo tuổi bệnh nhân và theo khu vực(thành phố: màu đỏ vs. nông thôn: màu xanh). Tuổi trung bình bệnh nhân nữ (60,7 [95%CI: 58,7- 62,7]) cao hơn tuổi trung bình bệnh nhân nam (45,5 [95%CI 43,5- 47,5]), với p<0,0001.Tuổi trung bình bệnh nhân nông thôn (52,3 [95%CI: 50,3- 54,3]) cao hơntuổi trung bình bệnh nhân thành phố (42,8 [95%CI: 40,8- 44,8]), với p<0,05.Tuổi trung bình bệnh nhân mắc lao gây bởi chủng lao dưới dòng EAI4-VNM (55,6 [95% CI: 53,6- 57,6]) cao hơn tuổi trung bình bệnh nhân mắc lao gây bởi chủng lao dòng Beijing (51,1 [95% CI: 49,1- 53,1]),với p<0,05. 3.1.3. Đặc điểm phân tử một số chủng trước và sau 6 tháng điều trị trên cùng bệnh nhân Trừ cặp chủng CMY-T0-14 và CMY-T6-14 có typ spoligo giống nhau.Tất cả 6 cặp chủng T0 và T6 còn lại đều có typ spoligo khác nhau. Đặc biệt 5 trong số 6cặp chủng trên, chủng tại thời điểm 6 tháng sau điều trị đều có typ spoligo nvn7. 3.1.4. Điểm khác biệt dịch tễ học phân tử bệnh lao giữa ba khu vực nghiên cứu tại ba miền Bắc, Trung và Nam. Có 6 dòng lao chính và 13 duới dòng lưu hành tại ba bệnh viện điều trị lao tuyến trung ương tại ba miền Bắc, Trung và Nam. Dòng Beijing(55,4%)và EAI (27,5%)là hai dòng phổ biến nhất.Bốn dòng còn lại chiếm 17,1%, bao gồm Haarlem (1%), LAM (1,3%), T (6,4%)và Zero (0,3%).Chủng không xác định Uchiếm 8%.Dưới dòng EAI4-VNM chiếm 14,8% tổng số chủng. Hình 3.8.Cây phân loại khoảng tán xạ tối thiểutạo bởi MIRU-VNTRplus dựa trên phân loại 15 MIRU-VNTR chủng laonghiên cứu theo ba miền Bắc, Trung và Nam. Chú thích: Hình tròn nhỏ: Typ MIRU-VNTR, màu hình tròn tương ứng với chủng thuộc các miềnBắc(xanh), Nam(đỏ), và Trung (vàng).Hình Elip:vùng tập trung của chủng lao theo miền, mầu của hình elip tương ứng với miền:Bắc (xanh), Trung (nâu), vàNam(đỏ). 14 15 3.2.4. Tương quan củatửcác kháng thuốc trong 3.2. Dịch tễ học phân bệnh lao kháng thuốcvi khuẩn lao Việt Nam Vi khuẩn kháng với EMB khángvivới RMP,lao INH 3.2.1.Mức độ kháng thuốc củathường các dòng khuẩn tạivà 3 SM, miềnkháng Bắc, RMP thường kháng cả INH và SM, và kháng với INH thường kháng cả SM Trung và Nam (hình Nhìn 3.11 và chung 3.12). vi Mô khuẩn hìnhlaokháng tất cảtrên cáccódòng ý nghĩa kháng thống thuốc kê ở mạnh cả banhất miền ở miền và ở tất Nam, cả các nhạy dòngcảm lao nhất (p<0,01) ở miền Trung. Dòng Beijing là dòng kháng mạnh nhất và EAI nhạy cảm nhất.Tuy nhiên ở miền Nam mức độ kháng của dòng EAI không những không thấp hơn, mà còn cao hơn dòng Beijing. Chủng kháng đa thuốc (MDR) ở miền Trung chỉ thấy ở dòng Beijing (21,4%).Tỷ lệ chủng MDR của dòng Beijing ở miền Trung thấp hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ MDR của dòng Beijing ở miền Bắc (34,8%) và miền Nam (36,7%). 3.2.2. Phân bố dòng theo mức độ kháng thuốc của chủng lao hai miền Bắc và Nam Hình 3.12.Phân bố của vi khuẩn theo công thức kháng thuốc và theo ba miền Bắc, Trung, Nam. Chú thích: mỗi dòng tương ứng với một chủng, mỗi cột tương ứng với một loại thuốc: kháng thuốc (đỏ), nhạy cảm (ghi). 3.3. Đặc điểm chủng vi khuẩn lao phân lập từ trẻ em 3.3.1. Đặc điểm chủng vi khuẩn lao phân lập từ trẻ em Toàn bộ 19 chủng lao trẻ em đều là các chủng nhạy cảm. Chủng vi khuẩn lao trẻ em được phát hiện thấy chủ yếu thuộc về hai dòng Beijing (13 chủng, 68,4%) và dòng T (5 chủng, 26,3%). Bốn cụm phân tử được phát hiện trong số các chủng nghiên cứu, trong đó một cụm bao gồm 2 chủng từ tỉnh Hưng Yên, ba cụm còn lại là các chủng từ bệnh viện Phổi Trung 3.10.Tỷ ương. Tỷlệlệchủng tạo cụm củaBeijing, mẫu nghiên là 22%. Hình dòng EAI cứu và dưới dòng EAI4-VNM theo mức độ kháng thuốcXDR: siêu kháng, MDR: đa kháng, SDR: đơn kháng, SST: nhạy cảm, và theo hai miền Bắc (đỏ) và Nam (xanh).Chú thích: Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở mức độ kháng thuốc càng cao khả năng xuất hiện chủng Beijing trong quần thể vi khuẩn càng lớn và khả năng xuất hiện chủng dòng EAI và dưới dòng EAI4-VNM càng thấp. Tuy nhiên khả năng xuất hiện các chủng trên không khác biệt giữa quần thể vi khuẩn đa kháng và siêu kháng thuốc. Phân tích phương sai cho thấy sự phân bố dòng của vi khuẩn lao theo các mức độ kháng thuốc không khác nhau có ý nghĩa giữa hai miền Bắc và Nam (hình 3.10). 3.2.3. Phân bố typ phân tử theo đặc điểm kháng thuốc Chủng lao nhạy cảm đa dạng hơn so với chủng kháng thuốc. Trên cây phân loại, các chủng càng có mức độ kháng thuốc cao càng tập trung ở Hình tâm, 3.14.các Câychủng phân càng loại UPMA vi khuẩn trẻcàng em tạo bởitán MIRUtrung có mứcchủng độ kháng thuốclao thấp phân rộng VNTRplus phân bằng spoligotying và 15 MIRU-VNTR. ra phía ngoàidựa vàtrên không tậploại trung. 16 17 3.3.1. So sánh chủng vi khuẩn lao trẻ em với chủng lao người lớn Chủng lao trẻ em không khác biệt về kiểu phân tử so với chủng lao người lớn. việncó thể làphần lớn bệnh nhânlaochỉ đến khám khi bệnh đã ở giai đoạn nặng sau thời gian dài trì hoãnvà sau khi đã lây bệnh cho những người khác. Ở Việt Nam, theo một nghiên cứu trước đây thời gian trì hoãn trung bình đối với xét nghiệm chẩn đoán lao trong bệnh lao là 12 tuần trong khi thời gian khuyên cáo là không quá 3 tuần. Chương 4 - BÀN LUẬN 4.1. Đa đạng phân tử vi khuẩn lao lưu hành tại một số tỉnh khu vực đồng bằng Bắc bộ và vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2003-2009 4.1.1. Dịch tễ học phân tử bệnhlao một số tỉnh đồng bằng Bắc bộ  Dòng Beijing và dưới dòng EAI4-VNM nổi trội tại đồng bằng Bắc bộ Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều dòng lao khác nhau đang lưu hành tại khu vực nghiên cứu. Hai dòng phổ biến nhất là Beijing (38,5%) và EAI (38,5%).Các dòng khác chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ H (1,4%), LAM (1,8%), T (8,1%), X (0,9%), và dòng MANU (2,3%). Kết quả thu được khá phù hợp với phân bố dòng vi khuẩn lao tại khu vực Đông Á trong cơ sở sữ liệu Spoligotyping quốc tế. Trong số các dưới dòng thuộc dòng EAI, dưới dòng EAI4-VNM là dưới dòng đặc trưng cho Việt Nam, chiếm tới 67% tổng số chủng dòng EAI hay 25,3% tổng số mẫu nghiên cứu. Chủng EAI4-VNM được phát hiện với tỷ lệ cao ở Việt Nam (50,7% tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long, N.T.Buu 2009), nhưng được phát hiện với tỷ lệ rất thấphoặc không thất có ở các quốc gia khác.Điều này cho thấy dưới dòng EAI4-VNM là dưới dòng đặc trưng cho Việt Nam. Tỷ lệ chủng Beijing ở khu vực thành phố lớn hơn so với khu vực nông thôn (62,5% vs. 28,8%, p<0,0001). Tuy nhiên nghiên cứu không phát hiện thấy ảnh hưởng của khu vực đối với tỷ lệ các dòng khác kể cả dòng EAI hay dưới dòng EAI4-VNM và chủng thuộc nhóm KHÁC (chủng không thuộc dòng Beijing và dưới dòng EAI4-VNM).  Ảnh hưởng của chọn mẫu đến tỷ lệ lây nhiễm hiện thời Tỷ lệ tạo cụm phân tử (tỷ lệ lây nhiễm hiện thời) trong số chủng bệnh viện khu vực thành phố là 17,9% và khu vực nông thôn là 19,2%.Không có cụm phân tử nào được phát hiện trong số chủng cộng đồng.Sự khác biệt về tỷ lệ chủng thuộc cụm phân tử theochiến lược chọn mẫu có ý nghĩa thống kê, với p<0,0001 (phân tích độ lệch hồi quy logistic). Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng lao bệnh viện có thể có độc lực cao hơn so với chủng lao cộng đồng. Điều này cũng phù hợp với giả thuyết của Anderson xây dựng dựa trên mô hình dự đoán cho rằng chủng vi khuẩn có khả năng lây truyền mạnh nhất cũng là những chủng có độc tính cao nhất.Một nguyên nhân khác gây nên tỷ lệ tạo cụm cao trong mẫu bệnh  Dòng Beijing có xu hướng nổi lên trong quần thể và đang thay thế dưới dòng EAI4-VNM Tỷ lệ chủng lao dòng Beijing được phát hiện thấy có mối tương quan tỷ lệ nghịch với tuổi bệnh nhân.Tỷ lệ chủng Beijing tăng khi tuổi bệnh nhân giảm.Phát hiện này phù hợp với phát hiện của các nghiên cứu khác ở Việt Nam trước đây bao gồm nghiên cứu thực hiện ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long.Điều này khẳng định chủng lao dòng Beijing đang có xu hướng nổi lên trong quần thể trên cả hai miền Bắc và Nam, Việt Nam. Dòng Beijingđang nổi lên thông qua quá trình di cư, giao thương và du lịch hiện đại.Nghiên cứu của T. N. Buu, 2009 tại khu vực nông thôn đồng bằng sông Cửu Long cho rằng chủng Beijing được phát tán từ thành phố Hồ Chí Minhđến khu vực nông thôn. Tác giảphát hiện thấy tỷ lệ chủng lao dòng Beijing phân lập trong dân cư sống trên tuyến đường chính dẫn tới thành phố Hồ Chí Minhcao hơnso với tỷ lệ chủng Beijing phân lập từ toàn bộ khu vực nghiên cứu. Ngược lại, chủng lao thuộc dưới dòng EAI4-VNM được phát hiện với tỷ lệ giảm trong nhóm bệnh nhân trẻ. Như vậy chủng này có xu hướng đang dần dần biến mất trong quần thể và bị thay thế bởi chủng lao dòng Beijing. Trong khi chủng lao thuộc dưới dòng EAI4-VNM được phát hiện là có mức độ nhạy cảm cao nhất với thuốc chống lao, ngược lại chủng Beijing có mức độ kháng thuốc cao nhất. Việc thay thế chủng lao thuộc dưới dòng EAI4-VNM bởi chủng lao dòng Beijing cảnh báo tình hình dịch tễ bệnh lao ở Việt Nam trong tương lai sẽ ngày càng phức tạp. Ngoài ra mối liên quan giữa tỷ lệ chủng Beijing với tuổi của bệnh nhân không thấy ở các nước châu Á khác trừ Bangladesh cho thấy tình hình dịch tễ bệnh lao ở Việt Nam rất khác biệt so với các nước khác trong khu vực. Giả thuyết dòng Beijing xâm nhập và phát tán vào Việt Nam thông qua di cư, giao thương và du lịch hiện đại được củng cố khi typ MIRU-VNTR của5 cụm phân tử lớn nhất của chủng Beijing trong mẫu nghiên cứu đều thấy lưu hành phổ biến ở nhiều nước châu Á khác. Typ M11được cho làlà typ tổ tiên của chủng dòng Beijing được tìm thấy phổ biến nhất ở hầu hết các quốc gia trên thì cũng là typ phổ biến nhất trong khu vực đồng bằng bắc Bộ, chiếm tới 19% tổng số chủng dòng Beijing. 18 19 Sự lan truyền của typ vi khuẩn lao mới tại huyện Chương Mỹ, Hà Tây Việc cả sáu chủng có typ spoligo nvn7 ở huyện Chương Mỹ, Hà Tây đều có cùng typ MIRU-VNTRcho thấy các chủng này có khả năng có nguồn gốc từ cùng một chủng. Typ phân tử của các chủng này khác biệt với tất cả các chủng khác trong nghiên cứuvà Typ spoligo của chúng chưa có trong cơ sở dữ liệu spoligotyping quốc tế cho thấy đây có thể là một chủng lao mới. Việc các chủng lao với typ phân tử khác biệt này được tìm thấy với số lượng tương đối lớn trong cùng một huyện cho thấy có thể một vụ dịch lao gây bởi chủng lao này đã xảy ra trong khu vực tại thời điểm nghiên cứu.  Phát hiện tái nhiễm lao Phân tích phân tử các cặp chủng lao trước và sau 6 tháng điều trị thì chỉ có một trường hợp có cặp chủng cùng typ phân tử, cặp chủng của 6 trường hợp còn lại đều khác nhau. Như vậy 6 trong số 7 trường hợp dương tínhnuôi cấy tại thời điểm sau 6 tháng điều trị đã bị tái nhiễm bởi một chủng lao khác ngay trong quá trình điều trị lao. Phát hiện trên của nghiên cứu có thể sẽ là một cảnh báo về tính chính xác của biện pháp đánh giá hiệu quả chương trình chống lao và phác đồ điều trị lao thông qua tỷ lệ thành công và thất bại trong điều trị. Do có sự khác nhau về khía cạnh bệnh sinh giữa bệnh lao tái hoạt động và bệnh lao tái nhiễm, nếu tái nhiễm lao gây một tỷ trọng lớn gánh nặng bệnh lao, vấn đề này cần phải được cân nhắc trong các thiết kế thử nghiệm lâm sàng và trong xây dựng chiến lược kiểm soát bệnh lao. Ngoài ra, việc quản lý nhiễm khuẩn không phải chỉ là phòng chống lây nhiễm từ bệnh nhân lao ra cộng đồng mà còn phải bao gồm cả hạn chế bộc lộ bệnh nhân lao với các nguồn lao khác.  Các yếu tố nguy cơ khác Trong nghiên cứu này, bệnh lao xuất hiện ở nam giới phổ biến hơn so với nữ giới (71% so với 29%). Tuổi của bệnh nhân nam (45,5) thấp hơn có ý nghĩa so với tuổi bệnh nhân nữ (60,7).Đa phần nam giới mắc lao trong độ tuổi lao động như vậymôi trường làm việc có thể là nơi làm lây truyền bệnh lao. Tỷ lệ bệnh nhân nữ trong mẫu cộng đồng (39%) cao hơn so với mẫu bệnh viện (23%) cho thấy bệnh nhân nữ có xu hướng tiếp cận với dịch vụ y tế kém hơn so với bệnh nhân nam. 4.1.2. Điểm khác biệt dịch tễ học phân tử giữa ba khu vực nghiên cứu tại ba miền Bắc, Trung và Nam.  Đặc điểm phân bố phân tử vi khuẩn lao ở ba khu vực nghiên cứu tại ba miền Bắc, Trung và Nam Nhìn chung các dòng vi khuẩn lao lưu hành ở ba miền không có sự khác biệt. Một số dưới dòng chỉ thấy ở miền này mà không thấy có ở miền kia, nhưng số chủng thuộc các các dưới dòng này chỉ có 1-2 chủng vì thế không mang ý nghĩa thống kê. Hai dòng phổ biến nhất vẫn là Beijing và EAI nhưng tỷ lệ phân bố khác nhau có ý nghĩa giữa ba miền. Tỷ lệ chủng thuộc dòng Beijingcũng có xu hướng tăng khi tuổi bệnh nhân giảm và tỷ lệ chủng thuộc dòng EAI và dưới dòng EAI4_VNM có xu hướng tăngkhi tuổi bệnh nhân tăng,với p<0,001. Xu hướng này xuất hiện ở cả ba miền cho thấy đây là xu hướng chung trên toàn bộ lãnh thổ. Tỷ lệ chủng dòng Beijing cao ở miền Bắc (70,4%) và miền Nam (68%),thấp hơn ở miền Trung (28%).Tỷ lệ chủng Beijing ở khu vực miền Trung trong nghiên cứu tương đương với tỷ lệ chủng Beijing khu vực miền Trung (28%) trong mẫu của điều tra kháng thuốc toàn quốc.Tỷ lệ chủng Beijing trong mẫu bệnh viện phổi trung ương(miền Bắc) cũng gần tương đương với tỷ lệ chủng Beijing khu vực thành phố của mẫu đồng bằng Bắc bộ (62,5%).Như vậy có thể thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ phân bố theo dòng của vi khuẩn lao giữa mẫu tuyến trung ương và mẫu các tuyến dưới.   Giả thuyết về biến động dịch tễ phân tử bệnh lao tại Việt Nam. Huế vẫn còn là một thành phố tương đối cách biệt với các hoạt động giao thương quốc tế.Có thể chính đặc điểm này khiến tỷ lệ chủng Beijing ở đây vẫn còn tương đối thấp. Chủng lao khu vực này có khả năng thể hiện chủng lao gốc. Tỷ lệ chủng dưới dòng EAI4_VNM không cao hơn dưới dòng EAI5 và không chiếm ưu thế hơn như hai miền Bắc và Nam.Trong khi đó dưới dòng EAI5 chiếm ưu thế hơn ở khu vực này.Kiểu phân bố chiếm ưu thế của EAI5 tương đối giống với các nước khác trong khu vực. Tỷ lệ chủng thuộc dòng nguyên thủy EAItăng dần từ Ấn Độ tới Đông Nam Á và chiếm ưu thế ở Đông Nam Á.Ở khu vực này các dưới dòng khác nhau của EAI lưu hành với mức độ khác nhau tùy theo mỗi nước.Quá trình phát tán của dòng EAI rất phù hợp với quá trình di cư của người cổ đại từ châu Phi, qua Ấn Độ và cuối cùng là Đông Nam Á. Giả thuyết là trong quá trình tiến hoá và thích nghi, dòng EAI đã tạo ra các dưới dòng khác nhau, trong đó EAI5 trở nên ngày càng nổi trội theo quá trình di cư, thể hiện ở tỷ lệ tăng dần từ châu Phi, qua Ấn Độ và cuối cùng là Đông Nam Á. Chính vì vậy tỷ lệ chủng dưới dòng EAI5 được tìm thấy cao nhất ở khu vực Đông Nam Á. Dòng Beijing được giả thiết là có nguồn gốc Trung Á, sau đó phát tán sang khu vực Bắc Á và Đông Á. Như vậy có thể đưa ra giả thuyết là hai luồng phát tán của dòng EAI và dòng Beijing đang gặp nhau tại Việt Nam tạo ra sự thay thế của dòng Beijing với dòng EAI. Sự thay thế có thể đã diễn ra đối với dưới dòng EAI5 trước, rồi mới tới EAI4-VNM, khiến dưới dòng EAI4-VNM vẫn lưu hành nổi trội tạinơi mà dòng Beijing chiếm tỷ lệ cao, trong khi EAI5 chỉ nổi trội ở những nơi mà tỷ lệ dòng Beijing còn thấp. 20 21 Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao trong cùng một dòng ở ba miền Chủng vi khuẩn lao trong cùng một dòng lưu hành ở các khu vực khác nhau tương đối khác nhau, thể hiện ở tỷ lệ tạo cụm phân tử thấp trong mẫu nghiên cứu (4%) và độ tập trung cao hơn của chủng trong cùng một miền so với chủng không cùng một miền. trị kém có thể là nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ kháng thuốc cao.Như vậy các biện pháp đảm bảo tuân thủ điều trị cần phải được chú trọng đối với đối tượng này.   Vi khuẩn lao có đặc điểm phân tử đặc trưng theo dòng Các chủng trong cùng một dòng có typ phân tử gần gũi nhau và rất khác so với typ phân tử của chủng thuộc dòng khác.Ở dòng Beijing và dòng EAI, tần suất xuất hiện một lặp lại nào đó tại mỗi MIRU-VNTR thường chiếm đa số so với các lặp lại khác trong tổng số chủng thuộc dòng đó và đặc trưng cho mỗi dòng.Ở dòng T, nhiều lặp lại cùng xuất hiện nổi trội tại mỗi MIRU-VNTR.Phân bố của các chủng dòng T thường ở phía cuối các nhánh cây phân loại của hai dòng chính Beijing và EAI, cho thấy đây là dòng có typ phân tử đa dạng. 4.2. Dịch tễ học phân tử bệnh lao kháng thuốc tại Việt Nam  Mức độ kháng thuốc của các dòng vi khuẩn lao ở ba khu vực nghiên cứutại ba miền Bắc, Trung và Nam Nhìn chungdòng Beijing là dòng kháng thuốc chống lao mạnh nhất.Ngược lại, dòng EAI là dòng nhạy cảm nhất.Mức độ kháng thuốc thấp nhấttrong số chủng Beijing là ở chủng Beijing phân lập ở miền Trung, cho thấy các thành phố lớn (Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh) là nơi xâm nhập không chỉ của chủng lao dòng Beijing mà còn của chủng Beijing kháng thuốc. Tỷ lệ kháng thuốc caoở miền Namkhông chỉ thấy ở dòng Beijing (36,7% kháng đa thuốc) mà còn ở các dòng lao khác trong đó có dưới dòng EAI4-VNM (45,5% kháng đa thuốc) mặc dù đây là dưới dòng vẫn còn rất nhạy cảm với thuốc ở các miền khác. Điều này gợi ý chủng lao của dưới dòng này đã phát triển tính kháng thuốc ngay tại khu vực. Ở miền Nam, tỷ lệ kháng thuốc của dưới dòng EAI4-VNM cao hơn bất kỳ dòng nào khác, nhưng ở miền Bắc lại là dòng nhạy cảm nhất. Như vậy có thể khả năng kháng thuốc của dưới dòng này tại miền Nam là một trong những yếu tố khiến tỷ lệ vi khuẩn dưới dòng EAI4-VNM ở miền Nam cao hơn nhiều so với miền Bắc.  Bệnh nhân nam có tỷ lệ kháng đa thuốc cao hơn bệnh nhân nữ Tỷ lệ kháng đa thuốc laoở bệnh nhân nam cao hơn có ý nghĩa so với bệnh nhân nữở cả ba miền.Như vậyyếu tố giới tính có thể phải được nhìn nhận như một nguy cơ trong các chiến lược kiểm soát bệnh lao.Nghiên cứu ở nhiều nước phát triển đã cho thấy bệnh nhân nam có xu hướng tuân thủ điều trị kém hơn so với bệnh nhân nữ do nhiều nguyên nhân. Tuân thủ điều  Phân bố dòng theo mức độ kháng thuốc của chủng lao miền Bắc và miền Nam Nhìn chung tỷ lệ chủng dòng Beijing tăng dần trong các quần thể vi khuẩn lao có mức độ kháng thuốc tăng dần,từ nhạy cảm tới đơn kháng và đa kháng. Trong khi ở chủng dòng EAI, sự khác nhau chỉ có ý nghĩa giữa nhóm đa kháng và nhóm nhạy cảm, với tỷ lệ chủng EAI thấp hơn ở nhóm đa kháng.Sự khác biệt về tỷ lệ chủng dòng EAI giữa nhóm kháng đơn thuốc và nhóm nhạy cảm không có ý nghĩa.Tuy nhiên kết quả này có thể bị ảnh hưởng bởi số lượng chủng EAI trong mẫu nghiên cứu ít hơn so với chủng Beijing, sự khác nhau có ý nghĩa có thể cũng xuất hiện khi cỡ mẫu tăng lên. Tỷ lệ chủng nhóm KHÁC cũng giảm dần có ý nghĩa trong các quần thể vi khuẩn lao có mức độ kháng thuốc tăng dần,cho thấy sự đa dạng của chủng lao giảm dần khi mức độ kháng thuốc tăng lên. Điều này cho thấy tính kháng thuốc có tính tập chung ở một số dòng lao nhất định, đặc biệt là dòng Beijing. Số chủng lao thuộc các dòng khác xuất hiện rất ít trong số chủng đa kháng.  Cấu trúc quần thể vi khuẩn lao thay đổi dưới tác dụng chọn lọc của thuốc chống lao Typ phân tử của chủng đa kháng và siêu kháng có tính tương đồng với nhau cao hơn so với tính tương đồng giữa chủng đa kháng hay siêu kháng với chủng nhạy cảm. Sự không khác biệt về typ phân tử giữa chủng đa kháng thuốc và chủng siêu kháng thuốc phù hợp với phân bố dòng không khác nhau có ý nghĩa giữa nhóm đa kháng thuốc và nhóm siêu kháng thuốc. Các chủng có mức độ kháng thuốc càng thấp mức độ đa dạng phân tử càng cao. Các phát hiện trên cho thấy vi khuẩn lao đã tiến hóa theo hướng thích nghi với áp lực của thuốc chống lao. Cấu trúc quần thể thay đổi theo xu hướng chọn lọc các chủng lao có khả năng kháng với thuốc chống lao tạo ra quần thể mới sự kém đa dạng về di truyền quần thể nhưng lại vượt trội về khả năng kháng thuốc. Do thuốc lao dòng hai mới chỉ được WHO khuyến cáo đưa vào áp dụng từ năm 1998, do vậy ảnh hưởng của thuốc dòng hai tới cấu trúc quần thể vi khuẩn nghiên cứu vẫn chưa được thể hiện. 22 23 Tương quan kháng thuốc trong vi khuẩn lao Việt Nam Vi khuẩn kháng với EMB thường kháng với RMP, INH và SM, kháng RMP thường kháng cả INH và SM, và kháng với INH thường kháng cả SM. Mô hình này được lặp lại ở cả ba miền và ở tất cả các dòng lao. Phát hiện về bơm thải ở vi khuẩn lao cho rằng ở nồng độ thốc không đủ tiêu diêt, vi khuẩn lao vẫn tồn tại. Để thích nghi chúng khởi đầu bằngbằng việc hình thành các bơm thải tương ứng trên vách tế bào để thải bỏ thuốc ra ngoài, tiếp đến các đột biến kháng thuốc sẽ được kích thích hình thành tạo nên tỷ lệ kháng thuốc cao. Đây có thể là khả năng dẫn đến mối liên quan giữa các kháng thuốc khác nhau trong vi khuẩn. Nhiều loại thuốc khác nhau có thểbị thải bỏ bởi cùng một loại bơm thải, ví dụ bơm EMB có thể loại bỏ RMP, INH và SM. Tương tự, bơm RMP có thể thải bỏ INH và SM v.v.Cơ chế này dẫn đến sự xuất hiện sau đó của các đột biến kháng thuốc. 4.4. Khả năng phát triển phân loại thường quy bằng kỹ thuật MIRUVNTR Kết quả cho thấy sự thống nhất giữa hai kỹ thuật phân loạispoligotyping và MIRU-VNTR, đặc biệt đối với việc xác định vi khuẩn lao thuộc hai dòng chính là Beijing và EAI. Như vậy phân loại bằng MIRU-VNTR bất kể là sử dụng bộ 12 hay bộ 15 MIRU-VNTR cũng có thể dùng để phân loại chủng lao dòng Beijing và EAI mà không cần sự hỗ trợ của kỹ thuật spoligotyping. Việc giảm bớt một khâu trong phân loại sẽ thúc đẩy và duy trì phân loại thường xuyên đối với chủng M. tuberculosis đặc biệt ở những nước có thu nhập thấpvà là nơi chủng lao dòng Beijing và EAI lưu hành cao như Việt Nam. Việc vi khuẩn lao, đặc biệt là chủng dòng Beijing thể hiện tính đa dạng phân tử cao sau khi phân loại bằng MIRU-VNTR cho thấy kỹ thuật phân loại này có khả năng phân loại mạnh, phù hợp với điều tra dịch tễ.  4.3.Đặc điểm chủng vi khuẩn lao trẻ em Phân loại bằng spoligotyping cho thấy chủng lao dòng Beijing chiếm tỷ lệ rất cao (68,4%) trong số chủng lao trẻ em.Tỷ lệ chủng dòng Beijing cao trong trẻ em phù hợp với phát hiện chủng Beijing đang nổi lên ở Việt Nam. Chủng lao trẻ em có mức độ nhạy cảm cao với thuốc lao. Toàn bộ 19 chủng lao trẻ em đều nhạy cảm với cả 4 loại thuốc chống lao dòng một RMP,INH, SM và EMB. Kết quả nghiên cứu phát hiện 8 trong tổng số 19 chủng lao trẻ em trong nghiên cứu thuộc cụm phân tử, cho tỷ lệ tạo cụm 22%, cao hơn so với tỷ lệ 4% ở mẫu vi khuẩn lao người lớn khi áp dụng cùng một chiến lược chọn mẫu. Điều này chứng tỏ lây nhiễm hiện thời là tác nhân quan trọng gây bệnh lao ở trẻ em. Tỷ lệ chủng lao có cùng kiểu phân tử tương đối cao trong số ít ỏi các chủng lao phân lập được từ trẻ em, bên cạnh đó khác biệt về tính kháng thuốc cho thấy có khả năng yếu tố chọn lọc đã có vai trò trong gây bệnh lao trẻ em. Các bằng chứng nghiên cứucho thấy vi khuẩn lao kháng thuốc có xu hướng lây truyền kém hơn so với vi khuẩn lao nhạy cảm.Trong nghiên cứu, toàn bộ số chủng lao trẻ em đều nhạy cảm với thuốc lao. Trong số các chủng nhạy cảm, có một số dòng, một số typ phân tử nhất định nổi trội.Như vậy không phải tất cả vi khuẩn lao đều có thể gây bệnh ở trẻ em. Điều nàyđưa ra hai giả thuyết. Một làkhả năng miễn dịch lao của trẻ dưới 15 tuổi tốt hơn so với người lớn.Hai là vắc-xin BCG có hiệu lực bảo vệtốt trên trẻ em khiến cho chỉ những chủng lao có khả năng lây truyền vượt trộimới có thể gây bệnh ở trẻ.Nếu giả thuyết thứ nhất đúng, vắc-xin phòng lao mới cần phải được phát triển không những cho trẻ em, mà còn phải nhắm vào cả người trưởng thành. Nếu giả thuyết thứ hai đúng, việc tiêm phòng vắc-xin BCG cần phải được tiếp tục duy trì. KẾT LUẬN 1. Đặc điểm phân bố dòng, dưới dòng của vi khuẩn lao lưu hành tại một số tỉnh khu vực đồng bằng Bắc bộ và vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2003-2009 - Có 8 dòng và 13 dưới dòng vi khuẩn lao đang lưu hành tại Việt Nam. Dòng Beijing và dòng EAI là hai dòng nổi trội nhất. Dòng Beijing chiếm từ 28% đến 70%, tỷ lệ dòng EAI dao động mạnh từ 7% đến 59% ở các khu vực và vùng miền khác nhau. Ở đồng bằng Bắc bộ, tỷ lệ dòng Beijing ở khu vực thành phố (62,5%) cao hơn khu vực nông thôn (28,8%). Dưới dòng EAI4-VNM là dưới dòng phổ biến nhất trong số dưới dòng của dòng EAI ở hai miền Bắc và Nam, nhưng không phổ biến hơn dưới dòng EAI5 ở khu vực miền Trung. - Không có sự khác biệt trong phân bố dòng vi khuẩn lao giữa mẫu bệnh viện và mẫu cộng đồng nhưng có sự khác biệt trong tỷ lệ tạo cụm. Tỷ lệ tạo cụm phân tử trong mẫu bệnh viện (17,9% ở thành phố và 19,2% ở nông thôn) cao hơn trong mẫu cộng đồng (0%). - 6/7 trường hợp bệnh nhân nghiên cứu có kết quả nuôi cấy dương tính tại thời điểm sau 6 tháng điều trị bị tái nhiễm lao. 2. Mức độ kháng thuốc của các dòng, xác định phân bố dòng của quần thể theo mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2005-2008 - Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao khác nhau giữa các dòng lao khác nhau và giữa ba miền Bắc, Trung và Nam. Nhìn chung vi khuẩn lao kháng thuốc mạnh nhất ở miền Nam và thấp nhất ở miền Trung, 24 25 mạnh nhất ở dòng Beijing và thấp nhất ở dòng EAI. Ở miền Nam tỷ lệ đa kháng dao động từ 33% đến 45% giữa các dòng. Ở miền Trung trừ chủng lao dòng Beijing (21,4% kháng đa thuốc), các dòng khác vẫn nhạy cảm với thuốc (không có chủng đa kháng nào). Ở miền Bắc, mức độ kháng thuốc của dòng Beijing tương đương với miền Nam, các dòng khác thấp hơn miền Nam nhưng cao hơn miền Trung. - Mô hình thống kê cho thấy vi khuẩn lao kháng với EMB thường kháng với cả ba thuốc còn lại, kháng RMP thường kháng với INH và SM và kháng với INH thường kháng với SM, mô hình này lặp lại ở cả ba miền và ở tất cả các dòng lao. - Chủng lao có mức độ kháng thuốc càng cao mức độ đa dạng phân tử càng thấp. Cấu trúc quần thể vi khuẩn lao thay đổi theo hướng chọn lọc các chủng có khả năng kháng thuốc cao tạo ra quần thể kém đa dạng về di truyền nhưng vượt trội về khả năng kháng thuốc. 3.Đặc điểm chủng vi khuẩn lao trẻ em - Toàn bộ 19 chủng lao trẻ em trong nghiên cứu đều còn nhạy cảm với thuốc chống lao. - Chủng lao dòng Beijing chiếm tỷ lệ cao (68%) trong số chủng lao trẻ em. Chủng dòng T chiếm hầu hết số còn lại (26%) - Tỷ lệ tạo cụm phân tử của chủng lao trẻ em (22%) cao hơn so với chủng lao người lớn (4%) trong cùng chiến lược chọn mẫu. DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN KIẾN NGHỊ - - - Đánh giá gánh nặng bệnh lao cao cần được hỗ trợ bằng dịch tễ học phân tử. Điều tra dịch tễ học phân tử nên được kết hợp với các cuộc điều tra kháng thuốc toàn quốc. Điều tra dịch tễ học phân tử nên trở thành một trong các chương trình hoạt động của chương trình Chống lao Quốc gia, kết quả được sử dụng trong xây dựng các biện pháp can thiệp. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử bệnh lao cần phải được duy trì thường xuyên và liên tục ở Việt Nam để theo dõi biến động phân tử và động năng lan truyền của chủng lao Việt Nam, đặc biệt là chủng lao kháng thuốc và chủng có độc tính cao nhằm đối phó kịp thời. Phát hiện sớm nhóm nguy cơ cao và yếu tố nguy cơ làm lan truyền bệnh lao bằng điều tra dịch tễ học phân tử để tích cực sàng lọc và can thiệp. 1. Xác định kiểu nhóm phân tử chủng vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao một số khu vực tỉnh Hà tây và Hà nội bằng kỹ thuật spoligotyping. Tạp chí Y học dự phòng, tập số XVIII, số 7(99), 2008, tr. 27-34. 2. Đặc điểm phân tử chủng lao M. tuberculosis phân lập từ trẻ em khu vực đồng bằng Bắc bộ. Tạp chí Y học dự phòng, tập số XIX, số7(106), 2009, tr. 81-87. 3. High Prevalence of Beijing and EAI4-VNM Genotypes among M. tuberculosis Isolates in Northern Vietnam: Sampling Effect, Rural and Urban Disparities. PloS ONE. Nhận đăng 21. 8. 2012.