Tài liệu Di truyền vi sinh vật

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN I. Giới thiệu Ở nước ta, nuôi trồng thủy sản ngàng càng chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế. Trong những năm gần đây, nhằm nâng cao năng suất thủy sản phục vụ nhu cầu xuất khẩu nên mức độ nuôi thâm canh hóa ngày càng cao. Bệnh trên tôm, cá và các loại thủy đặc sản cũng xuất hiện ngày càng nhiều. Bệnh đã gây nhiều tổn thất cho nghề nuôi thủy sản. Sản phẩm làm ra không được tiêu thụ hoặc chất lượng sản phẩm giảm, không đảm bảo cho tiêu dùng và xuất khẩu. Do đó, công tác phòng trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản đang đòi hỏi cấp bách ( Bùi Quang Tế, 2008). Tuy nhiên, nhiều sản phẩm thuốc thủy sản hiện nay đã dần mất tác dụng với các loại mầm bệnh quen thuộc do việc sử dụng thuốc quá mức và không đảm bảo liều lượng theo yêu cầu dẫn đến tình trạng kháng thuốc của các loại mầm bệnh ngày một tăng. Việc sử dụng các dòng vi khuẩn có lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh đang được chú trọng, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic (VKL). VKL là tên gọi của nhóm vi khuẩn sinh ra axit lactic như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa chất bột đường và chúng được xếp vào họ Lactobacteriaceae ( Lê Văn Nhương và csv., 2009). VKL có ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn với axit lactic là nguyên liệu rất cần thiết của nhiều ngành công nghiệp. Đặc biệt, trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm như sữa chua, các loại dưa từ rau củ, các loại sản phẩm thủy sản lên men ( Lương Đức Phẩm, 2004). Trong quá trình lên men, VKL sinh ra các axit hữu cơ, chúng tao ra môi trường không thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào. Axit lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc oxi hóa, làm dừng quá trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với nó ( Lê Văn Nhương và csv,. 2009). Nhằm làm tiền đề cho nghiên cứu dòng VKL có khả năng sinh chất kháng tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trên động vật hay thủy sản hiện nay, đề tài “ Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm thủy sản lên men có khả năng kháng khuẩn” được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu Nhằm tìm ra một dòng VKL có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men. Nội dung nghiên cứu Phân lập một số dòng VKL trong các sản phẩm mắm và nước mắm Kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các nhóm VKL phân lập đươc. II. Lượt khảo tài liệu 1. Một số quy trình lên men thủy sản 2. Vi khuẩn lactic Lên men lactic là quá trình thu nhận năng lượng nhờ VKL, bao gồm sự biến đổi một phân tử đường thành 2 phân tử axit lactic và năng lượng tách ra: C 6 H 12 O6 =2C H 3 CHONCOOH +0.075 ×10 6 J VKL được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Các sản phẩm lên men axit lactic truyền thống đã được sử dụng lâu đời như lên men rau hoa quả, lên men thịt, lên men cá. Nhưng mãu đến năm 1878, lister mới phân lập được VKL, ông gọi vi khuẩn này là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Trestococcus lactic). Từ đó đến nay, nhiề loại VKL được phát hiện và ứng dụng có ích của chúng ngày càng được mở rộng ra nhiều lĩnh vực, đặc biệt là thực phẩm và thực phẩm chức năng. Công Nghiệp lên men để sản xuất axit lactic có thể nói được hình thành từ năm 1881 ( Nguyễn Lân Dũng và csv, 1997). Những loài vi khuẩn lactic khác nhau có sự thích nghi để phát triển rộng rãi trong điều kiện môi trường khác nhau, và chúng được phổ biến rộng rãi trong tự nhiên. Vi khuẩn lactic thường được tìm thấy ở đường tiêu hóa ( dạ dày và ruột non) của các loài động vật khác nhau ( chuột, lợn, gia cầm và con người). Trong sữa và các sản phẩm từ sữa, các sản phẩm thủy sản, và trên một số bề mặt hệ thực vật. Chúng thường được dùng trong sản xuất và bảo tồn các sản phẩm thực phẩm như pho mát, thịt, sữa chua. Một vài VKL được tìm thấy trong các sản phẩm thủy sản lên men của Hàn Quốc. Ngoài đặc tính lên men axit lactic, VKL còn giúp chuyển hóa thức ăn trong cơ thể, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh( tạo ra axit formic, axit bezoic, H2O2, chất kháng khuẩn...), giúp phòng một số bệnh (cao huyết áp). a. Đặc điểm của vi khuẩn lên men lactic: Vi khuẩn lên men axit lactic có hai dạng hình chính là hình cầu và hình que. Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường hay các điều kiện ngoại cảnh khác nhau thì có hình dạng khác nhau nhưng chúng đều có một số đặc điểm sau: chúng là những vi khuẩn Gram dương, không có khả năng sinh bào tử, catalase âm tính, oxydase âm tính, khử natri âm tính và hầu hết đều không chuển động, chúng có khả năng tổng hợp nhân hem của các polyphyrine, chúng không có chứa xitocrom. Chúng có thể sinh trưởng được khi có mặt oxy, là loại cơ thể duy nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như yếm khí. Theo hình dáng tế bào và cách sắp xếp tế bào trong môi trường người ta thường chia VKL thành 4 giống (4 chi): Streptococcus , pediococcus, Lactobacullus và Leuconotoc. Các chủng thuộc 4 chi này có thể lên men đồng hình hay dị hình. Các chủng lên men đồng hình thường được sử dụng để bảo quản thực phẩm, ướp chua cá thịt, trong sản xuất axit lactic. b. Cơ chế của quá trình lên men lactic Trong quá trình lên men axit lactic, cơ chất đầu tiên tham gia vào quá trình lên men là đường glucose hoặc fructose. Khi sử dụng nguồn nguyên liệu là các đường đôi hay các chất chứa gốc đường thì trước khi tham gia vào quá trình lên men chúng phải được thuỷ phân thành glucose hay fructose nhờ các enzyme tương ứng. Lên men axit lactic là quá trình chuyển hóa yếm khí đường thành axit lactic. Có 2 kiểu len men lactic. Trong lên men lactic đồng hình thực tế chỉ xuất hiện axit lactic, còn trong lên men dị hình các sản phẩm cuối cùng khá đa dạng: axit lactic, etanol, axit acetic và CO2. Chỉ có lên men lactic đồng hình là có ý nghĩa về mặc công nghiệp. 3. Mối quan hệ giữa axit laxtic với cá và các sản phẩm từ cá. VKL không được coi là thuộc về môi trường thủy sản, nhưng có một sô loài vi khuẩn như: Carnobacterium, Vagococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus đã được tìm thấy trong các loài cá nước ngọtvà môi trường nước nuôi. Carnobacteria , Carnobacteria piscicola chiếm phần lớn và thấp nhất là Carnobacteria divergens, đã có những ghi nhận về các giống vi khuẩn này như một phần của hệ vi sinh đường ruột của nhiều loài cá. Mặt khác, Carnobacteria piscicola và Lactobacillus sp. có mối quan hệ với cá bệnh. Tuy nhiên, sự quan trọng của Carnobacteria như là một tác nhân gây bệnh cá nhưng không thể đánh giá chính xác. Một vài nghiên cứu liên quan tới sản phẩm cá được đóng gói và hút chân đã được thực hiện tập trung vào ảnh hưởng của chế biến và trên các vi sinh vật chất lượng. Sau khi kết thúc quá trình giữ lạnh ở nhiệt độ khác nhau, VKL qua quá trình kiểm tra có từ 106 – 108 CFU/g. Trong nghiên cứu cửa Zorn et al mật số vi khuẩn của Carnobacteria vượt trội trong sản phẩm cá hồi đóng gói hút chân không được bảo quản ở nhiệt độ 80C và 200C. Một nghiên cứu trước kia trên sản phẩm cá được hút chân không giữ lạnh. Sau khi kết thúc giai đoạn giữ lạnh sự biến đổi của hệ vi sinh vật với vi khuẩn lactic, Enterobacteriaceae và một số vi khuẩn khác đã được quan sát thấy trong sản phẩm được lưu trữ ở nhiệt độ ướp lạnh. Mật số VKL từ 10 6 – 108 CFU/g . Trong một vài trường hợp, số lượng vi khuẩn lactic 10 6 – 107 CFU/g cùng với mật độ vi khuẩn Gram âm từ 105 – 107 CFU/g. Theo Leroi et al., (2001) phân biệt tại thời điểm hỏng cho cùng một loại sản phẩm có ba loại vi khuẩn khác nhau: lactobacilli, một hỗn hợp của lactobacilli và Enterobacteriaceae hoặc hỗn hợp của VKL và Brochothrix thermospacta. VKL trong sản phẩm giữ lạnh hút chân không bị hư hỏng được tìm thấy các giống vi khuẩn Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus và Carnobacterium. Theo Magnusson và Traustadottir (1982) cho rằng chỉ có vi khuẩn Lactobacilli homofermentative trong chân không đóng gói lạnh cá trích hun khói. 4. Chất kháng khuẩn (CKK) Trong các sản phẩm chuyển hóa có khả năng ức chế vi sinh vật của VKL thì chất kháng khuẩn được các nhà khoa học và nhà công nghiệp thực phẩm đặc biệt chú ý. CKK và VKL bắt đầu được nghiên cứu năm 1940. Từ đó đến nay đã có rất nhiều CKK khác nhau được phát hiện (Lê Văn Nhương và csv, 2009). Nisin là CKK được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất, được sử dụng trên 40 nước khác nhau. Theo tài liệu gần đây nhất thì CKK được định nghĩa như sau: “ CKK là các polypeptit có tính kháng khuẩn, được sản sinh trên các ribosome hoặc các protein có khả năng kháng khuẩn chống lại phổ hẹp các loại học hang gần gũi” (Lê Văn Nhương và csv, 2009). Người ta chứng minh chắc chắn rằng nhiều loài VKL sản sinh ra CKK (Cleveland et al., 2001. Hiện nay, CKK được chia thành 4 nhóm Nhóm 1: là nhóm lantibiotic, là loại polypeptide có khối lượng phân tử nhỏ (<5 KDa), chứa amino acid lanthionine, β – methyllanthionine. Nhóm II: gồm các CKK không phải là lantibiotic, khối lượng phân tử nhỏ (<10 KDa). Cấu trúc nếp gấp β, bền nhiệt , có thể chịu đượng nhiệt độ khoảng 100 – 1210C. Nhóm III: các CKK có khối lượng phân từ lớn (>30 KDa), khả năng bền nhiệt cao. Nhóm IV: đây là nhóm CKK phức tạp. Trong cấu trúc phân tử ngoài protein, chúng còn chứa các thành phần khác là lipid, carbonhydrat. Bảng 2.1 Cơ chế tác dụng của CKK của VKL CKK của VKL dù thuộc nhóm này hay nhóm khác nhưng chúng đều có một cơ chế tác dụng chung. Đó là chúng tấn công màng tế bào nhạy cảm, gây tổn thương màng không thể khắc phục được, tế bào này sẽ chết do nội chất thoát ra ngoài. Sỡ dĩ CKK có thể tấn công vì chúng có dạng hòa tan, dễ dàng xâm ngập vào tế bào, làm mất lực đẩy proton (PMF), làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào, từ đó tế bào không thể tổng hợp được màng tế bào và tế bào bị chết. III. Phương pháp nghiên cứu. 1. Vật liệu thí nghiệm 2. Phương pháp thu và bảo quản mẫu 3. Phương pháp phân lập mẫu VKL từ mẫu mấm IV. Kết quả và ứng dụng. 1. Phân lập một số dòng VKL từ các sản phẩm lên men a. Tăng sinh lần 1 Mẫu mấm sau khi thu về tiến hành lần 1 ở 30 độ C, thời gian 24h trong 3 loại môi trường khác nhau: MRS Broth, muối sinh lý, nước cất đã thanh trùng Tăng sinh lần 1 có 36 dòng phát triển trong môi trường nước cất. 30 dòng phát triển trên môi trường muối sinh lý 9%. 32 dòng phát triển trên môi trường MRS Broth. Sự khác nhau này do VKL có khả năng phát triển trong những điều kiện môi trường khắc nghiệt. b. Cấy ria lên đĩa petri Những mẫu phát triển ở tăng sinh lần 1 đem di cấy ria trên môi trường MRS_agar có bổ sung CaCo3 0.6%, khi cấy đĩa được quấn parafin xung quanh ủ ở 30 độ sau 24h. Kết quả tạo vòng trong đối với môi trường có bổ sung CaCo3 c. Thử catalase và nhộm ram Tiến hành nhộm gram và thử catalase và kết quả đạt được là vi khuẩn màu tím, gram dương âm tính với catalase, d. Tăng sinh lần 2 Tăng sinh mẫu ở 30 độ ở môi trường MRS_Broth có bổ sung Nacl 0.6%. Theo Pongtep Wilaipun et al các dòng VKL sẽ sinh CKK tốt nhất ở 30 độ và khả năng này sẽ giảm khi tăng nhiệt độ. Kết quả có tất cả 56 đĩa lên khuẩn lạc, có 26 mẫu bị nhiễm nấm do thao tác, do tủ cấy và phòng thí nghiệm được sử dụng chung cho các mục đích khác nhau e. Trữ mẫu Mẫu được trữ vào falcon chứa dung dịch glycerol 30% đã thanh trùng, quấn parafin và lắc đều trên mấy vortex. Mẫu trữ ở -80 độ Khuẩn lạc sẽ được trữ trên môi trường nghiêng chứa môi trường MRS_agar trong ống effendoft 1.5 ml, mỗi mẫu cấy vào 3 ống, đem ủ ấm ở 300C đến khi xuất hiên khuẩn lạc rõ sau 48h. Mẫu được trữ ở 48h 2. Kiểm tra khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được Chọn ngẫu nhiên các mẫu 78, 80, 83 tiến hành tối uu hóa theo quy trình hình 3.2 Khi tăng sinh ở 30 độ sau 48h thi cho ra kết quả tốt nhất với vòng kháng khuẩn rõ đường kính vòng 1.3cm 3. Thử khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml môi trường MRS_agar nuôi ở 30 độ sau 48h đem thử trực tiếp với dòng chỉ thị pediococcus pentosakeus. Kết quả cho thấy vòng to và rõ hơn với các mẫu đã phát triển tốt ở lần đầu Kết luận Ứng dụng Sản phẩm của quá trình lên men lactic và thuỷ phân protein là tôm chua Trong nuôi tôm Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất và sử dụng trong ương cá tra