CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
Thế giới ngày nay với sự phát triền không ngừng về kính tế xã hội và con người. Cuộc sống
thay đối theo chiều hướng tốt đẹp hơn, con người được tạo điều kiện phát triển tối đa khả
nãng cùa mình, nhu cầu của con người ngày càng được đáp ứng đầy đù. Ngày xưa chỉ cần
cơm no áo ấm là đủ, còn bây giờ cần phải ăn ngon mặc đẹp luôn biết cách làm cho mình đẹp
hơn. Không chỉ phụ nữ biết cách làm đẹp, mà nam giới cũng không thua kém, vì vậy các sản
phẩm mỹ phẩm phát triển để đáp ứng nhu cầu đó. Con người chú trọng chăm sóc da cúa họ ai
cũng luôn muốn mình xinh đẹp và trẻ trung. Xã hội đã có những nghiên cứu đề tạo ra những
loại mỹ phẩm tốt cho làn da luôn cãng mịn và tươi trẻ, trong những loại mỹ phẩm đó luôn có
chứa một loại protein đỏ là collagen. Collagen có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa cúa da.
Collagen được con người sử dụng vào nhiều mục đích nhu trong y học và thực phẩm.
Ở Việt Nam trong những năm gần đây nghề nuôi trồng, khai thác và chế biến thuý sản phát
triến đặc biệt là ở các tỉnh Đồng Bang Sông Cừu Long với hai đối tượng thủy sản nước ngọt
chủ yếu là cá tra và cá basa của Việt Nam đâ mở rộng thị trường xuất sang 24 quốc gia mới,
nâng tống số các thị trường nhập khau cá tra, cá basa cùa Việt Nam lên 110 quốc gia và vùng
lãnh thồ. Theo bộ nông nghiệp và phát triên nông thôn cá tra, cá basa vẫn đang là mặt hàng
chiếm tỉ trọng giá trị xuất khẩu cao nhất trong nhóm thủy sân. thị trường tiêu thụ chính của cá
tra, basa Việt Nam vẫn là EU với kim ngạch đạt 206 triệu USD trong 6 tháng đầu năm (2009).
Riêng thị trường Mỹ, bat chấp khó khăn do khủng hoảng kinh tế, xuất khấu sang nước này đã
có sự tãng trưởng vượt bậc đat 45.97 triệu USD, tăng 59.98% so với cùng kì năm 2008, Cá tra
và basa đa phần được xuất khẩu dưới hình thức philê vì thế mà phể liệu thải trong quá trình
chế biến sẽ rất nhiều (chiếm 50-60%)
Hiện nay nước ta đã có nhiều nghiên cứu đe dùng da cá làm nguyên liệu sân xuất collagen vì
da cá tra và cá basa chứa hàm lượng collagen khá cao, chất lượng của nó không thua kém các
loại nguyên liệu khác, vì thế việc sử dụng da cá để sàn xuất collagen sẽ đưa ngành thủy sản có
hướng đi mới. Tóm lại với những ưng dụng có tầm quan trọng hiện nay, collagen ngày càng
được nhiều nhà khoa học dược sĩ, tham mỹ quan tâm. Ở Việt Nam chúng ta có nguồn phế liệu
da cá rất phong phú rất t giàu collagen. Do vậy, việc nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá
tra sau khi đã loại được
CHƯƠNG 2. TÓNG QUAN VÈ COLLAGEN
2.1.
KHÁI QUÁT VÈ COLLAGEN
Collagen là protein chính cùa mô nối động vật và là protein dồi dào nhất ờ những động vật có
vú[1 ], chiếm khoảng 25% tới 35% toàn bộ lượng protein trong cơ thể. Collagen tạo nen 1%
tới 2% cùa mô cơ, và chiếm 6% về trọng lượng cùa gân, xương, dây chằng, sụn và răng trong
CO' the. Gelatin được sù' dụng trong thức ăn và các ngành công nghiệp khác nhau và thu được
từ quá trình thủy phàn một phần Collagen.
2.1.1, Thành phần và cấu trúc
Collagen có kết cấu rất phức tạp. Tropocollagen hay "phân tứ Collagen" là một đơn vị lớn
hơn cùa Collagen gọi là các sợi. Nó dài khoảng là 300 nm với đường kính 1,5 nm, tạo thành
bởi ba chuỗi polypeptit (peptit anfa), mỗi chuỗi này đều được sắp xép theo một đường xoắn
ốc phía tay trái.
Hình 1,2: Hình ảnh cấu trúc xoắn ba cùa collagen
Ba chuỗi xoắn ốc được cuộn cùng nhau chiều thuận tay phải, "đường xoắn ốc đặc biệt" hoặc
đường xoắn ốc bộ ba, một cấu trúc bậc bốn được ổn định bởi nhiều liên két hydro.
Một đặc điêm đặc trưng của collagen là sự săp xêp đều đặn của các amino axit trong
mỗi mát xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này. Thông thường các chuỗi theo mẫu sau:
Gly-Pro-Y hoặc Gly-X-Hyp, ở đây X và Y là các axit amin còn lại. Proline hoặc
hydroxyproline tạo nên khoảng 1 /6 tồng số chuỗi.
Glycine chiếm 1/3 số chuỗi, điều này có nghĩa là khoảng nửa chuỗi collagen không chứa
glycine, proline hoặc hydroxyproline, các nhóm GXY khác thường trong các chuỗi peptit
collagen an fa. Sự phân bố đều đặn với hàm lượng glycine cao được tìm thấy ở một số ít loại
prôtêin dạng sợi, như sợi tơ tằm. Chiếm 75- 80 % của tơ tam là : Gly - Ala - Gly- Ala với
10% serine.
2.1.2. Phân loại
Collagen tồn tại ờ nhiều bộ phận trong cơ thê. Đã có 29 loại collagen được tìm thây và thông
báo trong các tài liệu khoa học. Trên 90% collagen trong cơ thể là dạng I, II, III
và IV.
• Collagen I: có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương (thành phần chính cùa
xương)
• Collagen II: có trong sụn xương (thành phần chính của sụn) • Collagen III: có trong bắp
(thành phần chính của bắp), tìm thẩy bên cạnh collagen I. • Collagen IV: thành phản chính
cấu tạo màng tế bào Các bệnh về collagen thường do sự khiêm khuyêt cúa gene gây nên tác
động cho quá trình tông họp sinh hóa, sự săp xêp, sự sao chép bị thay đôi, hoặc các quá ưình
khác trong việc hình thành của collagen, 2.1.3. ủ ng dụng của collagen Collagen là một dạng
protein cấu trúc sợi dài và hầu hết các chức năng của nó khác với dạng dạng protein phố biến
khác như enzyme. Những bó collagen hay còn gọi là những sợi collagen là thành phần chính
của thể nền màng tế bào cấu tạo nên hầu hết các mô và cấu trúc bên ngoài của tế bào, nhưng
collagen cũng được tlm thấy bên trong của te bào. Collagen có cường độ kéo đứt rảt lớn và là
thành phần chính của băng trong y học, gân, sụn, xương, dây chăng và da. Cùng với keratin
mềm, là nguyên nhân gây ra độ dẻo dai của da và nếu nó thoái hóa sẽ gây ra nếp nhăn dẫn
đên tuôi già. Nó tạo nên độ bền của thành mạch máu và đóng vai trò quan trọng trong sự phát
triên mô tế bào. Nó có trong giác mạc, thủy tinh thể của mắt. Collagen cùng được dùng trong
phẫu thuật thẩm mỹ và phẫu thuật bỏng. Collagen đã thủy phân có thể đóng vai trò
quan trọng trong việc điều chỉnh cân nặng, giống như protein khi ta dùng nó có cảm giác
cung cấp đủ năng lượng. 2.1.3.1, Úng dụng trong công nghiệp Khi collagen được thủy phân
đù ta thu được một loại protein dễ tan trong nước, được gọi là gelatin. Gelatin được sử dụng
trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, và công nghiệp nhiếp ảnh. Trong lĩnh vực dinh
dưỡng, collagen và gelatin là nguồn protein nghèo, chúng không cung cấp đầy đủ tất cã các
amino axit thiết cho cơ the con người- chúng là protein chưa đầy đủ. Các nhà sản xuất
collagen để làm thực phầm bổ xung thông báo rang săn phàm của họ giúp tái tạo da, móng tay
và tăng cường sức khỏe.
Tuy nhiên, các định hướng nghiên cứu khoa học hiện nay không chi ra những bằng chứng cho
điều này. Đặc biệt với vấn đề trong những trường hợp bị thương tổn dưới điêu kiện khác (như
sụ lão hỏa, da khô, chứng viêm khớp...) hơn là sự thiêu hụt
protein.
Xuất phát từ Hy Lạp của từ keo (glue), kolla, collagen trên thế giới có nghĩa là “ nhà săn xuất
keo” và cho rang quá trình nau da và gân cúa ngựa và động vật khác có thể thu được keo. Keo
dán collagen đã được xử dụng ở Ai Cập từ 4000 năm trước, và người châu Mỹ cô đã dùng nó
trong cung tên từ 1500 năm trước. Collagen thường chuyên hóa thành gelatin nhưng thường
đựợc tiên hành trong điều kiện khô. Keo dán từ động vật có tính nhiệt dẻo, mềm trở lại khi
gia nhiệt, vì vậy chúng được sử dụng làm dụng cụ âm nhạc như dây đàn violin, đàn guitar.
2.1.3.2. ứng dụng trong y học và dược phẩm và mỹ phẩm Collagen đã được sừ dụng rộng
rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, như là hỗ trợ chữa bệnh cho bệnh nhân bỏng làm tái tạo xương
và rất nhiều trong nha khoa, phẫu thuật chình hình. Một số điểm đáng chú ý là: -Khi được sữ
dụng mỹ phấm, có một số trường hợp gây phản ứng dị ứng đỏ mắt kéo dài, tuy nhiên, điều
này hầu như được loại bởi một cách đơn giản là nên thữ nghiệm trước khi sử dụng mỹ phẩm,
và - Nhất là loại collagen y tế có nguồn gốc từ trâu bò (xương) thả rông nhiễm chứng BSE
(Bovine spongiform encephalopathy) . Hầu hết các nhà sản xuất sử dụng động vật từ các
trang trại "đóng đàn”, hoặc từ các nước đã không bao giờ có trường hợp báo cáo của BSE như
úc, Brazil và New Zealand. - Da, mô (lợn) cũng được sử dụng rộng rãi đè sản xuất các tấm
collagen cho nhiều mụcđích phấu thuật.
- Lựa chọn sử dụng thay thế chất béo, axit hyaluronic hoặc gel polyacrylamide cho các bệnh
nhân cũng đã được thực hiện.
Collagen đang được dùng rộng rãi đê thay thẻ da nhân tạo, được sử dụng trong việc chữa trị
bỏng nặng. Những collagen có thê được bát nguồn tù bò, ngựa hoặc lợn, thậm chí cả con
người, dùng luôn và đôi khi được sử dụng kết hợp với silicones, glycosaminoglycan, nguyên
bào sợi, các yeu tố tăng trưởng và các chất khác.
Collagen cũng được bán thưoưg mại như là một chất bồ sung tính linh động, bởi vì các
protein được phân cắt thành các axit amin trước khi hấp thu, không có lý do collagen ăn uống
ảnh hưởng đến mô liên kết trong cơ thế, ngoại trừ thông qua việc bố sung các axit amin cho
cơ thế.
Gần đây, một nguồn collagen cỏ sẵn thay thê cho loai collagen động vật đã Collagel được sữ
dụng. Mặc dù đát tiền, đó là collagen cùa con người, bắt nguồn từ xác người hiến tặng, nhau
thai và bào thai bị hủy bò, có thề giảm thiểu khả năng xảy ra các phàn
ứng miễn dịch.
Mặc dù nó không thê được hấp thụ qua da, collagen đang được sử dụng như là một thành
phần chính cho một so mỹ phảm trang diêm * Các dạng collagen thu được từ da cá >
Collagen dạng bột > Collagen dạng gel
2.2. những nghiên Cứu về collagen ở việt nam và trên thé GIỚI
2.2.1. Nghiên cứu collagen ở Việt Nam
(TNO) Ngày 8.10, Sớ Nông nghiệp và Phát triên Nông thôn An Giang phối họp với trường
Đại học Bách khoa TP.HCM tổ chức hội thảo giới thiệu kết quả đề tài “Tách collagen từ da cá
tra đê ứng dụng trong sân xuât mỹ phâm” (thuộc dự án Jica Suprem, do Nhật Bàn tài
trợ).Bằng 2 phương pháp sử dụng acid acetic và sử dụng dung môi kết hợp với enzyme, nhóm
nghiên cửu của trường Đại học Bách khoa TP.HCM đã chiết xuất thành công chất collagen từ
da cá tra, cá basa.
Khi đê ở nhiệt độ dưới 39oC, collagen không bị biến tính về cấu trúc nên dễ bão quân.
Trong giai đoạn tiếp theo nhóm sẽ nghiên cứu công nghệ tách chiết collagen từ da và xương
cá tra, basa để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm.
Neu thành công, đề tài này chăng những giúp xử lý nguồn phế phẩm từ các nhà máy chế biến
thuỷ săn, giâm thiêu ô nhiễm môi trường mà còn giúp tăng giá trị cho cá tra,
basa...
2.2.2. Những nghiên cứu collagen trên thế giới
Trên thể giới, việc tách chiết collagen từ da cá đã được tiến hành từ năm 1990 và từ collagen
đã tạo ra nhiêu săn phàm úng dụng trong y học, mỹphâm
2.3. CÁ TRA VÀ TÌNH HÌNH XUÁT KHẲU
2.3.1. Giói thiệu về cá tra
Cá tra là tên gọi một họ, một chi và một số loài cá nước ngọt, ơ Việt Nam, cá tra sống chủ yếu
trong lưu vực sông Cửu Long và lưu vực các sông lớn cực nam, có thân dẹp, da trơn, có râu
ngắn.
Cá tra thuộc họ Pangasiidae. Họ Pangasiidae (họ cá tra) theo ITIS có 3 chi: chi Sinopangasius
(1 loài), chi Helicophagus (3 loài) và chi Pangasius (27 loài). Tuy nhiên, chi và loài
Sinopangasius, theo vài tài liệu như FishBase và một số bảng từ đồng nghĩa, được coi là từ
đồng nghĩa cúa Pangasius kempíí (cá bông lau). Ngoài ra trong chi Pangasius, trong 2 báng
phần loại khoa học nêu trên có 3 cặp tên đồng nghĩa.
Như vậy, có thể kể họ Pangasiidae có 2 chi và chi Pangasius có 24 loài.
Cá tra (theo Từ điên tiếng Việt, Nhà xuất bản Khoa học Xã hội, 1977) là loài cá nước ngọt,
không vảy, giống cá trê nhưng không ngạnh.
2.3.2. Tình hình xuất khấu cá tra Theo tin từ Hiệp Hội thuỳ sản (VASEP), xuất khấu cá tra
của cả nước 8 tháng đầu năm 2009 giám 7,3% so với 928 triệu USD cùng kỳ nãm 2008 đạt
860 triệu USD, chiếm trên 1/4 mức sụt giảm xuất khẩu thuỳ sản của cả nước.
Riêng trong tháng 8, xuất khâu cá tra giảm trên 20% că về khối lượng và giá trị so với cùng
kỳ năm ngoái. Trong đó, thị trường EU đã sụt giảm mạnh về khối lượng và giá trị nhập khẩu
mật hàng này với tỉ lệ tương ứng là 14% và 19% (các thị trường lớn
trong khối như Tây Ban Nha, Đức, Hà Lan và Bi đều giảm từ 18 -35% về giá trị nhập khẩu).
Ai Cập, vốn được coi là thị trường tiềm năng ở Trung Đông, cũng giâm mạnh NK cá tra Việt
Nam trong tháng này, giâm trên 40%.
Năm 2009, xuất khấu cá tra khá lao đao bởi những rào cản từ các nước nhập khấu chính,
trong khi nguồn cung cấp nguyên liệu trong nước không ổn định. Việc Mỹ dự định đưa cá tra
của Việt Nam vào danh mục cá da trơn theo luật Farmbill 2008 là một điều bất lợi cho con cá
tra vốn đã bị “đánh” bởi thuế chong bán phá giá. Bên cạnh đó, những “chi trích” của các
phương tiện truyền thông một số nước Châu Au (Italia, Tây Ban Nha, Na Uy), Trung Đông
và Niu Dilân đã làm hạn chế xuất khâu con cá này.
Kim ngạch xuất khâu cá tra những tháng đầu năm vượt tòm, nhưng 2 tháng gần đây sụt giàm
mạnh nên cá tra lại tụt xuống vị trí thứ 2 sau tôm đông lạnh. Riêng trong tháng 8, xuất khâu
cá tra giàm trên 20% cả về khối lượng và giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Trong đó, đáng lo
ngại là thị trường EU đã sụt giảm mạnh về khối lượng và giá trị nhập khẩu mật hàng này với
tỉ lệ tương ứng là 14% và 19% (các thị trường lớn trong khối như Tây Ban Nha, Đúc, Hà Lan
và Bĩ đều giảm từ 18 -35% về GT nhập khấu). Ai Cập, vốn được coi là thị trường tiềm năng ờ
Trung Đông, cũng giảm mạnh NK cá tra Việt Nam trong tháng này, giảm trên 40%.
Tuy nhiên, 8 tháng đầu năm nay, thị trường EU vẫn giữ ngôi vị quán quán vê nhập khẩu cá
tra Việt Nam với trên 355 triệu USD, chiiếm 41,4% thị phần, mặc dù giâm 2,4% về GT so với
cùng kỳ năm ngoái. Trong đó Đức vẫn duy trì tốc độ tăng trưởng khà quan với gan 14%, trị
giá trên 72 triệu USD. Tây Ban Nha vẫn đứng đầu với kim ngạch ồn định gàn 90 triệu USD.
Đáng chú ý sau 2 nãm liên tiếp sụt giảm nhập khẩu, thị trường Ba Lan đã tụt hạng xuống vị
trí thứ 5 với 24,8 triệu USD, giảm gần 36%, nhường chỗ cho thị trường Bì với 25,7 triệu
USD.
Nga và Ucraina - hai thị trường cùng tụt hạng do ảnh hưởng từ lệnh cấm cá tra Việt Nam
tháng 12/2008. Tháng 5/2009, cá tra Việt Nam lại được phép trở lại thị trường Nga, nhưng số
DN và khối lượng được phép xuất khẩu hạn chế khiển xuất khẩu sang thị trường này không
thê tăng trưởng mạnh. 5 tháng gân đây xuât khâu cá tra sang Nga chi đạt 43 triệu USD, khiến
tông xuất khâu 8 tháng giảm 67,7% so với cùng kỳ. Xuất khấu sang Ucraina giâm 44,5% đạt
47,7 triệu USD, Thay the vị tri của 2 thị trường này là Mỹ và ASEAN với mức tăng trường
tương ứng là 60,7% và 7,7% đạt 82 triệu USD và 58,8 triệu USD.
Mêhicô vẫn đang là thị trường tiềm nâng đối với cá tra Việt Nam với mức tãng gần 25% đạt
trên 44 triệu USD, đứng vị trí thử 5.
Bên cạnh những biến động về thị trường, vấn đề giá và nguồn cung nguyên liệu không ôn
định cũng là một yếu tố tác động giảm xuẩt kháu cá tra. Theo tin từ Hiệp hội Nghe nuôi và
Chế biến thủy sản An Giang cho biết, giá cá tra, ba sa nguyên liệu thời gian gần đây tăng từ
14.000 đồng- 15.000 đồng/kg (giá thu mua tại ao). Tuy nhiên, theo phản ánh của nhiều người
nuôi vẫn còn bị lỗ từ 800 đồng - 1.000 đồng/ kg, nên nhiều hộ vẫn còn “treo” hầm. Neu tình
trạng “treo” hầm vẫn tiếp diễn, những tháng đầu năm 2010, các doanh nghiệp chế biến thúy
săn sẽ có nguy cơ thiếu cá nguyên liệu.
Đê duy trì sản xuất, một so công ty chế biến thủy sản đã áp dụng hình thức hợp đồng với
ngirời nuôi theo phương thức doanh nghiệp cung cấp 1,6kg thức ãn chãn nuôi và 2.500 đồng
cho người nuôi đê đôi lây lkg cá nguyên liệu.
Trong thời gian tới xuất khâu cá tra sang thị trường Châu Âu và Trung Đông đang bị đe doạ
bởi những thông tin không tốt về cá tra, basa của VN, cùng với Luật Nông nghiệp 2008 của
Mỹ sẽ tiếp tục là những trở ngại đối với XK cá tra, basa của Việt Nam. Tuy nhiên, mặt hàng
này đã, đang và sè tiếp tục có lợi thế cạnh tranh và được nhiều thị trường mới đón nhận.
3.3.3. Phương pháp đánh giá phân tích 3.3.1.1. Xác định độ nhớt trong nguyên liệu
Nguyên tắc: nếu cho chất lỏng chảy qua các mao quản, chất lỏng có độ nhớt càng cao thì
chây càng chậm, vì vậy có thể dựa vào tính chất đó để đo độ nhớt cùa chủng. Các dung dịch
keo và dung dịch cao phân từ thường có độ nhớt cao. Độ nhớt cúa chúng phụ thuộc vào khối
lượng phân tử và nồng độ dung dịch. Độ nhớt tăng nếu hai yểu tố
này tăng.
3.3.1.2. Xác định liàm lượng ẩm Nguyên tắc: áp dụng phương pháp sấy khô đến sản phẩm
không đối. 3.3.1.3. Xác định hàm lượng tro Nguyên tẳc: tro hoámẫu bằng nhiệt. Sau đó xác
định hàm lượng tro bằng phương pháp khối lượng và xác định độ kiềm của tro băng phương
pháp chuẩn độ. 3.3.1.4. Xác định hàm lượng lipid tổng Nauvên tắc:• Dùng dung môi kị
nước trích li hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được cãt nhỏ.
Một số thành phần đã được hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm săc tố,
các chất m ùi..-tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp. Do có lẫn tạp chất, phần trích ly được
gọi là lipid tống hay dầu thô • Hàm lượng lipid tông có thê tính bàng cách càn trực tiêp dâu
sau khi chưng cât các loại dung môi hoặc tính gián tiếp từ khối lượng bà còn lại. Ưu điêm của
cách tính gián tiếp là đồng thời có thể trích ly nhiều mẫu trong cùng một trụ
chiết
3.3.1.5. Xác định hàm lượng nitơ và protein tống Nguyên tắc: Khi đốt nóng mau vật can
phân tích với H2SO4 đậm đặc thì các hợp chất hữu cơ sẽ bị õỵ hóa. Các nguyên to carbon và
hydro lần lượt tạo thành khí CO2 và H2O, còn nguyên tố nitơ được giải phóng ra dưới dạng
khí NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành muối (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Ke đên ,
đuối khí NH3 ra khỏi dung dịch băng NaOH đồng thời cất và thu NH3 băng một lượng dư
H2SO4 0.1N chuẩn.
Sau đó, tiến hành định phân lượng H2SO4 còn lại bàng dung dịch NaOH 0.1N chưần, qua đó
gián tiếp tính được lượng Nitơ có trong nguyên liệu phân tích ban đầu 3.3.1.6. Xác định tổng
lượng gián tiếp collagen Nguyên tắc:
Trong tông lượng amino acid có trong collagen, hydroxyproline chiếm khoảng 14%.
Loại amino acid này gần như được thấy trong collagen mà không trong bẩt kì một loại protein
nào khác của cơ thể, ngoại trừ một lượng nhỏ trong elastin. Do đó, có thè định lương collagen
thong qua định lương hydrxỵproline Cấu trúc của hydrxyproline có chứa vòng pyrrolidine, nó
có the bị oxy hóa đẻ hình thành pirrole. Vòng pirrole này có tác dụng với tác chât Ehrlich, 4(N,N- dimethylamino) bezaldehyde tạo thành hợp chất quinoid có màu (màu sắc phụ thuộc
vào nhóm thế và thay đôi từ màu cam đến màu hoa cà) thực hiện phương pháp so màu đê tính
hàm lượng hydroxyproline
- Xem thêm -
.DOCX 
9 
290 
66 
