Tài liệu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của lá cây gai (boehmeria nivea l. gaudich)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN THỊ QUỲNH HOA ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM XANTHINE OXIDASE IN VITRO CỦA LÁ CÂY GAI ( Boehmeria nivea L. Gaudich) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN THỊ QUỲNH HOA ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM XANTHINE OXIDASE IN VITRO CỦA LÁ CÂY GAI ( Boehmeria nivea L. Gaudich) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS BÙI THANH TÙNG Người hướng dẫn 2: ThS. NGUYỄN THỊ HUYỀN HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Được làm và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, tôi cảm thấy vô cùng biết ơn sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, bạn bè và người thân. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Thanh Tùng, ThS. Nguyễn Thị Huyền – hai thầy cô giáo đã luôn quan tâm, giúp đỡ, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Y Dược đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập trong suốt thời gian ngồi trên ghế nhà trường và cho phép tôi thực hiện khóa luận này. Đồng thời, tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Hóa dược – Kiểm nghiệm, Bào chế, Dược cổ truyền đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện khóa luận. ủng Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, hộ, động viên, góp ý để tôi hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Trần Thị Quỳnh Hoa DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AMP Adenosine monophosphate ATP Adenosine triphosphat B. nivea Boehmeria nivea (L.) Gaudich DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-Diphenyl-2 picrylhydrazyl FAD Dinucleotide adenine flavin GMP Guanine monophosphate HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography) LD50 Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose) OD Mật độ quang PNP Purine nucleoside phosphorylase XO Xanthine oxidase XOR Xanthin oxyoreductase TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Acid uric ................................................................................................. 3 Hình 1.2: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể ........................................... 4 Hình 1.3: Cấu trúc không gian xanthine oxidase ................................................... 8 Hình 1.4: Cơ chế hoạt động của xanthine oxidase ................................................. 9 Hình 1.5: Cây lá gai (Boehmeria nivea L. Gaudich) ........................................... 15 Hình 1.6: Cấu trúc một số hợp chất của B. Nivea ............................................... 17 Hình 2.1: Cây lá gai tại Mê Linh, Hà Nội ............................................................ 21 Hình 2.2: Cao toàn phần ethanol lá Gai ............................................................... 22 Hình 2.3: Quy trình chiết xuất dược liệu ............................................................. 23 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình thí nghiệm .................................................................. 29 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử ................ 32 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của Acid ascorbic………...33 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử…….....35 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của Allopurinol……......35 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các thuốc và hóa chất cần thiết……………………………………...23 Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các mẫu thử ................................................................................................................. 27 Bảng 3.1: Khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử .......................................... 31 Bảng 3.2: Bảng giá trị IC50 tác dụng chống oxy hóa của các mẫu thử .............. 343 Bảng 3.3: Tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử………………………..34 Bảng 3.4: Bảng giá trị IC50 tác dụng ức chế XO của các mẫu thử…………… ..36 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .................................................... DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ............................................................ DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1. Tăng acid uric máu .................................................................................... 3 1.1.1. Sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric .................................................. 3 1.1.2. Tăng acid uric máu................................................................................. 4 1.2. Enzym xanthine oxidase.......................................................................... 6 1.2.1. Vai trò enzym xanthine oxidase trong quá trình tổng hợp acid uric6 1.2.2. Cấu trúc, đặc điểm lý hóa ...................................................................... 7 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym xanthine oxidase . .....9 1.2.4. Allopurinol và ức chế enzym xanthine oxidase ................................... 10 1.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym xanthine oxidase in vitro .10 1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa ..................... 11 1.3.1. Khái quát .............................................................................................. 11 1.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro ..................... 13 1.4. Cây lá gai (Boehmeria nivea L. Gaudich) ............................................ 14 1.4.1. Tổng quan ............................................................................................ 14 1.4.2. Đặc điểm thực vật ................................................................................ 14 CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 21 2.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................. 21 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ........................................................................... 21 2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu .............................................................. 21 2.1.3. Thuốc, hóa chất .................................................................................... 23 2.1.4. Máy móc, thiết bị, dụng cụ .................................................................. 24 2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 24 2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 25 2.3.1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH ............................................................................... 25 2.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai. .................................................................................. 26 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................... 30 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ ................................................................................... 31 3.1. Kết quả chiết xuất dược liệu ..................................................................... 31 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH ..................................................................... 31 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của cao chiết phân đoạn lá Gai ...................................................................................... 33 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 37 4.1. Về kết quả chiết xuất dược liệu................................................................. 37 4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH ................................................................. 37 4.3. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai .................................................................... 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................... 41 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 41 ĐỀ XUẤT ............................................................................................................ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... ĐẶT VẤN ĐỀ Trong vài thập kỷ qua, tỷ lệ tăng acid uric máu đang gia tăng nhanh chóng trong dân số thế giới. Bằng chứng nổi bật cho thấy tăng acid uric máu phổ biến không chỉ ở các nước phát triển [55, 71] mà còn gia tăng ở các nước thu nhập thấp và trung bình với tần suất cao [24, 38], trong đó có Việt Nam. Một số nghiên cứu dịch tễ học chỉ ra rằng tăng acid uric máu có liên quan đến một số bệnh bao gồm đái tháo đường, rối loạn lipid máu, béo phì, tăng huyết áp, bệnh tim mạch và hội chứng chuyển hóa [25, 32, 70, 72]. Đặc biệt, tăng acid uric máu đã được biết từ rất lâu là yếu tố nguy cơ hàng đầu của bệnh gout [45, 66]. Ngoài ra, khi tăng acid uric máu sẽ gây ra tình trạng stress oxy hóa ở bệnh nhân gout [13]. Xanthine oxidase (XO) là một enzym quan trọng, xúc tác phản ứng chuyển hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric. Hoạt động của enzym XO là nguyên nhân dẫn tới sự tạo ra nhiều gốc tự do, góp phần gây tổn thương đến nhiều quá trình bệnh lý bao gồm viêm, xơ vữa động mạch, ung thư, lão hóa và bệnh gout [49, 50]. Do đó, ức chế hoạt động của XO dẫn đến giảm nồng độ acid uric và giảm sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS). Từ xa xưa con người đã khám phá được sức mạnh thiên nhiên, biết sử dụng nhiều loài thực vật nhằm mục đích chữa bệnh và được đúc kết trong các kinh nghiệm dân gian trong những bài thuốc y học cổ truyền dùng để điều trị các chứng bệnh, trong đó có thống phong (bệnh gout). Cây lá gai có tên khoa học là Boehmeria nivea (L.) Gaudich có chứa nhiều hợp chất như phenolic, flavonoid, vitamin, khoáng chất…[14, 21, 23, 61] xuất hiện trong các bài thuốc y học cổ truyền để điều trị các bệnh như lợi tiểu, cầm máu và biết đến với tác dụng chống viêm, bảo vệ gan. Tuy nhiên, hiện nay tại Việt Nam có rất ít nghiên cứu khoa học được công bố về tác dụng điều trị bệnh gout, khả năng chống oxy hóa cũng như ức chế enzym XO của lá cây Gai. Vì vậy, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Xanthine Oxidase in vitro của lá cây Gai (Boehmeria nivea L. Gaudich) với mục tiêu: 1 1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH. 2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai. 2 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1. Tăng acid uric máu 1.1.1. Sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric Acid uric là sản phẩm chuyển hóa cuối cùng từ nhóm purin ngoại sinh và chuyển hóa purin nội sinh [74]. Trong số các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến việc sản xuất acid uric, chế độ ăn uống đóng vai trò quan trọng. Thực tế này đã được các nhà điều tra châu Âu ghi nhận từ kinh nghiệm của họ trong hai cuộc chiến tranh thế giới và được chứng minh thông qua sự gia tăng của bệnh gout ở Nhật Bản kể từ Thế chiến thứ II (Lượng protein trên đầu người đã tăng gấp đôi trong thời kỳ hậu chiến ở nước này) [56]. Việc sản xuất acid uric nội sinh chủ yếu từ gan [42, 69, 74], ruột và các mô khác như cơ bắp, thận và nội mô mạch máu [69, 74]. Ở người bình thường, acid uric được bài tiết chủ yếu qua thận (chiếm 2/3 tổng lượng acid uric được tạo ra mỗi ngày) [69, 74]. Tuy nhiên, một tỷ lệ nhỏ hơn nhưng đáng kể, acid uric được bài tiết trong dịch tiêu hóa vào ruột. Ít hơn 1% của tổng lượng acid uric được bài tiết qua mồ hôi [56]. Acid uric là một hợp chất hữu cơ dị vòng có công thức C5H4N4O3 (7,9dihydro-1H-purine-2,6,8 (3H) -trione), trọng lượng phân tử 168 Dalton. Hình 1. 1: Acid uric Nhiều enzym có liên quan đến việc chuyển đổi hai purin acid nucleic là adenin và guanin thành acid uric như deaminase, nucleotidase (NT), purin nucleoside phosphorylase (PNP), xanthin oxidease (XO), hypoxanthine-guanin phosphoribosyl transferase (HGPRT) [33, 74] 3 Hình 1. 2: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [33]. 1.1.2. Tăng acid uric máu 1.1.2.1. Định nghĩa Tăng acid uric máu khi nồng độ acid uric vượt quá giới hạn tối đa của độ hòa tan của urat trong dung dịch có nồng độ natri như huyết tương, cụ thể là: Trên 7,0 mg/dl (tức trên 420 mol/l) đối với nam giới và trên 6,0 mg/dl (360 mol/l) đối với nữ giới [5]. 1.1.2.2. Dịch tễ học ▪ Tại Mỹ, tỷ lệ tăng acid uric máu (> 0,40 mmol/l hoặc 6,8 mg/dl) là 14,6% dân số (ước tính 32,5 triệu người), phổ biến hơn ở nam giới (24,7%) so với nữ giới (5,2%). Tăng acid uric máu ở người Mỹ gốc Mexico ít phổ biến hơn so với người da trắng và người Mỹ gốc Phi [55]. ▪ Tại Trung Quốc, tỷ lệ tăng acid uric máu chiếm 18,1% dân số, trong đó, 16,0% đối với nam giới và 19,4% đối với nữ giới. Tỷ lệ tăng acid uric máu 4 của người Hán thấp hơn một chút so với các nhóm dân tộc khác (18,0% so với 19,5%) [41]. ▪ Tại Nhật Bản, trong nghiên cứu Yamagata (2016) về “Nồng độ acid uric huyết thanh và tỷ lệ tử vong trong dân số Nhật Bản” đã chỉ ra rằng tỷ lệ tăng acid uric máu là 17,4% ở nam giới và 2,2% ở nữ giới [73]. ▪ Tại Việt Nam, nghiên cứu về mối liên hệ giữa tăng acid uric máu với bệnh tiểu đường type 2 trong dân số Việt Nam, nhóm tác giả đã chỉ ra rằng tăng acid uric máu cao hơn nhiều trong nhóm người bị rối loạn đường huyết lúc đói, nhóm rối loạn đường huyết lúc đói kết hợp với rối loạn dung nạp glucose, nhóm người tiểu đường so với nhóm dung nạp glucose bình thường. Nồng độ acid uric không có sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm dung nạp glucose bình thường và nhóm dung nạp glucose kém. Nam giới có tỷ lệ tăng acid uric máu cao hơn so với nữ giới trong nhóm dung nạp glucose bình thường, nhóm rối loạn đường huyết lúc đói và nhóm tiểu đường [68]. Như vậy, sự tăng acid uric có sự khác nhau giữa các quốc gia, tộc người, giữa người bình thường và những người có bệnh lý mắc kèm. Tuy nhiên, đa số tỷ lệ tăng acid uric ở nam giới cao hơn nữ giới. 1.1.2.3. Nguyên nhân tăng acid uric máu Nguyên nhân gây tăng acid uric máu là do tăng sản xuất acid uric, thận giảm bài tiết acid uric hoặc kết hợp cả hai nguyên nhân trên [42, 74]. Tăng tổng hợp acid uric (dưới 5%) bao gồm: khiếm khuyết enzym, hoạt động quá mức của phosphoribosilpyrophosphate synthetase, giảm hoạt động của hypoxanthine phosphoribosiltransferase, bệnh lưu trữ glycogen (loại I, III, V, VII), tình trạng bệnh dẫn đến sản xuất quá mức purine, rối loạn tủy, bệnh ác tính, tan máu, bệnh vẩy nến, tăng dị hóa hoặc giảm tổng hợp ATP, nghiện rượu, thiếu oxy mô, tập thể dục cơ bắp quá mức, liên kết với thuốc hoặc thói quen ăn uống, vitamin B12, fructose, tiêu thụ purine quá mức. 5 Giảm bài tiết acid uric ở thận (trên 95%) bao gồm: khiếm khuyết di truyền của chức năng ống thận (không xác định), tình trạng bệnh dẫn đến giảm bài tiết acid uric, suy thận, mất nước, nhiễm toan (thiếu oxy mô), bệnh cường cận giáp, suy giáp, hội chứng Bartter, sản giật, liên kết với thuốc hoặc thói quen ăn uống, thuốc lợi tiểu, ethanol, pyrazinamid, lạm dụng thuốc nhuận tràng, salicylat (liều thấp). Tăng tổng hợp và giảm đào thải acid uric bao gồm: nghiện rượu, thiếu men Glucose-6-phosphatase, thiếu men Fructose-1-phosphate-aldolase. 1.1.2.4. Hậu quả tăng acid uric máu ▪ Tăng acid uric máu và bệnh gout Khi nồng độ acid uric trong máu lớn hơn 7 mg/dl, vượt quá nồng độ hòa tan tối đa, urat kết tủa thành các vi tinh thể mono sodium urat. Sự lắng đọng của các hạt này ở các vị trí khác nhau gây ra các tổn thương khác nhau. Các vi tinh thể urat lắng đọng tại mô mềm, bao gân tạo nên hạt tophi. Sự khởi phát cơn gout cấp xảy xa khi các hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ; sự lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, màng hoạt dịch khớp, trong mô sụn và mô xương sẽ dẫn đến bệnh xương khớp mạn tính do gout, và cuối cùng, viêm thận kẽ (bệnh thận do gout) là do tinh thể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận [5]. ▪ Tăng acid uric máu và các bệnh khác liên quan Một số nghiên cứu dịch tễ học chỉ ra rằng tăng acid uric máu có liên quan đến một số bệnh bao gồm đái tháo đường, rối loạn lipid máu, béo phì, tăng huyết áp, bệnh tim mạch và hội chứng chuyển hóa [25, 32, 70, 72]. Như vậy, hạ acid uric máu là một mục tiêu điều trị trong bệnh gout và các bệnh lý khác liên quan đến tăng acid uric máu. 1.1.3. Vai trò enzym xanthine oxidase trong quá trình tổng hợp acid uric Năm 1902, Schardinger và các đồng nghiệp đã báo cáo về một chất chưa xác định có trong sữa tươi nguyên chất có thể làm mất màu xanh metylen khi bổ sung formaldehyd. Gần 20 năm sau, chất này cũng được tìm thấy trong sữa bò, 6 trong gan, thận, lá lách và phổi của chuột, có khả năng oxy hóa hypoxanthin thành xanthin và sau đó xanthin thành urate trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí. Những phát hiện này đã thúc đẩy rất nhiều sự quan tâm từ các nhà nghiên cứu enzym và sinh hóa, dẫn đến sự phân lập, tinh chế và nghiên cứu về xanthin oxyoreductase (XOR) [43]. Thực tế, enzym XO được tìm thấy trên nhiều động vật có vú [15, 47], chim, bò sát, vi khuẩn. Trong tất cả các động vật có vú được nghiên cứu, enzym XO có trong gan, ruột, thận, phổi, cơ tim, não, huyết tương và hồng cầu, và các mô khác. Trong đó, gan và ruột có hoạt động XOR cao nhất [19] . .Xanthine oxidase là một enzym có vai trò quan trọng trong quá trình tạo ra acid uric. Dưới tác dụng xúc tác của enzym XO, hypoxanthin được chuyển thành xanthin và xanthin được chuyển hóa thành acid uric. Ức chế XO sẽ làm giảm nồng độ acid uric, dẫn đến tác dụng chống tăng acid uric [67]. Ngày nay, việc kiểm soát nồng độ acid uric là một yếu tố quan trọng trong phòng ngừa và điều trị các bệnh liên quan đến tăng acid uric và gout [27]. 1.2. Enzym xanthine oxidase 1.2.1. Cấu trúc, đặc điểm lý hóa Xanthine oxidase là một protein có khối lượng khoảng 300 kDa, gồm 2 tiểu đơn vị [18, 30]. Mỗi tiểu đơn vị gồm 4 trung tâm oxy hóa khử : một phần phụ molybden (Mo-co), một FAD và hai Fe2S2 (trung tâm Fe/S). Phần phụ của molybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu cơ liên kết cộng hóa trị với 2 nguyên tử lưu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên tử oxy và 1 nguyên tử lưu huỳnh khác. 7 Hình 1. 3: Cấu trúc không gian xanthine oxidase FAD (màu đỏ), Fe2S2 (màu cam), phần phụ molypden (màu vàng) Cơ chế hoạt động: Enzym XO xúc tác quá trình hydroxyl hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric tại trung tâm Mo-co. Ở trạng thái oxy hóa, proton từ nhóm Mo-OH tấn công trung tâm ái nhân của cơ chất, hai electron được chuyển đến nguyên tử Mo (Mo VI đến Mo IV ) của Mo-co. Sự vận chuyển electron đến FAD thông qua hai trung tâm Fe/S được chuyển tiếp nhanh chóng và tạo ra MoV . Sau đó, 𝑀𝑜 𝑉𝐼 được tái sinh bởi hydroxyd từ dung môi khi kết thúc phản ứng [57]. 8 Hình 1. 4: Cơ chế hoạt động của xanthine oxidase [20] 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym xanthine oxidase Nồng độ cơ chất: Khi nồng độ cơ chất xanthin tăng thì tốc độ phản ứng tăng, lượng acid uric tạo ra càng nhiều. Tuy nhiên đến một mức nào đó, tốc độ phản ứng sẽ không tăng thêm nữa khi enzym đã bão hòa cơ chất [7]. Nồng độ enzym: Khi nồng độ enzym tăng thì tốc độ phản ứng tăng. Tuy nhiên, nồng độ enzym tăng đến một mức nhất định, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽ tác động vào trung tâm dị lập thể của enzym, phản ứng bão hòa và tốc độ phản ứng sẽ không tăng lên nữa [7]. Nhiệt độ: Hoạt động của enzym phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Thông thường, khi tăng 100 C thì tốc độ phản ứng tăng lên 2-3 lần [35]. Tuy nhiên, nhiệt độ quá cao enzym sẽ bị biến tính. Nhiệt độ cũng ảnh hưởng trong quá trình bảo quản enzym. XO được bảo quản ở nhiệt độ 2-8o C [54]. 9 pH: pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzym. Với XO, pH thích hợp từ 7,58,0 [16]. 1.2.3. Allopurinol và ức chế enzym xanthine oxidase Allopurinol (1,5-dihydro-4H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-one) ban đầu được Falco tổng hợp vào giữa những năm 50 của thế kỷ trước trong một nỗ lực để tạo ra các chất chống ung thư mới, nhưng nó đã được tìm thấy có hoạt tính ức chế xanthine oxidase, làm giảm cả nồng độ acid uric trong huyết thanh và nước tiểu. Năm 1963, Rundles và đồng nghiệp lần đầu tiên đã thử nghiệm lâm sàng thành công về việc sử dụng allopurinol trong điều trị bệnh gout. Thuốc đã được FDA chấp thuận vào năm 1966 [19]. Cả allopurinol và oxypurinol (chất chuyển hóa chính của nó) đều ức chế enzym xanthine oxidase, do đó làm giảm sinh tổng hợp acid uric dẫn đến giảm nồng độ acid uric máu, thúc đẩy sự thanh thải hypoxanthin và xanthin qua nước tiểu, vì vậy giảm hình thành sỏi thận và các cơn đau thận hơn [8, 19]. Allopurinol có ứng dụng lâm sàng trong điều trị bệnh gout và các trường hợp tăng acid uric thứ phát (do dùng thuốc chống ung thư, thuốc lợi tiểu thiazid…) [8]. Tác dụng không mong muốn khi dùng thuốc có thể gây kích ứng tiêu hóa, độc với gan và dị ứng da, có thể gặp cơn gout cấp ở giai đoạn đầu điều trị. Khắc phục bằng cách dùng kết hợp với colchicin hoặc các thuốc chống viêm khác [8]. 1.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym xanthine oxidase in vitro Các phương pháp xác định hoạt hoạt độ enzyme XO in vitro thường đo lượng các sản phẩm chuyển hóa hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành axit uric, cũng như sản xuất gốc superoxide, hydro peroxide hoặc NADH. Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric Phương pháp đo quang dựa trên lượng acid uric tạo thành từ quá trình oxy hóa xanthin dưới tác dụng xúc tác của XO theo phản ứng: 10 Xanthine oxidase Xanthin + H2O + O2 Acid uric + H2O2 Lượng acid uric được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 290 nm, lượng acid uric tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym [60]. Phương pháp này thường được dùng trong thử nghiệm in vitro do tính thuận tiện, nhạy đối với enzym tinh khiết. Phương pháp hóa phát quang phát hiện O2- gây ra bởi XO Luminol là chất phát quang hóa học và đặc biệt các chất phát quang có nguồn gốc lucigenin (LDCL) thường được sử dụng để phát hiện O2- in vitro sản xuất bởi hệ thống enzyme hoặc các tế bào nguyên vẹn [19]. Phương pháp xác định O2.- bằng thử nghiệm Cytochrom c Việc sản xuất O2.- có thể được phát hiện trong các tế bào nguyên vẹn nhờ dạng sắt có trong cytochrom c: Các tế bào được ủ với Fe3+-Cyt c và độ hấp thụ là đo ở 550 nm [19]. 1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa 1.3.1. Khái quát Chất chống oxy hóa là một chất có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do các chất khác gây ra. Trong cơ thể, chúng bảo vệ các thành phần tế bào quan trọng bằng cách trung hòa các gốc tự do (là sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa tế bào. Các gốc tự do được tạo ra khi oxy được chuyển hóa hoặc hình thành 11 trong cơ thể.) Các gốc tự do có electron chưa ghép cặp vỏ ngoài của phân tử. Đây là lý do, tại sao các gốc tự do có khả năng phản ứng cao và có thể phản ứng với protein, lipid, carbohydrate và DNA. Những gốc tự do này tấn công các phân tử ổn định gần nhất để “đánh cắp” electron để trở thành trạng thái bền vững. Khi phân tử bị tấn công mất điện tử, nó sẽ trở thành một gốc tự do mới, bắt đầu phản ứng dây chuyền, cuối cùng dẫn đến phá hủy tế bào. Các gốc tự do có thể là dẫn xuất oxy (ROS, các loại oxy phản ứng) hoặc có nguồn gốc nitơ (RNS, các loại nitơ phản ứng). Các phân tử có nguồn gốc oxy là O-2 (superoxide), HO (hydroxyl), HO2 (hydroperoxyl), ROO (peroxyl), RO (alkoxyl) là gốc tự do và H2O2. Các nitơ phản ứng chủ yếu là NO (oxit nitric), ONOO (peroxy nitrate), NO2 (nitơ dioxide) và N2O3 (dinitrogen trioxide). Trong một tế bào bình thường, chất chống oxy hóa và chất oxy hóa cân bằng. Tuy nhiên, sự cân bằng này có thể được thay đổi, khi các chất oxy hóa tăng hoặc khi mức độ chất chống oxy hóa bị giảm. Giai đoạn này được gọi là stress oxy hóa. Stress oxy hóa dẫn đến tổn thương các phân tử sinh học bao gồm axit nucleic, protein, axit béo không bão hòa đa (PUFA) và carbohydrate. Peroxid hóa lipid là sự suy giảm oxy hóa của lipid không bão hòa đa và nó liên quan đến ROS và các ion kim loại chuyển tiếp. Đây là một cơ chế phân tử của tổn thương tế bào dẫn đến một loạt các sản phẩm gây độc tế bào, hầu hết là các aldehyd, như malondialdehyd (MDA), 4 hydroxynonrnal (HNE), stress oxy hóa gây ra tổn thương tế bào nghiêm trọng dẫn đến nhiều loại bệnh ở người như bệnh Alzheimer, Parkinson, xơ vữa động mạch, ung thư, viêm khớp, suy giảm miễn dịch và rối loạn thoái hóa thần kinh,... Thiếu hụt chất chống oxy hóa tự nhiên cũng dẫn đến stress oxy hóa, biểu thị các chất chống oxy hóa tự nhiên có trong cơ thể người chết. Có 2 loại chất chống oxy hóa là chất chống oxy hóa enzym và không enzym. Trong chất chống oxy hóa enzym có chất chống oxy hóa sơ cấp và thứ cấp [46]. Chất chống oxy hóa sơ cấp là các chất chống oxy hóa phá vỡ chuỗi phản ứng với các gốc lipid và chuyển chúng thành các sản phẩm ổn định hơn. Chất chống oxy hóa của nhóm này chủ yếu là các phenolic, trong cấu trúc và bao gồm 12