Tài liệu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và gây độc tế bào ung thư của cây giổi ( michelia tonkinensis a. chev) thu hái tại hòa bình

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -------- NGÔ THỊ NGỌC THẢO MÃ SINH VIÊN: 1501462 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY GIỔI (Michelia tonkinensis A. Chev) THU HÁI TẠI HÒA BÌNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -------- NGÔ THỊ NGỌC THẢO MÃ SINH VIÊN: 1501462 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY GIỔI (Michelia tonkinensis A. Chev) THU HÁI TẠI HÒA BÌNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Chử Thị Thanh Huyền 2. TS. Nguyễn Thế Hùng Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược học cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội 2. Khoa Dược lí Sinh hóa - Viện Dược liệu HÀ NỘI – 2020 Lời cảm ơn Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận, em đã may mắn nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ của nhiều thầy cô, anh chị. Với tình cảm chân thành, cho phép em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả các cá nhân, tập thể đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu đề tài. Trước hết em xin gửi tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược học cổ truyền trường Đại học Dược Hà Nội và khoa Dược lí – sinh hóa Viện Dược liệu lời chúc sức khỏe và lời cảm ơn sâu sắc. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Chử Thị Thanh Huyền và TS. Nguyễn Thế Hùng đã tận tình hướng dẫn em trong thời gian thực hiện khóa luận. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể các thầy cô giáo trong trường, các cán bộ phòng ban, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội đã hết sức tạo điều kiện cho em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài. Tuy nhiên với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế, khóa luận này không thể tránh khỏi những thiếu sót, em kính mong nhận được những lời góp ý, nhận xét của các thầy cô để hoàn thiện hơn khóa luận cũng như làm bài học, hành trang cho sự nghiệp sau này. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020 Sinh viên Ngô Thị Ngọc Thảo MỤC LỤC Trang bìa chính Trang bìa phụ Lời cảm ơn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về chi Giổi Michelia Linnaeus 3 1.1.1. Phân bố của chi Giổi (Michelia L.) 3 1.1.2. Thành phần hóa học 3 1.1.3. Tác dụng sinh học 6 1.2. Nghiên cứu về cây Giổi 13 1.2.1. Phân loại và đặc điểm thực vật 13 1.2.2. Phân bố, sinh thái 14 1.2.3. Thành phần hóa học 15 1.2.4. Tác dụng sinh học 17 1.2.5. Công dụng 18 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 19 2.1.1. Nguyên vật liệu 19 2.1.2. Hóa chất, dung môi, dòng tế bào 19 2.1.3. Trang thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 19 2.2. Nội dung nghiên cứu 20 2.3. Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 20 2.3.2. Phương pháp tạo cao chiết tổng và cao phân đoạn của các mẫu lá và hạt cây Giổi Michelia tonkinensis A. Chev 20 2.3.3. Phương pháp thử tác dụng sinh học 21 2.3.4. Phương pháp xử lí dữ liệu 24 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 25 3.1. Tạo cao chiết tổng và cao phân đoạn của các mẫu lá và hạt cây Giổi Michelia tonkinensis A. Chev 25 3.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 26 3.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao chiết lá Giổi 26 3.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao chiết hạt Giổi 32 3.3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên cơ sở đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH 36 3.3.1. Kết quả hoạt tính chống oxy hóa trên cơ sở đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH của cao chiết lá Giổi 37 3.3.2. Kết quả hoạt tính chống oxy hóa trên cơ sở đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH của cao chiết hạt Giổi 39 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 42 4.1. Về hoạt tính gây độc tế bào ung thư 42 4.2. Về hoạt tính chống oxy hóa 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A549 B16F10 DCM DMEM Human lung carcinoma (Ung thư phổi ở người) Mouse skin melanoma (Ung thư da ở chuột) Dichloromethan Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (Môi trường cơ bản dùng cho nhiều dòng tế bào khác nhau) DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FBS HCT116 IC50 Fetal bovine serum (Huyết tương thai bò) Human colon carcinoma (Ung thư đại trực tràng người) Half-maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%) MCF7 Human breast carcinoma (Ung thư vú ở người) MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide NXB Nhà Xuất Bản pp, tr Trang (page) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số thành phần chính của tinh dầu lá Giổi Bảng 3.1 Ảnh hưởng của các phân đoạn cao chiết lá Giổi lên khả năng sống còn của tế bào ung thư Bảng 3.2 37 Ảnh hưởng của các phân đoạn cao chiết hạt Giổi lên khả năng dọn gốc tự do DPPH Bảng 3.8 37 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết lá Giổi trên khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH Bảng 3.7 34 Ảnh hưởng của các phân đoạn cao chiết lá Giổi lên khả năng dọn gốc tự do DPPH Bảng 3.6 32 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết hạt Giổi trên khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư Bảng 3.5 29 Ảnh hưởng của các phân đoạn cao chiết hạt Giổi lên khả năng sống còn của tế bào ung thư Bảng 3.4 27 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết lá Giổi trên khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư Bảng 3.3 17 39 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết hạt Giổi trên khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ mẫu hạt Giổi Sơ đồ 3.2 25 Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ mẫu lá Giổi Hình 3.3 22 26 Đường cong sigmoid biểu diễn mối tương quan giữa log (nồng độ) của các phân đoạn cao chiết lá Giổi trên khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư Hình 3.4 31 Đường cong sigmoid biểu diễn mối tương quan giữa log (nồng độ) của các phân đoạn cao chiết hạt Giổi trên khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư Hình 3.5 36 Đường cong sigmoid biểu diễn mối tương quan giữa log (nồng độ) của các phân đoạn cao chiết lá Giổi trên khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH Hình 3.6 38 Đường cong sigmoid biểu diễn mối tương quan giữa log (nồng độ) của các phân đoạn cao chiết hạt Giổi trên khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đã có lịch sử sử dụng lâu đời trong việc phòng, chữa trị nhiều loại bệnh và hứa hẹn rất nhiều tiềm năng trong phát triển các thuốc mới. Sự phát triển của xã hội phát triển hiện đại dẫn tới sự phát sinh của nhiều yếu tố gây bệnh mới như môi trường ô nhiễm, chất phụ gia trong thực phẩm, các chất có hại trong mỹ phẩm, thuốc lá, rượu bia, thức ăn nhanh hay căng thẳng thần kinh (stress). Tất cả những yếu tố này đều là những tác nhân gây ra gốc tự do - được xem là “sát thủ giấu mặt” gây ra quá trình lão hóa và phần lớn các bệnh tật nguy hiểm như trầm cảm, tăng huyết áp, ung thư, đái tháo đường,... Trong đó ung thư là nguyên nhân tử vong thứ 2 trên toàn thế giới, chiếm 1/6 các ca tử vong - theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 2018. Các thuốc tổng hợp hiện được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng trong điều trị các bệnh lý liên quan đến quá trình oxy hóa và ung thư, nhưng gặp phải hạn chế lớn nhất là tác dụng không mong muốn. Vì vậy, việc tìm kiếm nguồn thuốc thay thế với hiệu quả tương tự hoặc vượt trội đồng thời ít gây tác dụng phụ nghiêm trọng là hướng nghiên cứu cần được quan tâm phát triển. Tài nguyên thực vật ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng. Chi Giổi (Michelia L.) là một chi thực vật thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae), trong đó nhiều loài đã được sử dụng trong dân gian với tác dụng điều trị ung thư, như M. champaca Linn được người dân Ấn Độ sử dụng để điều trị khối u vùng bụng, M. hypoleuca và M. officinalis Rehd & Wilson điều trị loét do ung thư và ung thư máu tại Trung Quốc [39]. Nhiều nhà khoa học đã thực hiện nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư và chống oxy hóa sau khi đã phân tích thành phần hóa học của các loài thuộc chi Michelia và nhận thấy tiềm năng ở chúng [21], [25], [26], [34], [48], [50]. Giổi là một cây thuộc chi Michelia, có tên khoa học là Michelia tonkinensis, đã được sử dụng trong dân gian với các tác dụng làm thuốc hạ sốt, chữa đau bụng, ăn uống không tiêu hoặc ngâm rượu để xoa bóp khi đau nhức, tê thấp. Ngoài ra hạt Giổi có chứa tinh dầu thơm nên từ lâu đã được người dân ở 1 các tỉnh miền núi phía Bắc sử dụng làm gia vị. Trong những năm gần đây, cây Giổi đã được trồng nhiều ở một số địa phương để làm gia vị và mang lại giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lí của cây Giổi còn rất hạn chế. Hiện nay mới chỉ có 1 vài nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Giổi như nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, tác dụng chống viêm [2], [5], [6], [15]. Do đó việc tiến hành thêm những nghiên cứu đầy đủ hơn về tác dụng sinh học của loài Giổi sẽ làm tăng giá trị sử dụng của loài này. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và gây độc tế bào ung thư của cây Giổi (Michelia tonkinensis A. Chev) thu hái tại Hòa Bình” với các mục tiêu cụ thể sau: - Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư của lá và hạt Giổi - Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của lá và hạt Giổi 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Giổi Michelia Linnaeus 1.1.1. Phân bố của chi Giổi (Michelia L.) Trên thế giới theo thống kê sơ bộ, đã phát hiện được 80 loài thuộc chi Giổi (Michelia L.) phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á. Theo Thực vật chí Trung Quốc, ở Trung Quốc có khoảng 37-39 loài [28]. Ở Việt Nam chi này có số lượng loài lên tới 22 loài phân bố rộng khắp đất nước như: Giổi ngọt (M. tonkinensis A.Chev.), Giổi xanh (M. mediocris), Giổi lông nâu (M. fulva Chang et B.L. Chen), M. coriacea (Hung T. Chang & B.L.Chen) Figlar., M. martinii (H. Léveillé) Finet & Gagnepain ex H. Léveillé., Giổi bà (M. balansae (DC.) Dandy), Giổi nhung (M. foveolata Merr. ex Dandy), M. xianianhei sp. Nov., Giổi xanh quả to (M. citrata (Noot. & Chalermglin) Q. N. Vu & N. H. Xia), Giổi Sapa (M. velutina Candolle),... [3], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Công dụng được biết đến chủ yếu là dùng trong xây dựng và đóng đồ mộc, làm gia vị; một số công dụng khác như làm thuốc chữa bệnh, ướp chè,... được ghi chép lại trong một số tài liệu [1], [4]. Phân bố và công dụng một số loài thuộc chi Michelia. L ở Việt Nam được thể hiện ở Phụ lục 2. 1.1.2. Thành phần hóa học Từ những bộ phận khác nhau của các loài thuộc chi Michelia L., các nhà khoa học đã phân lập được rất nhiều nhóm hợp chất, có cả các hợp chất mới lần đầu tiên được công bố, bao gồm các nhóm hợp chất chính như steroid, terpenoid, alkaloid, phenol, ester, aporphine, benzenoid, flavonoid,… [39]. 1.1.2.1. Thành phần terpenoid Từ những năm 78 của thế kỉ trước, 2 hợp chất chính có cấu trúc khung sesquiterpen là michelenolide (1) và micheliolide (2) chứa vòng lactone cùng hai hợp chất sesquiterpen lactone mới là compressanolide (3) và dihydroreynosin (4) đã được phân lập từ loài M. compressa trong nghiên cứu của Ogura Masaru và cộng sự [50]. Từ loài Giổi móc (M. floribunda Finet & Gagnep), các sesquiterpen lactone cũng đã được phân lập và xác định cấu trúc 5 hợp chất (5– 3 10) là parthenolide (5), dihydroparthenolide (6), santamarine (7), costunolide (8), dihydrotamaulipin A β-D-glucoside (9) và dihydroreynosin β-D-glucoside (10) [49]. Tiếp đến hợp chất sesquiterpene có tên sphaelactone A (11) đã được công bố từ loài M. sphaerantha [42]. Khoảng 30 monoterpene và 26 sesquiterpen đã được tìm thấy có trong tinh dầu của loài Giổi nhung (M. foveolata). Trong đó, terpinen-4-ol (12) cũng được xác định là thành phần terpenoid chính có trong loài thực vật này [30]. Linalool (13) – được biết đến với nhiều tác dụng sinh học như chống ung thư, chống sốt rét, chống viêm kháng khuẩn, đã được phân lập từ nhiều bộ phận khác nhau của loài Bạch ngọc lan (M. alba Linn) như hoa, lá và cành sử dụng dung môi chiết là ethanol trong điều kiện siêu âm [37], [39]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc là Ming Jen Cheng và các cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc hai monoterpene ester mới từ lá của loài M. compressa (Maxim.) Sargent var. formosana Kanehira là pressafonin A (14) và pressafonin B (15) [27]. Cấu trúc hóa học của một số terpenoid phân lập được từ chi Michelia L. được thể hiện ở Phụ lục 3. 1.1.2.2. Thành phần alkaloid Hai hoạt chất bisbenzylisoquinoline alkaloid là magnoline (16) và magnolamine (17) đã được tìm thấy trong lá của loài Hương tiêu (M. figo Sprense) [51]. Isoquinoline alkaloid là liriodenine (18) được phân lập từ loài Giổi móc [M. floribunda (Finet & Gagnep)] [49]. Tiếp sau đó, sáu aporphine khác (19–25) bao gồm (–)-anonaine (19), (–)-asimilobine (20), (–)-nuciferine (21), (–)-anolobine (22), (–)-romerine (23), (–)-N-acetylanonaine (24) và một oxoaporphine là liriodenine (25) đã được xác định từ cành của loài Hoàng ngọc lan (M. champaca L.), bên cạnh các alkaloid được công bố trước đó là ushinsunine (26) và magnoflorine (27) [59]. Nhóm nghiên cứu của Wen-Li Lo đã tìm được hai hợp chất aristolactam và dioxoaphorphine mới từ lá của loài M. compressa var. lanyuensis và được đặt tên là pressalanine A (28) và pressalanine B (29) [45]. (–)-N-formylanonaine (30) đã được phân lập từ loài Bạch ngọc lan (M. alba) và thể hiện hoạt tính sinh 4 học rất đáng quan tâm [55]. Cấu trúc hóa học của một số alkaloid phân lập được từ chi Michelia L. được thể hiện ở Phụ lục 3. 1.1.2.3. Thành phần steroid Các steroid như stigmasterol (31), β-sitosterol (32) đã được phân lập từ thân loài M. alba Linn [39]. β-sitosterol cũng được tìm thấy ở loài M. sphaerantha [43]. Trong khi đó stigmasterol cũng được tìm thấy ở loài M. champaca cùng với hợp chất 3β-16α-dihydroxy-5-cholestene-21-al (33) [39]. Từ thân của loài M. compressa, các nhà nghiên cứu đã phân lập được 6 hợp chất, đó là stigmasterol, β-sitosterol, hỗn hợp 3β-hydroxylstigmast-5-en-7-on (34) và 3βhydroxystigmast-5,22-dien-7-on (35), hỗn hợp 6β-hydroxystigmast-4-en-3-on (36) và 6β-hydroxystigmast-4,22-dien-3-on (37) [45]. Yu Yi Chan và cộng sự đã tinh chế từ dịch chiết chloroform của gỗ lõi loài M. compressa var. formosana và thu được cyathisterol (38), 6α-hydroxy-βsitostenon , β-sitosteron, β-stigmastenon [22]. Cấu trúc hóa học của một số steroid phân lập được từ chi Michelia L. được thể hiện ở Phụ lục 3. 1.1.2.4. Các thành phần hóa học khác Một số dẫn xuất của benzen như 4-hydroxy-benzaldehyde (39), panisaldehyde (40), veratraldehyde (41), 3-4-5-trimethoxy benzoic acid (42) và 34-dimethoxy benzoic acid (43) được phân lập từ loài M. alba Linn [47]. Hợp chất chính được chiết xuất từ cánh hoa loài M. figo là isobutyl acetate (44) – 1 ester có mùi chuối [52]. Methyl linoleate (45) và methyl anthranilate (46) là những ester được tìm thấy từ loài M. champaca Linn [39]. Một coumarin scopoletin (47), một flavonoid: quercetin (48), năm dẫn xuất của benzen vanillin (49), vanillic acid (50), benzaldehyde 4-O-β-D-glucopyranoside (51), syringaresinol (52) và syringic acid (53), một quinol 4-acetonyl-3,5-dimethoxyp-quinol (54) và amide N-trans-feruloytyramine (55), N-cis-feruloytyramine (56) cũng đã được tìm thấy từ cành của loài M. champaca [59]. Cấu trúc hóa học của một số thành phần hóa học khác phân lập được từ 5 chi Michelia được thể hiện ở Phụ lục 3. 1.1.3. Tác dụng sinh học 1.1.3.1. Tác dụng chống ung thư Từ những năm 1978, Ogura, M., Cordell, G. A., & Farnsworth, N. R. đã thực hiện một nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài thuộc chi Michelia. Cụ thể là nhóm nghiên cứu đã lấy dịch chiết phân đoạn chloroform từ rễ của loài M. compressa Maxim. và tiến hành thử tác dụng trên trên tế bào 9KB. Kết quả cho thấy một số sesquiterpen lactone có mảnh cấu trúc α, β-không no ở vòng γ-lactone bao gồm michelenolide, micheliolide, parthenolide, costunolide, santamarine và liriodenine thể hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư biểu mô vòm họng 9KB với giá trị ED 50 là 1,0; 2,5; 0,45; 0,69; 1,1 và 3,8 μg/mL [50]. 30 năm sau, một nhóm nhà nghiên cứu Đài Loan công bố nghiên cứu: Dịch chiết methanol từ rễ loài M. compressa Maxim thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư bao gồm tế bào ung thư vú người MCF-7, tế bào ung thư phổi người NCI-H460 và tế bào ung thư thần kinh trung ương SF-268 thông qua giá trị IC50. Kết luận được đưa ra là khi thử với nồng độ mẫu thử 50 µg/mL, santamarin, parthenolide, T-cadinol, (-)romucosine không có tác dụng gây độc; costonulide và liriodenine có tác dụng gây độc yếu đối với 3 dòng tế bào trên. Giá trị IC50 của costonulide và lirodenine trên MCF-7, NCI-H460, SF-268 lần lượt là (5,26 µg/mL; 6,95 µg/mL và 5,31µg/mL) và (2,75 µg/mL; 3,21 µg/mL và 3,22 µg/mL) [48]. Dựa trên các nghiên cứu trước đó đã xác định các hợp chất như germacranolide, sesquiterpen lactone, alkaloid từ các bộ phận của một số loài thuộc chi Michelia. L và nhận thấy khả năng gây độc tế bào của chúng, năm 1979, Cassady J.M và các cộng sự đã công bố nghiên cứu: Phân đoạn chiết chloroform từ quả của loài M. doltsopa cũng đã thể hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư biểu mô vòm họng 9KB của người và được tiếp tục nghiên cứu về thành phần hóa học. Hợp chất germacranolide có tên gọi dehydrolanuginolide, được phân lập từ phân đoạn này, đã thể hiện tác dụng gây độc trên tế bào 9KB của người với giá trị ED50 là 1,8 μg/mL [21]. 6 Năm 2005, Hsieh. T. J. cùng cộng sự đã nghiên cứu riêng về hợp chất liriodenine sau khi nhận thấy những tiềm năng của nó trong các nghiên cứu về tác dụng chống ung thư. Nghiên cứu thực hiện với phân đoạn chiết chloroform từ lá của loài M. compressa, từ phân đoạn này phân lập được được liriodenine, tiến hành thử trên 2 dòng tế bào ung thư gan Hep G2 và SK-Hep-1 với liều liriodenine là 0, 5, 10, 25 µM để đánh giá khả năng ức chế chu kì tế bào, kết quả được phân tích bằng kĩ thuật dòng chảy tế bào cho thấy liriodenine làm giảm pha S, tăng pha G1 so với các tế bào không dùng liriodenine, đặc biệt ở nồng độ 25 µM, % pha S ở tế bào Hep G2 và SK-Hep-1 lần lượt là 13.8 % và 14 % so với các tế bào không dùng liriodenine là 40,3 % và 38,0 % [34]. (-)-Anonaine - alkaloid chính của loài M. alba, qua một số nghiên cứu đã thể hiện tác dụng chống ung thư. Một nghiên cứu năm 2008 đã thực hiện với lá của loài M. alba để đánh giá khả năng sống sót của tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) so với các tế bào bình thường là tế bào thận canine Madin – Darby (Madin – Darby canine kidney, MDCK) và tế bào Vero bằng thử nghiệm MTT. Phân đoạn chiết chloroform đã được lấy để phân lập được (-)-anonaine tinh khiết, sau đó thử với liều 100 µM thu được kết quả là khả năng sống sót của tế bào HeLa khi điều trị với (-)-anonaine giảm còn 23±1 %, trong khi đó khả năng sống sót ở tế bào MDCK và tế bào Vero có dùng (-)-anonaine là 75±3 % và 95±4 %. Điều này chứng tỏ (-)-anonaine thể hiện tác dụng ức chế chọn lọc trên dòng tế bào ung thư [26]. Ngoài ra, một nghiên cứu khác năm 2011 đã lấy (-)anonaine tinh chế từ phân đoạn chiết chloroform của thân loài M. alba để điều trị trên tế bào ung thư phổi người H1299 ở các mức liều 10, 50, 100, 200 µM bằng phương pháp MTT nhằm đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của tế bào. Kết quả là khả năng sống sót của tế bào giảm từ 87±6 % (10 μM) đến 47±9 % (200 μM) cho thấy (-)-anonaine có tác dụng ức chế mạnh ở nồng độ micro trên tế bào H1299 [25]. Cũng vào năm 2011, một nghiên cứu ở Trung Quốc đã thử nghiệm tác dụng chống ung thư của 5 hợp chất bao gồm liriodenine, vanillin, (-) roemerine, (-)-N-acetylanonaine, N-transferuloyltyramine có trong dịch chiết methanol phân 7 lập từ cành cây M. champaca L. Bằng cách đánh giá hiệu quả ức chế sự phát triển của tế bào ung thư biểu mô phổi người A549 và tế bào ung thư vú người MDA-MB-231, kết quả thu được cho thấy ở liều thử là 20 µM liriodenine trong 48h, hiệu quả ức chế tốt nhất trên cả 2 dòng tế bào A549 và MDA-MB-21 lần lượt là 54,4 % và 51.7 % [59]. Vào năm 2014, Yu-Yi Chan và cộng sự đã công bố nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của hai hợp chất liriodenine và oliveroline. Họ đã lấy phân đoạn chloroform từ dịch chiết thân gỗ loài M. compressa và tiến hành thử trên 6 dòng tế bào ung thư gồm tế bào ung thư biểu mô vòm họng của người (NPC-TW01), ung thư phổi (NCI-H226 và A549), tế bào T (Jurkat), ung thư thận (A498) và tế bào khối u xơ (HT1080) bằng phương pháp MTT. Kết quả cho thấy, liriodenine và oliveroline có tác dụng ức chế các dòng tế bào ung thư trên với giá trị IC 50 từ 15,7 đến 3,68 μM. Trong số các dòng tế bào thử nghiệm này, hai hợp chất trên đã thể hiện tác dụng ức chế mạnh nhất trên dòng tế bào ung thư thận A498 với giá trị IC50 lần lượt là 4,52 và 3,68 μM. Nghiên cứu khẳng định rằng gỗ lõi của M. compressa var. formosana và các chất phân lập của nó có thể được xem như ứng viên tiềm năng trong quá trình phát triển các thuốc chống ung thư mới [22]. 1.1.3.2. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Một nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của loài M. champaca được công bố vào năm 2002 bởi Khan M.R và cộng sự. Liriodenine là hoạt chất được phân lập từ vỏ rễ, tiến hành đem thử tác dụng kháng khuẩn của liriodenine với liều thử 10 µg bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Kết quả cho thấy tác dụng kháng khuẩn phổ rộng trên nhiều loại vi khuẩn, đặc biệt là liriodenine cho phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng kháng khuẩn tốt, đôi khi còn tốt hơn chất đối chứng là chloramphenicol, có thể kể đến như đối với vi khuẩn M. roseus, vi khuẩn Klebsiella pneumonia, vi khuẩn Salmonella typhi với đường kính vùng tác dụng ức chế là 16, 18, 16 mm… [38]. Năm 2006, các nhà nghiên cứu Pháp và Việt Nam đã thực hiện nghiên cứu trên loài M. foveolata Mer ex. thu hái tại Phú Thọ, Việt Nam. Kết quả thu được cho thấy: Sabinen (32,4 %) và terpinen-4-ol (13,7 %), là thành phần chính 8 có trong tinh dầu chiết xuất từ cành, lá và hoa của loài Giổi nhung (M. foveolata Mer ex.), thể hiện tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn với phổ tác dụng rộng. Thử nghiệm được tiến hành với mẫu thử 0.1 mL (108 tế bào/mL) bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Trong số đó, hiệu quả kháng khuẩn đối với các loại vi khuẩn Salmonella enterica, Staphylococus epidermidis, S. aureus và Bacillus cereus là tốt nhất với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) lần lượt là < 2 μl/mL, 3 μl/mL, 3 μl/mL và 4 μl/mL [30]. Bằng phương pháp đếm đĩa và giấy lọc (Plate Counts and Filter Papers method), một nghiên cứu khác của các nhà khoa học Trung Quốc đã chỉ ra hiệu quả kháng khuẩn của tinh dầu có chứa 14 hydrocacbon mạch dài và 16 terpenoid từ hoa của loài Bạch ngọc lan (M. figo Spreng) đã thể hiện trên vi khuẩn Bacillus sabtills, Escherichia coli và Mucor racemosus với giá trị ức chế lần lượt là 70,36; 60,24 và 65,52 % [58]. Năm 2015, Dalvi Sanjay Marotrao đã nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu và dịch chiết n-hexan từ hoa của loài Hoàng ngọc lan (M. champaca) bằng phương pháp khuếch tán Durham và phương pháp đĩa mẫn cảm (Susceptibility Disc method), sử dụng mẫu thử 0.1 mL tinh dầu và lượng tương tự cho dịch chiết n-hexan. Kết quả chỉ ra tác dụng ức chế vi khuẩn Gram dương, tuy nhiên, lại không có tác dụng trên vi khuẩn Gram âm. Tinh dầu thể hiện tác dụng kháng mạnh nhất đối với dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus với đường kính của vùng tác dụng ức chế là 11mm, và tác dụng yếu hơn với dòng vi khuẩn S. epidermidis với đường kính vòng vô khuẩn là 9 mm [48]. Năm 2011, Wu C. C và cộng sự đã chiết xuất gỗ lõi loài M. formosana bằng ethanol để thử tác dụng kháng nấm. Kết quả được công bố cho thấy phân đoạn n-hexan có chứa hoạt chất liriodenine có khả năng chống nấm mạnh nhất, cho giá trị IC50 với Lenzites betulina và Trametes versicolor lần lượt là 0,76 và 3,5 µg/mL; còn với Laetiporus sulphureus, Gloeophyllum trabeum và Fomitopsis pinicola, giá trị IC50 đều nhỏ hơn 2 µg/mL [57]. Tác dụng kháng nấm của các hợp chất phân lập được từ dịch chiết ethylacetate của lá, thân và rễ loài M. champaca đã được công bố bởi nhóm 9 nghiên cứu của Vanessa Mara Chapla vào năm 2014. Các hợp chất được đánh giá tác dụng kháng nấm với liều100 µg, riêng 4 hợp chất là 2-phenylethyl 1Hindol-3-yl-acetate , 2(4-hydroxyphenyl) acetic acid, 4-hydroxybenzamide, 2(2hydroxyphenyl) acetic acid được thử với mức liều từ 1-100 µg. Kết quả cho thấy, hợp chất mới 2-phenylethyl 1H-indol-3-yl-acetate cho tác dụng tốt, kháng lại Cladosporium cladosporioides và C. sphaerospermum ở nồng độ 5 μg, tương đương với tác dụng kháng nấm của chất đối chứng nystatin; hợp chất 2(4hydroxyphenyl) acetic acid cũng thể hiện tác dụng kháng nấm cao đối với dòng C. cladosporioides và trung bình đối với C. sphaerospermum; các hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính kháng nấm trung bình ở mức liều 25 µg [2]. 1.1.3.3. Tác dụng chống sốt rét Năm 2006, Ampai Phrutivorapongkul và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống sốt rét của nhóm hoạt chất bisbenzylisoquinoline alkaloids từ lá của loài Hương tiêu M. figo bằng thử nghiêm MTT. Kết quả cho thấy dịch chiết nước của lá loài M. figo thể hiện tác dụng chống sốt rét trên cả hai chủng chống lại chloroquine (Kl) và nhạy cảm với chloroquine (FCR3) của Plasmodium falciparum. Trên cơ sở kết quả hoạt tính của dịch chiết này, hai hợp chất bisbenzylisoquinoline alkaloid là magnoline và magnolamine đã được phân lập và xác định cấu trúc từ phân đoạn chứa thành phần alkaloid tổng. Tiến hành thử liều 0,1 µL cho thấy hợp chất magnolamine đã thể hiện tác dụng chống sốt rét mạnh với giá trị nồng độ ức chế IC50 đối với K1 và FCR3 của P. falciparum lần lượt là 1,28 µM và nhỏ hơn 0,16 μM; magnoline ức chế cả P. falciparum K1 và FCR3 với giá trị IC50 lần lượt là 1,51 và nhỏ hơn 0,16 μM (so sánh với chất đối chứng cloroquin có IC50 = 0,51 μM cho K1 và 0,50 μM cho FCR3; artemisinine với IC50 là 0,04 μM cho K1 và 0,015 μM cho FCR3) [51]. Năm 2013, một nhóm các nhà nghiên cứu Indonesia đã chiết xuất vỏ thân của loài M. champaca để đánh giá tác dụng chống sốt rét trên chủng Plasmodium falciparum 3D7. Cụ thể các phân đoạn n-hexan, chloroform, methanol được đem thử tác dụng ở các mức liều 0,01; 0,1; 1; 10, 100 µg/mL theo phương pháp của Buhmulja và cộng sự (1996). Kết quả thu được IC 50 của 10 dịch chiết n-hexan, chloroform và methanol lần lượt là 0,36; 0,24 và 1 µg/mL. Như vậy với giá trị IC50 nhỏ nhất so với các dịch chiết còn lại, dịch chiết chloroform cho thấy tác dụng chống sốt rét mạnh nhất [18]. 1.1.3.4. Tác dụng chống oxy hóa Năm 2008, Wang H. M và cộng sự đã công bố về Michephyll A – một hợp chất mới được phân lập từ dịch chiết chloroform lá của loài M. alba, thể hiện khả năng chống oxy hóa. Để thử tác dụng này, nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp bắt gốc tự do ABTS với nồng độ mẫu thử là 100 µM so với chất đối chứng là vitamin C. Kết quả % ức chế là 40.1 % [54]. Tiếp tục vào năm 2010, (-)-N-F-formylanonaine được biết đến về khả năng chống oxy hóa cũng qua nghiên cứu của Wang H. M và cộng sự. Nghiên cứu tiến hành trên dịch chiết ethanol lá của loài M. alba và đánh giá tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH. Kết quả cho thấy (-)-NF-formylanonaine thể hiện hoạt tính chống oxy hóa trung bình đến cao khi so sánh giá trị IC50 là 121,4 µM so với 52,1 µM của chất đối chứng là vitamin C [55]. Năm 2017, một nghiên cứu ở Ấn Độ đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa của tinh dầu phân lập được từ M. champaca thông qua tác dụng bắt giữ gốc peroxide theo phương pháp Ruch và công sự năm 1989. Tinh dầu sẽ được thử ở các nồng độ 25, 50, 75, 100 và 200 mg/mL. Kết quả thử cho thấy tác dụng chống oxy hóa tăng dần theo liều thử và tại nồng độ 200 mg/mL, phần trăm (%) bắt giữ peroxide là 63,7 % so với chất đối chứng vitamin C là hơn 70 % [20]. 1.1.3.5. Một số tác dụng khác - Tác dụng kháng viêm Hai hợp chất roemerine và cyathisterol phân lập từ phân đoạn chloroform của dịch chiết lá loài M. compressa var. formosana thể hiện tác dụng kháng viêm với liều thử là 125, 250, 500, 1000, 2000 ng/mL, thông qua ức chế sự sản sinh NO trên tế bào đa bào RAW264.7, bị gây viêm bởi LPS, với giá trị IC 50 lần lượt là 8,5 ± 0,3 và 9,6 ± 0,5 µg/mL [22]. 11 Năm 2011, các nhà nghiên cứu Ấn Độ đã công bố nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm của lá loài M. champaca trên mô hình gây viêm bởi carrageenan trên chuột. Khi sử dụng với liều 200 mg/kg, phân đoạn ethanol thể hiện tác dụng chống viêm mạnh nhất với mức độ giảm viêm sau 3h trên chuột là 68,49 % so với nhóm chứng [32]. - Tác dụng trên da Tác dụng trên da của dịch chiết và các hợp chất phân lập được từ một số loài thuộc chi Michelia đã được nghiên cứu và công bố trên thế giới. Hiệu quả làm trắng của các chất phân lập từ rễ loài M. compressa đã được đánh giá thông qua sự ức chế enzym tyrosinase, mà thể hiện là hàm lượng melanin trong tế bào B16F10. Ở nồng độ 5 μM, liriodenine và β-sitosterol (có trong phân đoạn dichloromethan) thể hiện tác dụng mạnh với phần trăm ức chế enzym tyrosinase trong tế bào B16F10 lần lượt là 14,52 ± 3,58 %, 25,48 ± 6,30 % và hàm lượng melanin trong tế bào B16F10 cũng giảm lần lượt là 19,03  4,55 % và 35,86  5,43 %. So sánh với đối chứng là Kojic acid ở nồng độ 10 μM cho phần trăm ức chế tyrosinase là 25,38  1,40 %, thành phần melanin giảm 20,00  2,12 %, hai hợp chất này cho thấy tiềm năng trong việc sử dụng làm trắng da mà không gây độc và an toàn với da [28]. Ngoài ra (-)-N-formylanonaine - một trong những hoạt chất có trong dịch chiết ethanol của lá M. alba, khi được thử nghiệm với các liều 10, 50, 100, 200 µM đã thể hiện tác dụng ức chế enzym tyrosinase từ nấm với nồng độ ức chế IC50 là 74,3 μM, so sánh với giá trị IC50 là 69,4 μM của chất đối chứng Kojic acid - một hoạt chất phổ biến có tác dụng ức chế tyrosinase trong công nghiệp mỹ phẩm. Kiểm tra hiệu quả của hợp chất này trong việc giảm tác dụng của tyrosinase và thành phần melanin trong melanocytes của người, cũng cho kết quả tương tự với hoạt tính của (-)-N-formylanonaine mạnh hơn chất đối chứng, cụ thể là giá trị EC50 (nồng độ hoạt chất thử giảm được 50% hàm lượng melanin) là 90 µM so với EC50 của Kojic acid lớn hơn 100 µM [55]. - Tác dụng hạ đường huyết 12