Tài liệu đánh giá sự lưu tồn và phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl trên ba mô hình canh tác chuyên lúa, lúa màu và chuyên màu ở đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRƯƠNG QUỐC TẤT ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU TỒN VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHLORPYRIFOS ETHYL TRÊN BA MÔ HÌNH CANH TÁC: CHUYÊN LÚA, LÚA - MÀU VÀ CHUYÊN MÀU Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH: KHOA HỌC ĐẤT 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRƯƠNG QUỐC TẤT ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU TỒN VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHLORPYRIFOS ETHYL TRÊN BA MÔ HÌNH CANH TÁC: CHUYÊN LÚA, LÚA - MÀU VÀ CHUYÊN MÀU Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH: KHOA HỌC ĐẤT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. DƯƠNG MINH VIỄN 2018 TÓM TẮT Chlorpyrifos ethyl là thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ, khả năng hấp phụ vào đất cao, tan trong nước thấp, có độc tính cao. Chlorpyrifos ethyl được sử dụng lâu dài trong canh tác nông nghiệp sẽ gây ô nhiễm môi trường đất, nước, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Sự tăng cường phân hủy sinh học chlorpyrifos ethyl lưu tồn trong đất góp phần giảm thiểu ô nhiễm hoạt chất này trong canh tác nông nghiệp. Do đó, luận án này được thực hiện với các mục tiêu: một là đánh giá dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất và ảnh hưởng của 3 mô hình canh tác chuyên lúa, lúa – màu, chuyên màu đến sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phèn và đất phù sa; hai là đánh giá sự phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl bởi quần xã vi khuẩn, sự đa dạng của vi khuẩn khử -Cl trong đất phèn chuyên canh lúa; ba là tuyển chọn, phân lập vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos ethyl và đánh giá ảnh hưởng của 3 mô hình canh tác chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu đến sự đa dạng của vi khuẩn hiếu khí phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất. Đánh giá dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất phèn và đất phù sa được thực hiện qua thu mẫu đất ở độ sâu 0 - 20 cm, vào thời điểm sau khi thu hoạch, trên 3 mô hình canh tác chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu tại tỉnh Hậu Giang, Vĩnh Long và Tiền Giang. Kết quả nghiên cứu cho thấy dư lượng chlorpyrifos ethyl cao nhất trong đất phù sa trên mô hình lúa - màu ở vụ màu với 291 ppb và dư lượng chlorpyrifos ethyl thấp nhất trong đất phù sa chuyên lúa với 3,51 ppb. Đánh giá ảnh hưởng của mô hình canh tác lên sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất, các thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện nhà lưới và điều kiện đồng ruộng. Trong điều kiện nhà lưới, thí nghiệm được thực hiện trên đất phù sa được thu từ mô hình chuyên lúa để đánh giá ảnh hưởng của sự thay đổi mô hình canh tác đến sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất. Ở điều kiện đồng ruộng, thí nghiệm được thực hiện nhằm đánh giá sự thay đổi và không thay đổi mô hình canh tác ảnh hưởng như thế nào đến sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất. Hàm lượng chlorpyrifos ethyl được phun theo khuyến cáo và dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất được xác định vào 4 thời điểm sau phun chlorpyrifos ethyl. Đánh giá dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất ở điều kiện đồng ruộng đã cho thấy ở mô hình canh tác thích hợp, sự phân hủy chlorpyrifos ethyl cao hơn ở đất phù sa và cao nhất trong mô hình lúa-màu. Khi thay đổi mô hình canh tác, dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất bị ảnh hưởng bởi mô hình canh tác. Trong đất, dư lượng chlorpyrifos ethyl cao nhất trong mô hình chuyên lúa và thấp nhất trong mô hình một vụ lúa, hai vụ màu. Bên cạnh đó, kết quả thí nghiệm trong nhà lưới cũng cho thấy mô hình canh tác cũng ảnh hưởng đến tốc độ phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất. Bốn mẫu đất được lấy từ ruộng lúa ở tỉnh Hậu Giang và Tiền Giang đã được sử dụng để đánh giá sự phân hủy chlorpyrifos ethyl bởi các quần xã vi khuẩn kị khí. Thí nghiệm được thiết lập trong lọ thủy tinh 50 ml có chứa môi trường khoáng tối thiểu (30 mL), đất (10 g) và chlorpyrifos ethyl (35 ppm). Phân tích chlorpyrifos ethyl trong suốt thời gian nuôi ủ cho thấy 4 quần xã vi i khuẩn từ 4 mẫu đất đều có khả năng phân hủy gần như cạn kiệt chlorpyrifos ethyl. Tốc độ phân hủy chlorpyrifos ethyl đã tăng gấp đôi sau khi mật độ vi khuẩn được nhân lên trong quá trình ủ. Tốc độ phân hủy chlorpyrifos ethyl trong thời gian 4 tháng nuôi ủ của hai quần xã vi khuẩn từ đất phù sa cao hơn so với hai quần xã vi khuẩn từ đất phèn. Tất cả bốn quần xã vi khuẩn đã phân hủy chlorpyrifos ethyl bằng cách khử -Cl trong hô hấp kị khí. Điều này cho thấy rằng các vi khuẩn trong nhóm Chloroflexi đã có mặt trong các mẫu đất. Năm mươi ba mẫu đất từ 3 mô hình canh tác: chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu được dùng để phân lập vi khuẩn hiếu khí phân hủy chlorpyrifos ethyl. Trong đó, 38 mẫu đất được thu ở điều kiện đồng ruộng và 15 mẫu đất được thu ở điều kiện nhà lưới. TSA và môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung chlorpyrifos ethyl như là nguồn carbon duy nhất được sử dụng để nuôi cấy, tuyển chọn và phân lập vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu đã chọn được 7 quần xã vi khuẩn có khả năng phân huỷ chlorpyrifos. Trong số đó có 4 quần xã vi khuẩn đã được tuyển chọn từ 4 mẫu đất trên đồng ruộng và 3 quần xã vi khuẩn được chọn từ 3 mẫu đất ở điều kiện nhà lưới. Ngoài ra, nghiên cứu này còn phân lập và định danh được 4 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl. Tóm lại, nghiên cứu này đã cho thấy rằng có dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất nông nghiệp và sự hiện diện của vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất canh tác nông nghiệp ở ĐBSCL. Mặt khác, nghiên cứu còn cho thấy mô hình canh tác đã ảnh hưởng đến sự lưu tồn của chlorpyrifos ethyl trong đất và cấu trúc của quần xã vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl. Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu thêm về khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl của các quần xã và dòng vi khuẩn trong đất ở điều kiện nhà lưới và điều kiện đồng ruộng để có thể ứng dụng chúng vào quá trình xử lí ô nhiễm chlorpyrifos ethyl trong đất canh tác nông nghiệp. Từ khóa: đất phèn, đất phù sa, lưu tồn, mô hình canh tác, phân lập, vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos ethyl ii SUMMARY Chlorpyrifos (o,o-diethyl-o-(3,5,6-trichloro-2-pyridyl) phosphorothioate) is a organophosphate insecticide, which is less soluble in water and can be highly adsorbed in the soil. Chlorpyrifos is highly toxic; therefore, long term use of chlorpyrifos in agriculture can result in soil and water pollution and affect severely public health. Increased biodegradation of chlorpyrifos in soil can help alleviating chlorpyrifos-induced pollution in cultivation. This thesis is firstly aimed to evaluate chlorpyrifos-residue in the soil and also examine effects of three cropping models, including paddy rice, rice-cash crops and cash crops to the accumulation of chlorpyrifos in alluvial soil and acid sulfate soil. Secondly, the thesis also assesses the anaerobic digestion of chlorpyrifos by bacteria community, the diversity of chlorpyrifos-degrading bacteriaat sulfate soil in paddy rice. Thirdly, isolation of chlorpyrifos- aerobic degrading bacteria and assessment of effects of the three cropping models to the diversity of chlorpyrifos- aerobic degrading bacteria in the soil is also examined in the thesis. Evaluating the residues of chlorpyrifos in alluvial soil and acid sulfate soil was done by soil sampling at harvest time and depths 0 - 20 cm from fields of paddy rice, rice-cash crops and cash crops in Vinh Long, Tien Giang and Hau Giang provinces. The result showed that chlorpyrifos still remained in soils after crop harvest with highest at alluvial soil in rice-cash crops (291 ppb) and lowest in paddy rice (3.51 ppb). To evaluate effects of cropping models to the residues of chlorpyrifos in soil, experiments were established in the field and greenhouse. In the greenhouse, alluvial soil collected from paddy rice was used to evaluate changes of cropping models, which affected the chlorpyrifos residue in soil. In the field, experiments were to evaluate whether changes and no changes in cropping models affected the chlorpyrifos residues in soil. Chlorpyrifos was sprayed at the recommended concentration and chlorpyrifos residues in soil were measured at 4 time points after chlorpyrifos application. Evaluating the residues of chlorpyrifos in soil from the field showed that in consistent cropping models, the decomposition of chlorpyrifos was higher at alluvial soil and highest in rice - cash crops. When changing cropping models, the residues of chlorpyrifos in soil were affected by the cropping systems. In soil, chlorpyrifos residues remained highest in the paddy rice only model and lowest in one rice - two cash crops models. Besides, the results of experiments in the greenhouse showed that farming and cropping models also affected the decomposition rate of chlorpyrifos. Four soil samples collected from paddy rice fields in Hau Giang and Tien Giang provinces were used to evaluate the degradation of chlorpyrifos by anaerobic bacterial communities. The experiment was set up in 50-mlmicrocosms containing minimal mineral salt medium (30 mL), soils (10 g) and chlorpyrifos (35 ppm). Analysis of chlorpyrifos during incubation time showed that 4 bacteria communities from 4 soil samples are all able to iii anaerobically degrade chlorpyrifos. The rate of chlorpyrifos was doubled after the bacterial density was multiplied during the incubation. The percentage of chlorpyrifos degradation within 4 month-incubation of two bacteria communities from alluvial soil was higher than from the two bacteria communities from acid soil. All of the four bacteria communities degraded chlorpyrifos by reducing Choride in an anaerobic manner. Therefore, it is suggested that the Chloroflexi bacterial phylum was present in soil samples. Fifty-three soil samples were taken from the three cropping systems includes paddy rice, rice-cash crops and cash crops. They were used to isolate chlorpyrifos-degrading bacteria. There were 38 soil samples collected from the field and 15 soil samples collected from the greenhouse condition. TSA medium and minimal mineral salt medium added with chlorpyrifos as a sole carbon source were used to culture, select and isolate the bacteria. There were 7 chlorpyrifos degradable-bacterial communities were selected. Among them, 4 bacterial communities were selected from 4 soil samples in field and 3 bacterial communities were selected from 3 soil samples in the greenhouse. In addition, this study isolated, identified 4 chlorpyrifos-degrading bacterial strains. In summary, this study showed that there were chlorpyrifos residues in agricultural soil, and there were aerobic and anaerobic chlorpyrifos-degrading bacteria in agricultural soil from the Mekong Delta. On the other hand, this study also demonstrated that the cropping systems affected the accumulation of chlorpyrifos in the soil and also the composition of communities of the chlorpyrifos-degrading bacteria. However, further research on capability of these bacteria to degrade chlorpyrifos in agriculture soil from the field and the greenhouse conditions should be carried out to apply these findings to the treatment chlorpyrifos contaimination in agricultural soil. Keywords: acid sulfate soil, alluvial soil, Chlorpyrifos-degrading bacteria, cropping, isolate, residue iv LỜI CẢM TẠ Xin chân thành biết ơn Thầy hướng dẫn khoa học: Đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn các nội dung, phương pháp và kế hoạch triển khai thành công các thí nghiệm; Luận án này không thể hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ, hướng dẫn khoa học và động viên của Thầy. Xin chân thành cảm ơn: - Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ; - Ban Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng; - Ban Chủ nhiệm Khoa Sau Đại học - Các Phòng Ban chức năng khác của Trường Đại học Cần Thơ; Đã tạo điều kiện tốt cho công tác đào tạo nghiên cứu sinh. - Ban chủ nhiệm Bộ môn Khoa học đất, đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành các nội dung học tập và luận án. Các cán bộ và nhóm nghiên cứu đã hỗ trợ tích cực trong việc thực hiện các thí nghiệm. - Xin cảm ơn sự tài trợ kinh phí để thực hiện nghiên cứu từ dự án RIP của Bộ môn Khoa học Đất- Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụngTrường Đại học Cần Thơ hợp tác với Đại học Leuven-Bỉ. - Sau cùng, xin ghi nhớ sự chia sẽ và động viên của gia đình đã góp phần không nhỏ vào sự thành công của luận án. v vi MỤC LỤC Trang TÓM TẮT....................................................................................................................................................i LỜI CẢM TẠ...........................................................................................................................................v LỜI CAM ĐOAN..................................................................................................................................vi MỤC LỤC...............................................................................................................................................vii DANH SÁCH BẢNG..........................................................................................................................xi DANH SÁCH HÌNH.........................................................................................................................xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................................................xvii Chương 1. GIỚI THIỆU...................................................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề...........................................................................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu.......................................................................................................................2 1.3 Nội dung nghiên cứu......................................................................................................................3 1.4 Ý nghĩa của luận án........................................................................................................................3 1.5 Những điểm mới của luận án.....................................................................................................4 Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................................5 2.1. Tổng quan về thuốc BVTV và tình hình sử dụng thuốc BVTV hiện nay............5 2.1.1 Tổng quan về thuốc BVTV.....................................................................................................5 2.1.2 Tình hình sử dụng và nguy cơ ô nhiễm thuốc BVTV trên thế giới và ở Việt Nam...................................................................................................................................................10 2.1.3 Phân hủy sinh học và phục hồi đất ô nhiễm thuốc BVTV bằng biện pháp sinh học......................................................................................................................................................15 2.1.4 Tổng quan về chlorpyrifos ethyl........................................................................................20 2.2 Tổng quan về ĐBSCL.................................................................................................................26 2.2.1 Vị trí địa lí và điều kiện tự nhiên.......................................................................................26 2.2.2 Phân bố và đặc tính các nhóm đất chính.........................................................................27 Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................................33 3.1 Phương tiện nghiên cứu.............................................................................................................34 3.1.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm.................................................................34 vii 3.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm............................................................................................34 3.1.3 Hóa chất.........................................................................................................................................35 3.2 Phương pháp nghiên cứu của từng nội dung....................................................................36 3.2.1 Nội dung 1: Đánh giá dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất phèn chuyên lúa, chuyên mía và trong đất phù sa chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu tại một số địa điểm ở Đồng bằng Sông Cửu Long.......................................................................36 3.2.2 Nội dung 2: Đánh giá ảnh hưởng của loại đất (đất phèn và đất phù sa) lên sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phèn chuyên lúa, chuyên mía và đất phù sa chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu ở điều kiện đồng ruộng và điều kiện nhà lưới......................................................................................................................................................36 3.2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl bởi vi khuẩn trong đất phèn và đất phù sa chuyên lúa ở Hậu Giang và Tiền Giang......42 3.2.4 Nội dung 4: Tuyển chọn, phân lập vi khuẩn hiếu khí phân hủy chlorpyrifos ethyl từ đất phèn và đất phù sa chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu..............................................................................................................................................................50 3.2.5 Nội dung 5: Đánh giá hoạt động phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C4.3 trong môi trường khoáng tối thiểu và trong môi trường đất..................................................................................................................................................57 3.2.6 Phương pháp phân tích và xử lí số liệu...........................................................................59 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................................70 4.1 Nội dung 1: Kết quả đánh giá dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất phèn chuyên lúa, chuyên mía và đất phù sa chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu ở Đồng bằng sông Cửu Long...............................................................................................................60 4.1.1 Đặc tính của đất thí nghiệm..................................................................................................60 4.1.2 Kết quả đánh giá dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất.........................................62 4.2 Nội dung 2: Đánh giá sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phèn, đất phù sa và ảnh hưởng của 3 mô hình canh tác chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu đến sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất ở điều kiện đồng ruộng và điều kiện nhà lưới......................................................................................................................................................64 4.2.1 Đánh giá sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phù sa trên 3 mô hình canh tác chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu trong điều kiện nhà lưới....................64 viii 4.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của 3 mô hình canh tác chuyên lúa, 2 lúa - 1 màu, 1 lúa - 2 màu lên sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phù sa ở Long Khánh, Cai Lậy, Tiền Giang............................................................................................................................67 4.2.3 Đánh giá sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phèn, đất phù sa trên 3 mô hình canh tác chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu....................................................70 4.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl của quần xã vi khuẩn trong đất phèn, đất phù sa chuyên lúa ở Hậu Giang và Tiền Giang..........................................................................................................................................................74 4.3.1 Kết quả đánh giá khả năng phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl của 4 quần xã vi khuẩn trong dung dịch đất..........................................................................................74 4.3.2 Sự hình thành các sản phẩm trung gian trong quá trình chuyển hóa chlorpyrifos ethyl khi bị phân hủy bởi quần xã vi khuẩn kỵ khí.....................................78 4.3.3 Đa dạng vi khuẩn phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl trong đất......................80 4.4 Nội dung 4: Phân lập vi khuẩn hiếu khí bản địa phân hủy chlorpyrifos ethyl từ đất phèn và đất phù sa ở điều kiện đồng ruộng và đất phù sa ở điều kiện nhà lưới trên 3 mô hình canh tác: chuyên lúa, lúa - màu và chuyên màu ở Đồng bằng sông Cửu Long...............................................................................................................84 4.4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí bản địa có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất phèn và đất phù sa chuyên canh lúa...................................84 4.4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí bản địa có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất phèn và đất phù sa chuyên màu............................................88 4.4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí bản địa phân hủy chlorpyrifos ethyl từ đất phù sa luân canh lúa - màu..................................................................................................91 4.4.4 Kết quả làm giàu mật số và tuyển chọn các quần xã vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos ethyl trong môi trường khoáng tối thiểu từ đất phù sa của mô hình chuyên lúa, 2 lúa - 1 màu và chuyên màu trong điều kiện nhà lưới..............................93 4.4.5 Một số đặc tính sinh thái của các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl..................................................................................................................................97 4.4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 4 dòng vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos ethyl và định danh chúng dựa vào trình tự gene 16S-rRNA..................98 4.4.7 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến gia tăng mật số của các dòng vi khuẩn..................................................................................................................................................101 ix 4.5 Nội dung 5: Đánh giá hoạt động phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn Barrientosimonas humi C4.3 trong môi trường khoáng tối thiểu và trong môi trường đất.........................................................................................................................104 4.5.1 Khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn Barrientosimonas humi C4.3 trong dung dịch khoáng tối thiểu...................................104 4.5.2 Khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn Barrientosimonas humi C4.3 và tổ hợp 4 dòng vi khuẩn trong môi trường đất....106 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................108 5.1 Kết luận...........................................................................................................................................108 5.2. Kiến nghị.......................................................................................................................................108 TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................................110 PHỤ LỤC x DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Các cấp độ phân loại độ độc của một chất theo WHO....................................6 Bảng 2.2: Các cấp độ phân loại độ độc của thuốc BVTV ở Việt Nam..........................6 Bảng 2.3: Khả năng hấp phụ vào đất và trầm tích của hoạt chất BVTV dựa vào Koc........................................................................................................................................................9 Bảng 3.1: Nguồn gốc mẫu đất dùng trong thí nghiệm nuôi ủ vi khuẩn kị khí.........43 Bảng 3.2: Một số đặc tính lý hóa của các loại đất sử dụng trong thí nghiệm nuôi ủ yếm khí........................................................................................................................................43 Bảng 3.3: Thành phần của nghiệm thức trong thí nghiệm nuôi ủ yếm khí................46 Bảng 3.4: Thành phần của từng nghiệm thức khảo sát hoạt động phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C4.3.....................................................57 Bảng 3.5: Thành phần các nghiệm thức khảo sát sự phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn PH_C4.3 và tổ hợp 4 dòng vi khuẩn trong môi trường đất.................................................................................................................................................................59 Bảng 4.1: Tính chất của đất phèn ở huyện Phụng Hiệp tỉnh Hậu Giang....................60 Bảng 4.2: Tính chất của đất phù sa ở huyện Bình Minh và Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long................................................................................................................................................61 Bảng 4.3: Một số đặc tính hóa học của đất thí nghiệm ở huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang................................................................................................................................................67 Bảng 4.4: Tính chất của đất phù sa ở huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang.......................85 Bảng 4.5: Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn..............98 Bảng 4.6: Định danh các dòng vi khuẩn thể hiện sự phân hủy chlorpyrifos ethyl theo độ tương đồng của đoạn gene 16S rRNA..........................................................100 Bảng 4.7: Các yếu tố môi trường tối ưu cho sự tăng trưởng của các dòng vi khuẩn..................................................................................................................................................104 xi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Con đường di chuyển của thuốc BVTV trong môi trường.............................8 Hình 2.2: Chi phí của các nhóm thuốc BVTV trên toàn thế giới năm 2010.............11 Hình 2.3: Thị trường tiêu thụ thuốc BVTV trên toàn thế giới năm 2010..................11 Hình 2.4: Tình hình nhập khẩu thuốc BVTV ở Việt Nam................................................13 Hình 2.5: Cấu trúc của chlorpyrifos ethyl................................................................................20 Hình 2.6: Con đường chuyển hóa của chlorpyrifos ethyl..................................................25 Hình 2.7: Bản đồ phân bố các loại đất ở ĐBSCL.................................................................28 Hình 3.1: Sơ đồ nội dung tổng quát của luận án...................................................................33 Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nhà lưới..............................................................................38 Hình 3.3: Các túi lưới chứa đất đã trộn chlorpyrifos ethyl và cho vào đất................39 Hình 3.4: Thí nghiệm ở Cai Lậy - Tiền Giang.......................................................................40 Hình 3.5: Địa điểm và số ruộng khảo sát lưu tồn chlorpyrifos ethyl...........................41 Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl bởi quần xã vi khuẩn.....................................................................................45 Hình 3.7: Bố trí thí nghiệm yếm khí: (a) Các lọ ủ được trữ để lấy chỉ tiêu theo thời gian, (b) Mẫu được ủ trong lọ pi 50 mL, (c) Lấy chỉ tiêu hóa học và sinh học, (d) Dung dịch yếm khí có màu xanh hoặc xanh tím...................................................47 Hình 3.8: Sắc ký đồ của đường nền (mẫu trắng)...................................................................48 Hình 3.9: Sắc ký đồ của chất chuẩn............................................................................................48 Hình 3.10: Sơ đồ số lượng mẫu đất phân lập vi khuẩn hiếu khí theo mô hình........51 Hình 4.1: Dư lượng chlorpyryfos ethyl trong đất phèn và đất phù sa ở 3 địa điểm thu mẫu...........................................................................................................................................62 Hình 4.2: Dư lượng chlorpyryfos ethyl trong đất phèn và đất phù sa trên các mô hình canh tác...................................................................................................................................63 Hình 4.3: Lưu tồn của chlorpyrifos ethyl trong đất phù sa trên các mô hình canh tác trong điều kiện nhà lưới (2014)...................................................................................66 Hình 4.4: Lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất phù sa trên các mô hình canh tác ở Long Khánh - Cai Lậy - Tiền Giang (vụ Đông Xuân 2013)..................................69 xii Hình 4.5: Lưu tồn của chlorpyrifos ethyl trong đất phù sa ở mô hình 1 lúa - 2 màu (đậu xanh) tại Long Khánh, Cai Lậy, Tiền Giang (vụ Hè Thu 2013).................70 Hình 4.6: Tốc độ suy giảm của chlorpyrifos ethyl trong 3 mô hình canh tác tại Bình Tân, Vĩnh Long (vụ Đông Xuân 2013)...........................................................................71 Hình 4.7: Tốc độ mất đi của chlorpyrifos ethyl trong đất phèn ở mô hình chuyên lúa và chuyên mía (vụ Đông Xuân 2013) (n = 4, Sai số chuẩn).....................73 Hình 4.8: Khả năng phân hủy chlopyrifos ethyl của quần xã vi khuẩn CL01 (a) và CL02 (b).........................................................................................................................74 Hình 4.9: Tốc độ phân hủy chlorpyrifos ethyl ở các nghiệm thức của quần xã vi khuẩn ký hiệu CL01 và CL02....................................................................................................75 Hình 4.10: Khả năng phân hủy chlopyrifos ethyl của hệ VK PH01 (a) và PH02 (b)....................................................................................................................................................76 Hình 4.11: Tốc độ phân hủy chlorpyrifos ethyl ở các nghiệm thức của cộng động vi khuẩn ký hiệu PH01 và PH02........................................................................................77 Hình 4.12: Sơ đồ chuyển hóa của chlorpyrifos ethyl trong nghiệm thức bổ sung acid hữu cơ.............................................................................................................................78 Hình 4.13: Sắc ký đồ sản phẩm trung gian trong quá trình phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl khi scan trên GCMS......................................................................................78 Hình 4.14: Điện di đồ sản phẩm PCR của nhóm vi khuẩn Chloroflexi trong các nghiệm thức mẫu đất PH01 với cặp mồi 338F/1101R................................................81 Hình 4.15: Điện di đồ sản phẩm PCR của nhóm vi khuẩn Chloroflexi trong các nghiệm thức mẫu đất PH01 với cặp mồi 341F-GC/534R..........................................81 Hình 4.16: Điện di đồ sản phẩm PCR (DGGE) của các nghiệm thức mẫu đất PH01.........................................................................................................................................83 Hình 4.17: Độ tương đồng của các vi khuẩn nhóm Chloroflexi trong mẫu đất PH01...........................................................................................................................................................84 Hình 4.18: Sự phát triển của một số quần xã vi khuẩn được làm giàu mật số với chlorpyrifos ethyl..........................................................................................................................86 Hình 4.19: Phần trăm phân hủy chlorpyrifos ethyl của quần xã vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiểu sau 30 ngày nuôi cấy (n=3)...................................................86 Hình 4.20: Sự phát triển của 2 dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C3.1 và PH_C4.3 trong môi trường khoáng tối thiểu chứa chlorpyrifos ethyl nồng độ 20 ppm...........87 xiii Hình 4.21: Phần trăm phân hủy chlorpyrifos ethyl của 2 dòng vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiểu sau 30 ngày nuôi cấy (n=4)...................................................88 Hình 4.22: Phần trăm phân hủy chlorpyrifos ethyl của quần xã vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiểu sau 30 ngày nuôi cấy (n=4)...................................................89 Hình 4.23: Phần trăm phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn ký hiệu BM_C9.2 trong môi trường khoáng tối thiểu sau 30 ngày nuôi cấy (n=4)................90 Hình 4.24: Phần trăm phân hủy chlorpyrifos ethyl của quần xã vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiểu sau 30 ngày nuôi cấy (n=4)...................................................91 Hình 4.25: Phần trăm phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn ký hiệu BT_C8.9 trong môi trường khoáng tối thiểu sau 30 ngày nuôi cấy (n=4)..................92 Hình 4.26: Phần trăm phân hủy chlorpyrifos ethyl của các quần xã vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiểu sau 30 ngày nuôi cấy (n = 3, Sai số chuẩn).......94 Hình 4.27: Điện di đồ sản phẩm PCR-DGGE (a) và độ tương đồng (b) của 7 quần xã vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl..............................................96 Hình 4.28: Hình thái khuẩn lạc của 4 dòng vi khuẩn..........................................................97 Hình 4.29: Hình nhuộm Gram của các dòng VK, chụp dưới KHV (X1000)...........97 Hình 4.30: Phổ điện di sản phẩm PCR của 4 dòng VK......................................................98 Hình 4.31: Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự gia tăng mật số vi khuẩn...........101 Hình 4.32: Ảnh hưởng của pH đến mật số của 4 dòng vi khuẩn.................................102 Hình 4.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số của 4 dòng vi khuẩn......................103 Hình 4.34: Mật số vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy có và không có bổ sung TSB.....................................................................................................................105 Hình 4.35: Khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn Barrientosimonas humi C4.3 theo thời gian..........................................................................106 Hình 4.36: Khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl của dòng vi khuẩn Barrientosimonas humi C4.3 và nhóm vi khuẩn (n=3, sai số chuẩn)........................107 xiv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ADI acceptable daily intake (lượng chất độc không gây hại cơ thể người được chấp nhận) ADN a.i active ingredient (hoạt chất thuốc) BVTV bảo vệ thực vật BM BT ì B nh Minh ì â CL PH B nh T n Cai Lậ y Phụ ng Hiệ p CEC cation exchange capacity (khả CFU đ đ nă ng trao ổ i cation) ì à CTAB ĐBSCL colony-forming unit ( ơ n vị h nh th nh khuẩ n lạ c) Cetyltrimethylammonium bromide Đồng bằng sông Cửu Long DCM Dichloromethane DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DNA Deoxyribonucleic acid FAO Food and Agriculture Organization (tổ chức lương thực và GC/MS nông nghiệp) Gas Chromatography Mass Spectrometry (sắc kí khí khối phổ) HPLC High Perfomance Liquid Chromatography (sắc kí lỏng cao áp) Kd â Distribution coefficient (hệ sốố ph n phốố i) KHV Koc Kính hiển vi organic carbon adsorption coefficient (chỉ số hấp phụ độc chất LD50 hữu cơ trong đất) Lethal Dose 50 (liều chất độc gây chết một nửa động vật) MRL maximum residue limit (mức dư lượng tối đa) xv MSBĐ Mật số ban đầu NN-PTNT Nông nghiệp - Phát triển nông thôn NT Nghiệm thức PCB Polychlorinated biphenyls PCR Polymerase chain reaction PE Petroleum ether ppb parts per billion (một phần tỷ) ppm parts per million (một phần triệu) TCP 3,5,6-trichloro-2-pyridinol WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới) xvi CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đă ̣t vấn đề Việt Nam là một nước nông nghiệp với tổng diện tích đất canh tác nông nghiệp khoảng 26,28 triệu ha, nông dân chiếm hơn 2/3 dân số cả nước. Vì vậy, nông nghiệp chiếm vị trí vô cùng quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Theo thống kê của ngành nông nghiệp, tổng kim ngạch xuất khẩu nông sản trong 10 tháng đầu năm 2014 của nước ta đạt 25,85 tỷ USD. Trong đó, Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) - khu vực sản xuất nông nghiệp lớn nhất cả nước đóng góp một phần không nhỏ. Sự gia tăng sản lượng nông nghiệp là kết quả của việc nâng cao kỹ thuật canh tác và hoạt động thâm canh tăng vụ, tăng cường công tác bảo vệ thực vật (BVTV). Do điều kiện khí hậu nóng ẩm của ĐBSCL dễ làm cho sâu bệnh phát triển, hậu quả là việc sử dụng thuốc BVTV ngày càng tăng và đa dạng hơn về mặt chủng loại. Việc sử dụng thuốc BVTV quá mức đã làm cho một lượng lớn thuốc còn lưu tồn trong đất, nước, nông sản gây độc hại cho các sinh vật khác và sức khỏe cộng đồng. Trong số các loại thuốc BVTV đang được sử dụng rộng rải, chlorpyrifos ethyl là hoạt chất của thuốc trừ sâu thuộc nhóm lân hữu cơ. Hoạt chất này thuộc loại có tính độc thần kinh ở mức cao, gây hại cho người và nhiều loại động vật có lợi. Chlorpyrifos ethyl có khả năng hấp phụ vào đất rất cao, hệ số Koc dao động từ 652 đến 30.381 L/kg tùy từng loại đất (Gebremariam et al., 2012). Vì vậy đất phù sa và đất phèn có thể ảnh hưởng khác nhau đến sự hấp phụ chlorpyrifos ethyl vào đất và qua đó ảnh hưởng đến dư lượng hoạt chất này trong đất. Đồng thời, qua kết quả điều tra ở ĐBSCL của dự án RIP (Chương trình VLIR) hợp tác giữa Trường Đại học Cần Thơ và Trường Đại học Leuven của Bỉ cho thấy chlorpyrifos ethyl được nông dân sử dụng trên cả 3 mô hình canh tác chuyên lúa, luân canh lúa - màu, chuyên màu và lượng sử dụng cao nhất trên mô hình chuyên màu, khi chuyển đổi sang mô hình luân canh lúa - màu thì lượng sử dụng thấp nhất và sử dụng với lượng cao hơn khuyến cao từ 2-15 lần. Do đó, việc sử dụng chlorpyrifos ethyl lâu dài có thể làm lưu tồn hoạt chất này ở trong đất, sự phóng thích chlorpyrifos ethyl từ trong đất kết hợp với sự rửa trôi sẽ gây nguy cơ ô nhiễm loại hoạt chất này trong tầng nước mặt cũng như các môi trường khác. Trong đất chlorpyrifos ethyl có thể bị phân hủy bằng các con đường hóa học, vật lý và sinh học. Sự phân hủy sinh học thuốc BVTV nói chung và chlorpyrifos ethyl nói riêng đang rất được quan tâm. Phân hủy sinh học là khi các vi sinh vật đất có tham gia vào quá trình phân hủy (Andreu and Picó, 2004). Trong quá trình phân hủy sinh học những loài vi sinh vật đất đóng vai trò hết sức quan trọng vì chúng có 1 thể sử dụng hoặc phân hủy các loại thuốc BVTV, đặc biệt là những loại thuốc có độ bền cao. Vì vậy, sự phân hủy sinh học làm giảm dư lượng thuốc BVTV một cách hiệu quả, bền vững, thân thiện với môi trường mà ít tốn kém và cũng là yếu tố chính quyết định số phận của các loại thuốc BVTV. Nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới đã phân lập được các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tốt chlorpyrifos ethyl như: Dòng vi khuẩn Enterobacter chủng B14 (Singh et al., 2004), Alcaligenes faecalis DSP3 (Yang et al., 2006), Paracoccus-TRP (Gangming et al., 2008). Mặt khác, ở ĐBSCL, nông dân đang canh tác trên 2 nhóm đất (đất phèn và đất phù sa) điển hình, với 3 kiểu mô hình phổ biến: chuyên lúa (ngập nước thường xuyên, điều kiện yếm khí chiếm ưu thế, lúa - màu (ngập khô luân phiên, điều kiện yếm khí xen kẽ hiếu khí) và chuyên màu (môi trường cạn, điều kiện hiếu khí chiếm ưu thế). Mô hình canh tác quyết định loại cây trồng (lúa hoặc rau màu) và tạo nên đặc tính lí hóa, sinh học đặc trưng của đất ở mỗi mô hình canh tác. Loại cây trồng trên mỗi mô hình của từng nhóm đất sẽ quyết định đến loại và lượng thuốc BVTV sử dụng và qua đó ảnh hưởng đến sự lưu tồn của chúng trong đất. Loại và lượng thuốc BVTV sử dụng trên các đối tượng cây trồng khác nhau của mỗi nhóm đất sẽ dẫn đến sự hình thành các hệ vi sinh vật đất khác nhau. Đặc biệt, nhóm vi sinh vật phân hủy thuốc BVTV trong đất. Vì vậy, để làm rõ mối tương quan giữa mô hình canh tác (đối tượng cây trồng và nhóm đất), loại và liều lượng thuốc BVTV sử dụng - đặc biệt là chlorpyrifos ethyl, với sự lưu tồn và nhóm vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất, luận án: “Đánh giá sự lưu tồn và phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy chlorpyrifos ethyl trên 3 mô hình canh tác: chuyên lúa, lúa màu và chuyên màu ở ĐBSCL” được thực hiện với mục tiêu đánh giá sự tương tác giữa loại đất (đất phèn và đất phù sa), loại cây trồng (lúa và màu) với dư lượng chlorpyrifos ethyl trong đất và vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos ethyl trong đất. 1.2 Mụ tiêu nghiên ̣ứu Luận án được thực hiện với các mục tiêu chính sau: - Đánh giá ảnh hưởng của mô hình canh tác (chuyên lúa, lúa-màu, chuyên màu) và loại đất (đất phèn và đất phù sa) lên dư lượng và sự lưu tồn chlorpyrifos ethyl trong đất. - Đánh giá ảnh hưởng của ba mô hình canh tác chuyên lúa (ngập nước thường xuyên, điều kiện yếm khí chiếm ưu thế, lúa - màu (ngập khô luân phiên, điều kiện yếm khí xen kẽ hiếu khí) và chuyên màu (môi trường cạn, điều kiện hiếu khí chiếm ưu thế) và loại đất (đất phèn và đất phù sa) lên sự 2