Tài liệu đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể nấm magnaporthe oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa ở miền bắc và miền trung việt nam bằng chỉ thị ssr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ THỊ LOAN ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM MAGNAPORTHE ORYZAE GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA Ở MIỀN BẮC VÀ MIỀN TRUNG VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ SSR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ THỊ LOAN ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM MAGNAPORTHE ORYZAE GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA Ở MIỀN BẮC VÀ MIỀN TRUNG VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ SSR Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. HOÀNG THỊ GIANG 2. TS. LÊ QUỲNH MAI HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tất cả những số liệu, thông tin và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, khách quan, chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận văn Hà Thị Loan i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các cán bộ tại Phòng thí nghiệm liên kết quốc tế Nghiên cứu chức năng gen, công nghệ sinh học thực vật và sự tương tác với vi sinh vật(LMI RICE-2), Viện Di truyền Nông nghiệp. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Thị Giang, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và dành nhiều thời gian giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm LMI RICE-2 - Viện Di truyền Nông nghiệp để hoàn thành luận văn. Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Lê Quỳnh Mai, giảng viên Bộ mônHóa sinh và Sinh học phân tử của trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội. Cô đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và sự giúp đỡ quý báu trong suốt quá trình tôi học tập tại trường. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sâu sắc ThSLê Thị Liễu - nghiên cứu viên tại Viện di truyền Nông nghiệp đã chỉ dẫn tận tình cho tôi từ những bước đi cơ bản trong nghiên cứu tại Viện. Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới cô Elisabeth Fournier và bác Henri Adreit – hai chuyên gia từ Pháp đã hỗ trợ nhóm nghiên cứu về kĩ thuậtchuyên môn sâu trong nghiên cứu quần thểsuốt quá trình thực hiện đề tài này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới tất cả các nghiên cứu viên, kĩ thuật viên, đồng nghiệp tại Phòng thí nghiệm Việt Pháp LMI RICE-2 - Viện Di truyền Nông nghiệp và gia đình đã luôn ủng hộ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2018 Học viên Hà Thị Loan ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ vi DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. vii MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3 1.1. Bệnh đạo ôn hại lúa do nấm M. oryzae gây ra .....................................................3 1.1.1. Giới thiệu về nấm M. oryzae gây bệnh đạo ôn ............................................................ 3 1.1.2. Triệu chứng, điều kiện phát sinh và phát triển bệnh.................................................... 5 1.1.3. Cơ chế tương tác giữa nấm M. oryzae và cây lúa ........................................................ 6 1.1.4. Tình hình bệnh đạo ôn hại lúa ở Việt Nam và trên thế giới........................................ 7 1.2. Các kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm M. oryzae .............9 1.2.1. Những nghiên cứu trong nước....................................................................................... 9 1.2.2. Những nghiên cứu ở nước ngoài ................................................................................. 11 1.3. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn ...........................14 1.3.1. Chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn bằng chỉ thị phân tử ................................... 14 1.3.2. Sử dụng QTL trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn..................................... 16 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................18 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................18 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................18 2.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................18 2.4. Các phương pháp được nghiên cứu....................................................................18 2.4.1. Thu thập mẫu bệnh và phân lập chủng nấm đạo ôn gây bệnh trên lúa tại một số tỉnh miền Bắc và miền Trung ................................................................................................. 18 2.4.1.1. Phương pháp thu thập mẫu bệnh .............................................................18 2.4.1.2. Phương pháp phân lập mẫu bệnh ............................................................19 2.4.2. Đánh giá đa dạng di truyền các dòng nấm đạo ôn bằng chỉ thị SSR ....................... 20 iii 2.4.2.2. Phương pháp PCR .....................................................................................21 2.4.2.3. Phương pháp điện di ..................................................................................24 2.4.3. Phân tích kết quả ........................................................................................................... 25 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................26 3.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh và phân lập nấm đạo ôn M. oryzaegây bệnh trên lúa ...................................................................................................................................26 3.1.1. Kết quả thu thập mẫu lúa bị bệnh đạo ôn ................................................................... 26 3. 1.2. Kết quả phân lập nấm đạo ôn M. oryzae gây bệnh trên lúa ..................................... 30 3.2. Kết quả tách chiếtDNA và kiểm định các chủng nấm đạo ônM. oryzae đã phân lập bằng chỉ thị phân tử .............................................................................................32 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA của các chủng phân lập ...................................................... 32 3.2.2. Kết quả kiểm định các chủng phân lập bằng chỉ thị phân tử .................................... 34 3.3. Kết quả giải trình tự và xây dựng cây phân loại di truyền quần thể nấm Magnaporthe oryzae .................................................................................................35 3.3.1. Kết quả giải trình tự sản phẩm phản ứng PCR với SSR ........................................... 35 3.3.2. Cây phân loại di truyền và mức độ đa dạng di truyền của quần thể nấm Magnaporthe oryzae ............................................................................................................... 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................47 Kết luận .....................................................................................................................47 Kiến nghị ...................................................................................................................47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................49 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần môi trường bột gạo…………………………………… 20 Bảng 2.2. Thành phần môi trường lỏng để nuôi nấm tách DNA ..............................20 Bảng 2.3. Danh sách các cặp mồi SSR được sử dụng trong nghiên cứu ..................23 Bảng 2.4. Thành phần của một phản ứng PCR 5 µl .................................................24 Bảng 3.1. Danh sách các mẫu bệnh được thu thập trong nghiên cứu......................27 Bảng 3.2. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR (bp) với 11 cặp mồi SSR của 58 chủng nấm............................................................................................................... 36 Bảng 3.3. Số locus đa hình thu được từ 58 chủng nấm đạo ôn phân tích với 11 chỉ thị SSR.......................................................................................................................39 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vòng đời của nấm đạo ôn Magnaporthe oryzae .........................................4 Hình 1.2. Triệu chứng vết bệnh đạo ôn trên cây lúa ...................................................5 Hình 3.1. Quá trình thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng ..........................................30 Hình 3.2. Quá trình nuôi cấy mẫu bệnh cho hình thành bào tử nấm ........................31 Hình 3.3. Quá trình phân lập bào tử đơn và nuôi cấy ...............................................32 Hình 3.4. Kết quả điện di DNA tổng số của một số chủng nấm đạo ôn ...................33 Hình 3.5. Kết quả PCR một số chủng phân lập bằng cặp mồi ITS5/ITS4................34 Hình 3.6. Cây phân loại di truyền theo tên chủng của 57 chủng nấm đạo ôn nghiên cứu ....45 Hình 3.7. Cây phân loại theo tên giống lúa ký chủ của 57 chủng nấm đạo ôn nghiên cứu ...45 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Thuật ngữ tiếng anh AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Arv BGPI Avirulence Biologie et Génétique des Interactions Plante-Parasite CIRAD ĐBSCL The French Agricultural Reseach Centre for international Development Đồng bằng sông Cửu Long ĐBSH Đồng bằng sông Hồng DNA Deoxyribonucleic acid ETI Effector triggered immunity MAS Marker assisted selection PAMP Pathogen associated molecular pattern PCR Polymerase Chain Reaction PTI PAMP - Triggered immunity QTL Quantitative trait locus R Resistance RAPD Rep-PCR Random Amplified Polymorphic DNA Repetitive Sequence-based PCR RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SSR Simple Sequence RepeateshayMicrosatellite ITS Internal Transcribed Spacer vii MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Bệnh đạo ôn do một loại nấm sợi có tên khoa học chung là Magnaporthe oryzae (M. oryzae) gây ra,là một trong những bệnh gây hại chính, ngày càng trở nên nghiêm trọng đối với sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam và trên thế giới. Khi dịch bệnh xảy ra có thể gây hại và làm giảm năng suất từ 35-50% tổng sản lượng lương thực của thế giới. Hiện nay, ở Việt Nam bệnh đạo ôn đã gây hạiở cả 8 vùng sinh thái nông nghiệp, đặc biệt ở Đồng bằng sông Hồng với khí hậu ẩm nhiệt đới càng làm tăng khả năng phát triển nấm bệnh [42]. Để phòng trừ bệnh đạo ôn, biện pháp chính được áp dụng hiện nay là sử dụng thuốc hóa học, tuy nhiên biện pháp này chưa thực sự mang lại hiệu quả khi bùng phát dịch bệnh.Hơn nữa còn gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng tới sức khỏe con người và tăng khả năng kháng thuốc của nấm bệnh. Phát triển các giống lúa kháng bệnh được coi là định hướng an toàn và hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh đạo ôn trên lúa. Các gen kháng (R) được đưa vào giống lúa có năng suất cao nhưng dễ bị nhiễm bệnh bằng phương pháp lai tạo. Tuy nhiên, hầu hết các giống kháng chỉ có hiệu lực trong vòng 2-3 năm do nấm hình thành những chủng gây bệnh mới có độc tính cao [12, 30]. Nguyên nhân được xác định là do các tác nhân gây bệnh tiến hóa nhanh chóng và làm vô hiệu hóa các gen kháng ở thực vật[37, 57]. Muốn chọn tạo giống có tính kháng bền vững cần phải liên hệ chặt chẽ với nghiên cứu về đặc tính di truyền của quần thể tác nhân gây bệnh. Chính vì vậy, việc hiểu biết về mức độ đa dạng di truyền và sự tiến hóa của quần thể nấm M. oryzae trong một vùng sinh thái cụ thể rất cần thiết cho chương trình chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn hiệu quả và bền vững. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Magnaporthe oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam bằng chỉ thị SSR”. Kết quả của nghiên cứu sẽ cung cấp mức độ đa dạng di truyền của quần thể tác nhân gây bệnh, qua đó là cơ sở cho việc xây dựng chương trình chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn hiệu quả và bền vững. Đề tài góp phần chuẩn hóa và hoàn thiện 1 quy trình kỹ thuật về nghiên cứu quần thể nấm bệnh đạo ôn ở Việt Nam. Kết quả của đề tài sẽ góp phần định hướng để phát triển chiến lược kiểm soát bệnh đạo ôn lúa hiệu quả hơn. 2 Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh đạo ôn hại lúa do nấm M. oryzae gây ra 1.1.1. Giới thiệu về nấm M.oryzae gây bệnh đạo ôn Lúa (Oryzae sativa L.) là cây trồng đóng vai trò quan trọng trong nền an ninh lương thực toàn cầu. Tuy nhiên, sản xuất lúa gạo luôn bị đe dọa bởi các dịch bệnh nguy hiểm, trong đó có bệnh đạo ôn do nấm M. oryzae gây ra. Ở Việt Nam, bệnh đạo ôn là một trong những bệnh gây hại chính và ngày càng trở nên nghiêm trọng đối với nền nông nghiệp sản xuất lúa gạo, làm giảm tới 20% tổng sản lượng lúa gạo hàng năm [40]. Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Italia năm 1560, sau đó là ở Trung Quốc năm 1637, Nhật Bản năm 1760, Mỹ năm 1906, Ấn Độ năm 1913… Ở Việt Nam, bệnh được Vincens phát hiện vào năm 1921 ở Nam Bộ, năm 1951 Rogen đã xác định sự xuất hiện và gây hại của bệnh ở vùng Bắc Bộ [9]. Nấm M. Oryzae ngoài tấn công cây lúa, còn tấn công các loại cây trồng khác hoặc cỏ dại thuộc họ hòa thảo Poaceae: nấm M. oryzae là loài đa kí chủ, bao gồm nhiều phân dòng (lineage) đặc hiệu loài kí chủ và phân rẽ di truyền [15, 17, 55]. Nấm có thể gây nhiễm trên lá, thân, nốt thân và cổ bông bằng các công cụ xâm nhiễm như bào tử, giác bám và cọc xâm nhiễm để tấn công tế bào của cây lúa nhằm lấy chất dinh dưỡng cho sự tồn tại và phát triển của chúng [23]. Nấm M. oryzae thường sinh ra các cụm cành từ 3-5 bào tử. Bào tử phân sinh hình quả lê hoặc hình nụ sen phía dưới phình to, phía trên hơi nhọn, thường có 2-3 vách ngăn ngang, bào tử không màu kích thước trung bình của bào tử nấm 19-23 x 10-12 µm [4, 8]. Cơ quan sinh trưởng của nấm M. oryzae là sợi nấm không màu đa bào, phân nhiều nhánh, sống kí sinh trong mô thực vật. Cành bào tử phân sinh hình trụ, đa bào không phân nhánh, đầu cành thon và hơi gấp khúc, thường mọc thành chùm ở khí khổng, có 2-4 vách ngăn ngang, mang một hay nhiều bào tử phân sinh (1-20 bào tử). Cành bào tử phân sinh là cơ quan sinh ra bào tử vô tính tạo thành một lớp mốc mịn màu xám trên bề mặt vết bệnh ở lá, ở cổ bông và đốt thân.[1]. 3 Vòng đời của nấm đạo ôn được thể hiện trong Hình 1.1. Nấm đạo ôn bắt đầu chu kì xâm nhiễm khi bào tử đơn tiếp xúc với bề mặt của cây chủ. Bào tử đơn gắn vào phần kị nước của lớp biểu bì và nảy mầm, tạo ra một ống mầm nhỏ, phần này sau đó sẽ tạo thành móc trước khi phân tách thành giác bám. Quá trình xâm nhập bắt đầu xảy ra khi giác bám trưởng thành tạo thành một cái “chốt” trương phồng lên tạo ra áp suất giúp nó có khả năng đâm xuyên qua bề mặt vật chủ. Sự tổn thương xảy ra trong khoảng 72 đến 96 giờ sau khi xâm nhiễm và sự hình thành bào tử xảy ra trong điều kiện ẩm, có sương [45]. Hình 1.1Vòng đời của nấm đạo ôn Magnaporthe oryzae [45] Đến nay, bộ gen của nấm đạo ôn M. oryzae đã được giải trình tự đầy đủ do nhóm nghiên cứu của [19], có 11.109 gen được dự đoán với kích thước khoảng 3,5 kb cho mỗi gen trong hệ genome của nấm M. oryzae. Các nghiên cứu trước đây cho thấy nấm đạo ôn M. oryzae có mức độ đa dạng di truyền cao và khả năng tiến hóa nhanh chóng trong tự nhiên. M. oryzae có thể thích nghi với các gen kháng mới và áp lực chọn lọc trong vòng vài năm sau khi bùng phát [18, 24]. Sự thích nghi của nấm thường liên quan đến các đột biến và tái tổ hợp di truyền thúc đẩy quá trình tiến hóa trong quần thể nấm đạo ôn và làm vô hiệu hóa các gen kháng của thực vật [37, 57]. 4 1.1.2. Triệu chứng, điều kiện phát sinh và phát triển bệnh Triệu chứng Các triệu chứng của bệnh đạo ôn trên lúa bao gồm các tổn thương có thể tìm thấy ở hầu hết các bộ phận của cây như: lá, cổ lá, cổ bông, bông, gié, hạt (Hình 1.2). Trên bề mặt vết bệnh đều có thể hình thành bào tử trông giống như lớp mốc xám hoặc màu ánh bạc [53]. Hình 1.2.Triệu chứng vết bệnh đạo ôn trên cây lúa A: đạo ôn trên lá, B: đạo ôn cổ lá, C: đạo ôn cổ bông, D: đạo ôn trên hạt + Trên lá: Lúc đầu vết bệnh chỉ nhỏ như đầu mũi kim, màu xám xanh, sau chuyển sang màu nâu, rồi lan rộng dần ra thành hình thoi, xung quanh màu nâu đậm, giữa màu xám trắng. Nếu nặng, nhiều vết liên kết lại với nhau tạo thành mảng lớn, có thể làm lá bị khô cháy, cây lúa lụi tàn, gây thất thu năng suất nghiêm trọng. + Trên cổ lá: Vết bệnh hình khum theo chiều cong giữa cổ lá và phiến lá, từ cổ lá vết bệnh sẽ lan ra bẹ lá và phiến lá làm cho lá lúa bị khô lụi và gãy gục. Nấm sản sinh ra các bào tử ngay trên các tổn thương này. + Trên cổ bông và bông: Gây thiệt hại nghiêm trọng nhất, trên cổ bông và gié lúa ban đầu xuất hiện các đốm nhỏ sau lan ra theo chiều dài làm cả đoạn cổ bông có màu nâu xám, khô tóp. Làm cho bông nhỏ, có nhiều hạt lép lửng, dễ gãy, gié dễ gãy rụng làm giảm năng suất, giảm chất lượng hạt gạo. + Trên hạt: Các vết bệnh không đặc trưng về hình dạng, màu nâu đen hoặc xám. Nấm có thể kí sinh cả ở vỏ trấu và bên trong hạt, làm hạt lúa bị lép, nếu bị 5 bệnh sớm, hạt lúa có thể bị lép hoàn toàn. Hạt giống bị bệnh là nguồn truyền bệnh sang vụ khác. Điều kiện phát sinh và phát triển bệnh Nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 25-28oC và độ ẩm không khí là 93% trở lên, bào tử nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 24-28oC, và có giọt nước. Ở điều kiện thời tiết âm u trong vụ lúa đông xuân, độ ẩm không khí bão hoà thuận lợi nhất cho nấm bệnh phát sinh, dễ xâm nhập vào cây. Ngoài ra, với biên độ nhiệt ngày và đêm chênh lệch nhau cũng làm gia tăng sự phát triển nấm bệnh.Một số nguyên nhân khác có thể từ giống lúa, đặc tính của giống lúa nhiễm bệnh (giống mẫn cảm) cũng là điều kiện cho bệnh phát sinh và dễ dàng lây lan trên diện rộng làm bùng phát dịch bệnh [8]. 1.1.3. Cơ chế tương tác giữa nấm M.oryzae và cây lúa Bệnh đạo ôn do nấm M. oryzae gây ra là một ví dụ điển hình về loại tác nhân gây bệnh có khả năng tiến hóa nhanh, là sinh vật mô hình được quan tâm nghiên cứu trong bệnh lý thực vật [2, 52]. Nghiên cứu di truyền ở mức độ phân tử về bệnh ở thực vật, theo các nghiên cứu của [21, 22, 36] cho thấy hệ thống miễn dịch bẩm sinh của thực vật có hai lớp. Lớp đầu tiên được điều chỉnh bởi các thụ thể ngoại bào, màng tế bào hoặc các thụ thể nhận dạng mẫu (pattern recognition receptors: PRRs). Khi tác nhân gây bệnh thâm nhập vào thành tế bào, các thụ thể ngoại bào sẽ nhận ra các mẫu phân tử của mầm bệnh (PAMPs: pathogen-associated molecular patterns). PRRs kích hoạt phản ứng miễn dịch yếu gọi là PTI (PAMP - Triggered immunity) làm ức chế sự xâm nhiễm của mầm bệnh. Tuy nhiên, tác nhân gây bệnh đã phát triển các effector (chất hiệu ứng) nhằm né tránh và ngăn chặn các PTI. Do vậy, thực vật tiếp tục khởi động phản ứng miễn dịch thứ hai được kích hoạt bởi tác nhân (ETI -Effector-triggered immunity). Khi đó, các protein của gen kháng bệnh (R) là các thụ thể (receptor) trong tế bào ở cây sẽ kích hoạt ETI và sẽ ngăn chặn sự xâm nhiễm của mầm bệnh. Phản ứng miễn dịch loại này diễn ra nhanh chóng, gây đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, thường được gắn kết với phản ứng siêu nhạy cảm (hypersensitive reaction: HR) [21, 6 22, 36]. Ở nấm đạo ôn Magnaporthe oryzae, đến nay đã có 15 loại tác nhân gây bệnh đã được xác định, bao gồm 9 tác nhân Avr (PWL1, PWL2, AvrPi-ta, AvrPiz-t, Avr-Pia, AvrPii, Avr-Pik/km/kp, Avr1-CO39, and ACE1) và 6 tác nhân mới được xác định là các protein: BAS1, BAS2, BAS3, BAS4, Slp1 và MC69 [35]. Theo [54], ở lúa đã có hơn 100 gen kháng đạo ôn R được xác định, trong đó có 35 gen đã được nhân dòng. Sự tương tác giữa gen R của cây và gen Avr của tác nhân gây bệnh rất đặc hiệu nên một chủng gây bệnh cụ thể (mang gen Avr cụ thể) có thể lây nhiễm bệnh cho một tập hợp các giống cây trồng (không mang gen kháng R tương ứng) [43]. Đây là mối tương tác gen-đối-gen, cụ thể các gen kháng R của cây mã hóa cho receptor giúp nhận diện các phân tử tác nhân effectordo các gen Avr mã hóa được tạo ra từ tác nhân gây bệnh. Khi đó làm khởi động phản ứng phòng thủ ở cây ký chủ, giúp ngăn chặn sự tấn công của tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên, các gen Avr của tác nhân gây bệnh có thể biến đổi để né tránh sự kiểm soát của các gen R thông qua sự đột biến hoặc tái tổ hợp loại bỏ các gen Avr tương ứng. Bên cạnh đó, cây cũng có thể đáp ứng với tác nhân gây bệnh bằng cách thay đổi gen kháng R nhằm nhận diện được các gen Avr mới. Do vậy, sự đồng tiến hóa của gen kháng R và gen gây bệnh luôn tiếp diễn trong tự nhiên [26]. 1.1.4.Tình hình bệnh đạo ôn hại lúa ở Việt Nam và trên thế giới Tình hình bệnh đạo ôn hại lúa ở Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh đạo ôn đã xuất hiện ở cả ba miền: Bắc, Trung, Nam. Do điều kiện khí hậu thời tiết nước ta nóng ẩm mưa nhiều tạo điều kiện thuận lợi cho nấm đạo ôn phát triển. Và kết hợp thêm việc lạm dụng thuốc hóa học trong công tác phòng trừ càng làm cho dịch bệnh thêm nghiêm trọng, khó kiểm soát. Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, vụ đông xuân 2003-2004 tổng diện tích lúa bị nhiễm đạo ôn ở miền Bắc là 202.998 ha, trong đó diện tích bị nhiễm đạo ôn lá là 178.147 ha (diện tích bị nặng là 4.348 ha), diện tích bị nhiễm đạo ôn cổ bông là 24.752 ha. Hầu hết các giống phổ biến trong sản xuất đều bị nhiễm đạo ôn với mức độ khác nhau: Khang dân18, Q5, Bắc thơm, VN10, DT10, DT11 v.v. Đồng bằng sông 7 Cửu Long (ĐBSCL) là vùng trồng lúa lớn nhất Việt Nam, khi bị nhiễm bệnh đạo ôn thiệt hại cho năng suất lúa ước tính giảm tới 20%. Một vài năm trở lại đây, trước những biến đổi bất lợi của điều kiện ngoại cảnh bệnh đạo ôn có nguy cơ bùng phát trên diện rộng và có thể phát triển thành dịch nếu không được phát hiện kịp thời, hầu hết các giống chất lượng đang trồng phổ biến (OM149, OMCS2000) đều bị nhiễm đạo ôn với các mức độ khác nhau. Trong vụ đông xuân 2005-2006, bệnh gây thiệt hại lớn ở hầu hết các địa phương (An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ) trên giống lúa OM1490, thiệt hại cho năng suất ước tính giảm từ 20-80%[7]. Trong những năm gần đây, bệnh đạo ôn thường xuất hiện gây hại lúa ở nước ta. Năm 2011, diện tích nhiễm bệnh đạo ôn lá là 243.803ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 5234ha, diện tích nhiễm bệnh đạo ôn cổ bông là 51681ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 653ha. Vụ xuân 2012, diện tích nhiễm bệnh đạo ôn lá là 133.459,62ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 5.218,4 ha, diện tích nhiễm bệnh đạo ôn cổ bông là 32.584,5ha trong diện tích nhiễm nặng là 746,4ha (Cục Bảo vệ thực vật, 2011). Như vậy, bệnh đạo ôn thường xuyên xảy ra với mức độ gây hại ngày càng nặng, trên nhiều vùng trồng lúa khắp cả nước. Đặc biệt ở những nơi diễn biến thời tiết phức tạp, thuận lợi cho bệnh đạo ôn phát sinh, phát triển, gây hại và lây lan trên diện rộng. Ở hầu hết các giống thương mại, các giống có năng suất và chất lượng gạo ngon đều bị nhiễm bệnh với mức độ thiệt hại khác nhau. Tình hình bệnh đạo ôn hại lúa trên thế giới Trong các stress sinh học, bệnh đạo ôn trên lúa do nấm M. oryzae gây ra là một trong những mối đe dọa nghiêm trọng nhất đối với nền an ninh lương thực thế giới. Theo ước tính đến năm 2030, sản xuất lúa gạo phải tăng sản lượng hơn 40% để đáp ứng nhu cầu của dân số toàn cầu [27]. Theo ước tính, với sản lượng lúa gạo bị thiệt hại do nấm đạo ôn gây ra (10-30%) có thể đủ để nuôi sống khoảng 60 triệu người trên thế giới mỗi năm [44]. Ở Trung Quốc, trong vòng 30 năm qua đã có hơn 3 vụ dịch bệnh đạo ôn bùng phát, thiệt hại khoảng 2,5 triệu tấn mỗi vụ. Ở một số nước sản xuất lúa gạo, ước tính dịch đạo ôn bùng phát với mức độ thiệt hại lên tới trên 50% ở Ấn Độ, 8 42,5% ở Nhật Bản và Indonesia là 70% tổng sản lượng [54]. Tại Nhật Bản, mặc dù đã áp dụng biện pháp trồng các giống địa phương mang nhiều gen kháng đạo ôn nhưng do sự xuất hiện những chủng mới có độc lực mạnh nên năng suất lúa gạo bị giảm đáng kể từ 20-100%. Theo New Strait Times (2012), tại Malaysia có gần 1.000ha lúa ở bang Kedah bị ảnh hưởng bởi dịch nấm đạo ôn. Mức độ ảnh hưởng đã giảm xuống trong năm 2004, nhưng sau đó bị tăng trở lại trong năm 2009. Đến năm 2011, có 30 ha ruộng lúa ở bang này đã bị thiệt hại nặng nề ngay trong thời kì lúa mới gieo trồng [39]. Mặc dù cây lúa là vật chủ của nấm đạo ôn, nhưng theo nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nấm M. oryzae còn có thể lây nhiễm sang các loại cây ngũ cốc khác và là tác nhân gây ra bệnh đạo ôn ở lúa mì–bệnh lần đầu tiên được báo cáo năm 1985 tại Paran của Brazil. Tháng 3 năm 2016, dịch bệnh đạo ôn trên lúa mì đã xuất hiện ở Bangladesh và phá hủy hơn 15.000 ha lúa mì. Bệnh đã tái phát trong năm 2017 và hiện đang đe dọa nền sản xuất lúa mì trên khắp Nam Á [38]. 1.2. Các kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm M.oryzae 1.2.1. Những nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, bệnh đạo ôn thường xuyên xảy ra và gây khó khăn, thiệt hại cho ngành trồng lúa. Nhưng cho đến nay chỉ có một số ít nghiên cứu về di truyền quần thể M. oryzae được thực hiện. Hiểu biết về cơ chế kháng của cây lúa, cũng như mức độ đa dạng di truyền của quần thể nấm M. oryzae trong một khu vực địa lý cụ thể là rất quan trọng. [32] đã sử dụng kỹ thuậtDNA fingerprinting xác định được 5 phân dòng đặc hữu với tổng số 15 nhóm di truyền từ 78 chủng thu thập tại hai tỉnh thuộc ĐBSHlà Thái Bình và Hà Tây và ba tỉnh Long An, Tiền Giang và Hậu Giang thuộc ĐBSCL. Trong số 5 nhóm di truyền thì có 4 nhóm đặc thù cho vùng ĐBSH và chỉ có một nhóm di truyền được phát hiện ở ĐBSCL, nhưng không tìm thấy nhóm di truyền nào chung cho cả hai vùng đồng bằng. Hơn nữa, không có mối liên hệ nào được tìm thấy giữa các nhóm di truyền và khả năng gây bệnh khi thử nghiệm trên các dòng lúa đẳng gen sử 9 dụng trong nghiên cứu này. Sự khác biệt này có thể do sự khác nhau giữa các giống lúa và điều kiện khí hậu ở hai vùng. Năm 2006, nhóm nghiên cứu của [42] đã sử dụng 160 chỉ thị AFLP để nghiên cứu mức độ đa dạng và tính gây bệnh của 123 mẫu nấm đạo ôn thu thập tại nhiều tỉnh thuộc ĐBSH. Kết quả cho thấy quần thể nấm đạo ôn tại ĐBSH rất đa dạng về di truyền, gồm ít nhất 7 nhóm, đại diện các nhóm có tính gây bệnh khác nhau trên các giống chỉ thị mang gen kháng. Các quần thể nấm phân lập trên các giống lúa nếp (nhóm japonica) khác với quần thể nấm phân lập trên các giống lúa tẻ (nhóm indica). Lần đầu tiên ứng dụng kĩ thuật Rep-PCR tại Việt Nam để phân tích mức độ đa dạng di truyền của các mẫu nấm đạo ôn được thu thập tại ĐBSH. Nhóm của [2] chỉ ra rằng phân tích Rep-PCR chứng tỏ quần thể nấm đạo ôn tại khu vực ĐBSH rất đa dạng về di truyền giống như các công bố trước đây. Nghiên cứu này đã xác định được 8 chủng sinh lý nấm M. oryzae và không có mối liên hệ rõ rệt giữa các cụm nấm được xác định bởi Rep-PCR với nguồn gốc địa lý, đặc điểm màu sắc tản nấm và chủng nấm. Ngoài ra, theo như [31] đã nghiên cứu về mức độ đa dạng di truyền của quần thể nấm đạo ôn ở đồng bằng sông Mê Kông. Bằng kỹ thuật Rep-PCR với bộ mồi Pot2 đặc hiệu nấm đạo ôn, kết quả chỉ ra rằng quần thể nấm đạo ôn tại đây cũng rất đa dạng và đang tiến hóa nhanh chóng. Sử dụng kỹ thuật RFLP với dò đa locus,ở nghiên cứu của [33] cho thấy quần thể nấm đạo ôn ở ĐBSH đa dạng hơn và khác với quần thể nấm đạo ôn ở đồng bằng Sông Mê Kông. Tuy nhiên, cả hai nghiên cứu này đều cho thấy không có mối liên quan rõ rệt giữa các nhóm nấm được xác định dựa trên kết quả phản ứng với bộ giống chỉ thị của Nhật Bản [31, 33]. Năm 2015, [6] đã tiến hành nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và độc tính của các chủng nấm gây bệnh đạo ôn ở Nam Trung Bộ. Nhóm đã sử dụng 12 chỉ thị RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền của 18 chủng M. oryzae đại diện cho các vùng sinh thái khác nhau ở Nam Trung Bộ. Dựa vào mức độ tương đồng về di truyền, 18 chủng nấm chia thành bốn nhóm chính. Nhóm A gồm bốn chủng nấm có hệ số tương 10 đồng di truyền dao động từ 0,58-0,77, trong đó chia thành hai nhóm nhỏ. Nhóm B gồm 4 chủng nấm, chia thành hai nhóm nhỏ và có hệ số tương đồng di truyền 0,58-0,76. Nhóm C gồm 8 chủng được chia thành 3 nhóm nhỏ và có hệ số tương đồng di truyền là 0,63-0,74. Nhóm D gồm hai chủng có hệ số di truyền khá cao là 0,74. Kết quả củanghiên cứu này có thể sử dụng làm cơ sở trong công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn tại các tỉnh Nam Trung Bộ. Tất cả những kết quả trên cho thấy sự biến đổi phức tạp và tiến hóa nhanh chóng của quần thể nấm đạo ôn, tiềm ẩn nguy cơ trong quá trình sản xuất lúa tại các vùng trồng lúa ở Việt Nam. Chính vì vậy, việc nâng cao kiến thức về đa dạng di truyền và tiến hóa của quần thể nấm M.oryzae ở Việt Nam là điều cần thiết và quan trọng trong chương trình chọn tạo giống kháng đạo ôn bền vững, hiệu quả. 1.2.2. Những nghiên cứu ở nước ngoài Trên thế giới đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền của quần thể nấmM. oryzae. Nhóm các nghiên cứu đặt nền móng đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật DNA fingerprinting (giám định vân tay di truyền) dựa vào trình tự lặp lại rải rác trong DNA. Ví dụ, tại Philippines, [13] đã giám định vân tay di truyền của 1.156 chủng thu được trên 38 giống lúa trồng trong hai vụ, kết quả cho thấy các chủng phân cụm lại vào 10 nhóm di truyền. Một số nghiên cứu khác cũng sử dụng cách tiếp cận này đã xác định được 2-10 nhóm di truyền ở Nhật Bản [31] và Việt Nam [32]. Ở Ấn Độ [29], Trung Quốc [14] và Thái Lan [56] phát hiện được hơn 50 phân dòng vô tính cho mỗi quốc gia. Năm 2007, [47] đã phân tích sự đa dạng di truyền của 55 chủng nấm đạo ôn Magnaporthe grisea thu thậpở Burkina Faso bằng cách sử dụng 108 chỉ thị RAPD. Kết quả của nghiên cứu đã xác định 5 nhóm di truyền chính (Mg-1, Mg-2, Mg-3 Mg-4 và Mg-5), trong đó Mg-1, Mg-2 và Mg-3 là các nhóm đại diện lớn nhất tương ứng với 30,9, 25,5 và 30,9% trong số 55 chủng được phân lập. Mg-4 và Mg-5 chiếm tỉ lệ tương ứng là 9,1% và 3,6%. Kết quả của nhóm khẳng định rằng RAPD PCR cung cấp một phương tiện nhanh chóng và tiết kiệm để phân tích cấu trúc di truyền quần thể nấm đạo ôn. 11