Tài liệu đánh giá hiệu quả phòng và trị bệnh của nanochitosan đối với bệnh mốc cam (neurospora crassa) trên nấm bào ngư xám (pleurotus sajor caju)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ HỒNG MAI ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH CỦA NANOCHITOSAN ĐỐI VỚI BỆNH MỐC CAM (Neurospora crassa) TRÊN NẤM BÀO NGƢ XÁM (Pleurotus sajor-caju) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ HỒNG MAI ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH CỦA NANOCHITOSAN ĐỐI VỚI BỆNH MỐC CAM (Neurospora crassa) TRÊN NẤM BÀO NGƢ XÁM (Pleurotus sajor-caju) LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 551/QĐ-ĐHNT ngày 21/6/2017 Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: 22/03/2018 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN VĂN HÒA PGS.TS TRANG SĨ TRUNG Chủ tịch Hội đồng: PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa Phòng Đào tạo Sau đại học: KHÁNH HÒA - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Đánh giá hiệu quả phòng và trị bệnh của nanochitosan đối với bệnh mốc cam (Neurospora crassa) trên nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajor-caju)” là công trình nghiên cứu của chính bản thân tôi và chƣa từng công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho đến thời điểm này. Khánh Hòa, ngày tháng Tác giả luận văn iii năm LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành luận văn này: Trƣớc hết tôi xin gửi đến Ban Giám hiệu trƣờng đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, Ban lãnh đạo Viện CNSH&MT đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi đƣợc hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu của mình. Sự biết ơn sâu sắc, kính trọng tôi xin đƣợc giành cho thầy PGS.TS Trang Sĩ Trung và TS. Nguyễn Văn Hòa đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học và thực hiện đề tài này. Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cám ơn! Khánh Hòa, ngày tháng Tác giả luận văn iv năm MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ iii LỜI CÁM ƠN...............................................................................................................iv MỤC LỤC ..................................................................................................................... v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................................ vii DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... x TRÍCH YẾU LUẬN VĂN ...........................................................................................xi MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về chitosan ............................................................................................................. 3 1.1.1. Cấu trúc của chitosan ........................................................................................... 3 1.1.2. Tính chất của chitosan ......................................................................................... 4 1.1.3. Ứng dụng của chitosan ........................................................................................ 7 1.2. Tổng quan về nanochitosan .................................................................................................... 9 1.2.1. Tính chất của nanochitosan .................................................................................. 9 1.2.2. Phƣơng pháp điều chế nanochitosan .................................................................. 10 1.2.3. Ứng dụng của nanochitosan ............................................................................... 12 1.3. Tổng quan về nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor-caju và nấm mốc cam Neurospora crassa ....................................................................................................... 17 1.3.1. Nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor -caju (Fr.) Sing . ......................................... 17 1.3.2. Giá trị dƣợc liệu của nấm bào ngƣ xám ( Pleurotus sajor-caju) ........................ 20 1.3.3. Giá trị dinh dƣỡng của nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajor-caju) ...................... 21 1.3.4. Nấm mốc cam Neurospora crassa ..................................................................... 23 1.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về ứng dụng phòng và trị bệnh nấm mốc của chitosan và nanochitosan ....................................................................................................... 24 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................... 24 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ....................................................................... 25 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 26 2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................................ 26 2.1.1. Chitosan ............................................................................................................. 26 2.1.2. Giống nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor-caju .................................................. 26 2.1.3. Nấm mốc cam Neurospora crassa ..................................................................... 26 v 2.1.4. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị........................................................................ 26 2.1.5. Địa điểm thử nghiệm in vitro và in vivo ........................................................................ 27 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................................... 27 2.2.1. Điều chế nanochitosan ....................................................................................................... 27 2.2.2. Phân lập và định danh loài nấm Neurospora crassa gây bệnh trên bịch phôi nấm bào ngƣ xám (Pleurotus cajor-sajo) ............................................................................ 30 2.2.3. Khảo sát hiệu quả của nanochitosan đến sự phát triển của Neurospora crassa trên môi trƣờng PGA trong điều kiện in vitro ở các nồng độ, độ deacetyl và khối lƣợng phân tử khác nhau ........................................................................................................ 30 2.2.4. Khảo sát hiệu quả của nanochitosan đến sự phát triển sinh khối của Neurospora crassa trên môi trƣờng PG trong điều kiện in vitro ở các nồng độ, độ deacetyl và khối lƣợng phân tử khác nhau.............................................................................................. 31 2.2.5. Khảo sát hiệu quả của nanochitosan đến khả năng phòng trị bệnh mốc cam Neurospora crassa trên các bịch phôi bào ngƣ xám trong quá trình ra quả thể ở Co, độ DD và Mw tốt nhất.................................................................................................................................... 32 3. Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 33 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................... 34 3.1. Phân lập và định danh nấm Neurospora crassa .............................................................. 34 3.2. Ảnh hƣởng của nanochitosan đến sự phát triển của Neurospora crassa trên môi trƣờng PGA trong điều kiện in vitro ở các nồng độ, độ deacetyl và khối lƣợng phân tử khác nhau .......................................................................................................................................... 35 3.3. Ảnh hƣởng của nanochitosan đến sự phát triển sinh khối của Neurospora crassa trên môi trƣờng PG trong điều kiện in vitro ở các nồng độ, độ deacetyl và khối lƣợng phân tử khác nhau ........................................................................................................................... 43 3.4. Khảo sát hiệu quả của nanochitosan+Ag+có DD >90% Mw=1,5.106 kDa ở nồng độ 150ppm đến khả năng phòng trị bệnh mốc cam trên các bịch phôi bào ngƣ xám trong quá trình ra quả thể ......................................................................................................................... 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 56 KẾT LUẬN ................................................................................................................. 56 KIẾN NGHỊ ................................................................................................................ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 57 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT PG : Potatoes Glucose CTS : Chitosan KLPT : Khối lƣợng phân tử PGA : Potatoes Glucose Agar Mw : Molecular weight (Khối lƣợng phân tử) kDa DD : Degree of Deacetylation (Độ deacetyl) MIC : Nồng độ ức chế tối thiểu C0 : Concentration (Nồng độ) MBC : Nồng độ ức chế tối đa CNP : Chitosan nanoparticiples (Hạt nanochitosan) TPP : Tripolyphosphate PSP : Polysaccharide peptide PSK : Polysacccharide krestin PPO : Polyphenol oxidase POD : Peroxidase E.coli : Escherichia coli S.typhimurium : Staphylococcus typhimurium S.choleraesuis : Salmonella choleraesuis S.aureus : Staphylococcus aureus N.crassa : Neurospora crassa P.sajor - caju : Pleurotus sajor – caju vii : Kilo Dalton DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan........................................................................ 3 Hình 1.2. Minh họa những cơ chế hấp thu dƣỡng chất ............................................... 15 Hình 1.3. Ảnh hiển vi nguyên tử lực (AFM) của tế bào S.choleraesuis sau khi xử lý với nanochitosan theo thời gian. Chƣa xử lý (A), xử lý 30 phút (B), xử lý 1 giờ (C), xử lý 1,5 giờ (D), xử lý 2 giờ (E), xử lý 3 giờ (F) .......................... 17 Hình 1.4. Nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor – caju .................................................... 19 Hình 2.1. Chitosan ở các DD và Mw khác nhau. .......................................................... 26 Hình 2.2. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp tạo gel ion. ............................................... 27 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm điều chế nanochitosan. ........................................... 28 Hình 2.4. Nanochitosan có DD=70-80% và Mw=2,3.106KDa ..................................... 28 Hình 2.5. Nanochitosan có DD=80-90% và Mw=1,5.106KDa ..................................... 28 Hình 2.6. Nanochitosan có DD>90% và Mw= 2,3.106KDa.......................................... 29 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nanochitosan có Co, DD và M w hiệu quả nhất. 31 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nanochitosan có Co, DD và M w hiệu quả nhất. ............................................................................................................. 32 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng PGA và hình thái hệ sợi, bào tử dƣới kính hiển vi. ................................................................................................. 34 Hình 3.2. Kết quả chạy điện di và giải trình tự nucleotide của nấm N.crassa. ............. 34 Hình 3.3. So sánh ảnh hƣởng tới tốc độ lan tơ giữa 5 nồng độ và 10 môi trƣờng nuôi cấy bằng phƣơng pháp Tukey. ..................................................................... 39 Hình 3.4. Trung bình đƣờng kính lan tơ cho từng nồng độ và từng môi trƣờng, ......... 39 Hình 3.5. Sự phát triển hệ sợi nấm Neurospora crassa trên môi trƣờng PGA có bổ sung các nanochitosan+Ag+ ở các DD, Mw khác nhau và nồng độ 150ppm 41 Hình 3.6. Sự phát triển hệ sợi nấm Neurospora crassa trên môi trƣờng PGA có bổ sung các nanochitosan ở các DD, Mw khác nhau và nồng độ 50ppm .......... 41 Hình 3.7. Thử nghiệm vòng kháng trên môi trƣờng PGA sử dụng nanochitosan ở DD>90%, Mw=1,5.106 kDa nồng độ 150ppm .............................................. 43 Hình 3.8. Sinh khối nấm ở các nồng độ khác nhau trên môi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan+Ag+ có DD=70-80% và Mw=2,3.106kDa. ............................. 46 viii Hình 3.9. Sinh khối nấm ở các nồng độ khác nhau trên môi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan +Ag+ có DD=80-90% và Mw=1,7.106 kDa............................. 47 Hình 3.10. Sinh khối nấm ở các nồng độ khác nhau trên môi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan +Ag+ có DD>90% và Mw=1,5.106 kDa .................................. 47 Hình 3.11. Sự phát triển sinh khối của nấm Neurospora crassa trên môi trƣờng PG có bổ sung các loại nanochitosan ở nồng độ 50ppm......................................... 48 Hình 3.12. Sự phát triển sinh khối của nấm Neurospora crassa trên môi trƣờng PG có bổ sung các loại nanochitosan+Cu2+ ở nồng độ 50ppm ............................... 48 Hình 3.13. Sự phát triển sinh khối của nấm Neurospora crassa trên môi trƣờng PG có bổ sung các loại nanochitosan+Ag+ ở nồng độ 50ppm ................................ 49 Hình 3.14. So sánh giữa năm nồng độ và 10 môi trƣờng bằng phƣơng pháp Tukey .. 49 Hình 3.15. Trung bình sự phát triển sinh khối cho từng nồng độ và môi trƣờng PG có bổ sung các loại nanochitosan . ................................................................... 50 Hình 3.16.Trại nấm bị nhiễm bệnh mốc cam Neurospora crassa. ............................... 52 Hình 3.17. Gây bệnh mốc cam trên các bịch bào ngƣ xám và điều trị bằng nanochitosan+Ag+ có DD >90% Mw=1,5.106 kDa....................................... 52 Hình 3.18. Khối lƣợng nấm thu đƣợc giữa nhóm bịch phôi gây bệnh đƣợc điều trị bằng nanochitosan+Ag+ có DD>90% và Mw=1,5.106 kDa và nhóm bịch phôi không bệnh.............................................................................................................. 55 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các dung môi thƣờng sử dụng để hòa tàn chitosan ....................................... 5 Bảng 1.2. Một số ứng dụng chitosan trong thực phẩm .................................................. 8 Bảng 1.3. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan, nanochitosan .............. 16 Bảng 1.4. Một số chất khoáng trong nấm bào ngƣ và nấm rơm (mg/100g nấm khô) ......... 22 Bảng 2.1. Bảng đo các thông số đánh giá tính chất của nanochitosan ......................... 29 Bảng 3.1. Tóm lƣợc số liệu thí nghiệm tốc độ lan tơ của nấm mốc Neurospora crassa ...... 36 Bảng 3.2. Phân tích phƣơng sai sự khác biệt giữa các nồng độ và môi trƣờng đến tốc độ lan tơ ....................................................................................................... 37 Bảng 3.3. Bảng phân tích phƣơng sai tƣơng tác giữa hai yếu tố nồng độ và môi trƣờng ..... 38 Bảng 3.4. Tóm lƣợc số liệu thí nghiệm sự phát triển sinh khối của nấm Neurospora crassa .......................................................................................................... 44 Bảng 3.5. Bảng phân tích phƣơng sai sự khác biệt giữa các nồng độ và môi trƣờng PG có bổ sung các loại nanochitosan đến sự phát triển sinh khối ...................... 45 Bảng 3.6. Phân tích phƣơng sai sự tƣơng tác giữa hai yếu tố nồng độ và môi trƣờng . 46 Bảng 3.7. Khối lƣợng nấm bào ngƣ xám thu đƣợc trên các bịch phôi gây bệnh đƣợc điều trị bằng nanochitosan+Ag+ có DD>90% và Mw=1,5.106 kDa và nhóm bịch phôi không gây bệnh ............................................................................ 53 Bảng 3.8. Bảng phân tích phƣơng sai sự khác biệt về năng suất nấm thu đƣợc ........... 54 x TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Chitosan (CTS) là một polymer sinh học có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, y tế. Chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm nhƣng không hòa tan đƣợc trong nƣớc nên khả năng ứng dụng còn nhiều hạn chế. Nanochitosan, nanochitosan mang các ion (đồng và bạc) đƣợc tạo ra bằng các phƣơng pháp khác nhau, có kích thƣớc nhỏ (nanomet), diện tích và điện tích bề mặt lớn nên hiệu quả kháng nấm vƣợt trội hơn nhiều so với chitosan.. Nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajor-caju) cũng giống nhƣ các đối tƣợng nông nghiệp khác luôn bị các loại nấm bệnh gây hại ảnh hƣởng đến năng suất. Vì vậy ngƣời trồng thƣờng sử dụng các loại hoá chất diệt nấm rất hiệu quả và thuận lợi nhƣng việc lạm dụng quá mức đã ảnh hƣởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm, đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng, gây ô nhiễm môi trƣờng và quan trọng hơn hình thành các dòng nấm kháng thuốc. Mục tiêu của đề tài là đánh giá hiệu quả của việc phòng và điều trị bệnh nấm mốc cam Neurospora crassa trên các bịch phôi nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajorcaju). Để đáp ứng đƣợc mục tiêu trên, đề tài đã tiến hành điều chế các loại nanochitosan ở các độ deacetyl (DD), khối lƣợng phân tử (Mw) khác nhau và mang thêm các ion bạc (Ag+) và ion đồng (Cu2+), sau đó pha loãng ở các nồng độ (C0) khác nhau (50, 75, 100, 125, 150 ppm). Tiến hành khảo sát hoạt tính tới tốc độ lan tơ, sự phát triển sinh khối, năng suất nấm thu đƣợc ở điều kiện in vitro và in vivo. Kết quả đã định danh đƣợc loài Neurospora crassa gây bệnh trên nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor-caju, điều chế đƣợc nanochitosan có kích thƣớc hạt nhỏ 386nm có hiệu quả ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm mốc cam Neurospora crassa. Kết quả thử nghiệm cho thấy nanochitosan+Ag+ có độ deacetyl (DD) >90%, khối lƣợng phân tử (Mw) 1,5.106 kDa và ở nồng độ 150ppm có tác dụng ức chế sự phát triển của đƣờng kính tản nấm, sinh khối nấm Neurospora crassa trong điều kiện in intro và in vivo. Từ khóa: nanochitosan, nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor-caju, nấm mốc cam Neurospora crassa xi MỞ ĐẦU Nấm đƣợc xem là sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên và an toàn bởi vì đƣợc sản xuất hoàn toàn hữu cơ thân thiện với môi trƣờng (Chiu et al. 2000) và đƣợc trồng khắp nơi trên thế giới đặc biệt ở khu vực Đông Nam Á, Ấn Độ, Châu Âu và Châu Phi. Các nghiên cứu cho thấy nấm chứa một lƣợng đáng kể chất xơ với hàm lƣợng protein cao (30-40% trọng lƣợng khô) và đƣợc coi là thực phẩm tốt cho ngƣời ăn chay (Manzi và ctv., 2001; Mattila và ctv., 2000). Kết quả nghiên cứu đã cho rằng nấm có tác dụng làm giảm cholesterol, điều hòa hệ thống miễn dịch và ức chế sự phát triển của khối u (Hossain và ctv., 2003; Zhang và ctv., 2001). Sản lƣợng trồng nấm nấm Bào ngƣ (Pleurotus spp.) chiếm 14,2% (6.161.000 tấn) tổng sản lƣợng nấm ăn trên thế giới (Chang, 1999). Tuy nhiên nấm bào ngƣ cũng nhƣ các loại nấm ăn khác gặp một số bệnh nhƣ vi khuẩn, các loại nấm mốc, côn trùng… ảnh hƣởng tới năng suất và chất lƣợng của nấm sau thu hoạch trong đó có bệnh nấm mốc cam Neurospora spp. gây bệnh trên nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajor-caju) (Thắng, 2006). Vì thế, để dập tắt nguồn bệnh ngƣời trồng thƣờng dùng thuốc trừ sâu tổng hợp và thuốc diệt nấm vì đây là biện pháp rẻ nhất, hiệu quả nhất. Tuy nhiên, các báo cáo gần đây cho thấy ảnh hƣởng xấu của việc sử dụng những hóa chất lên sức khỏe của ngƣời tiêu dùng và hiện tƣợng kháng thuốc của nấm bệnh, nhu cầu đặt ra nghiên cứu các sản phẩm sinh học có nguồn gốc tự nhiên nhằm mục đích an toàn cho ngƣời tiêu dùng và thân thiện với môi trƣờng (Errampalli, 2004; Gea và ctv., 2005). Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng, có nguồn gốc từ các thành phần cấu trúc vỏ các loài giáp xác nhƣ tôm, cua… Hợp chất này có khả năng hòa hợp sinh học và tự phân hủy cao (Richardson và ctv., 1999), có độc tính thấp, hoạt tính sinh học cao và đa dạng nhƣ kháng khuẩn, kháng nấm, tăng sinh tế bào, tăng cƣờng khả năng miễn dịch, giảm cholesterol trong máu, hạn chế sự phát triển của khối u, có tác dụng nhanh trên các vết thƣơng, vết bỏng (Jing và ctv., 1997). Theo một số công trình nghiên cứu đƣợc công bố trong những năm gần đây cho thấy, vật liệu chitin/chitosan ở dạng nano có vai trò đặc biệt quan trọng trong lĩnh vực y dƣợc và trong nông nghiệp. Việc sử dụng vật liệu nano trên cơ sở chitin/chitosan với vai trò chất mang và giải phóng thuốc đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng khá rộng rãi 1 là do khả năng hấp thụ thuốc cao và dễ đi vào trong cơ thể do có kích thƣớc nhỏ, vì vậy làm tăng hiệu quả của quá trình điều trị bệnh. Nanochitosan là các hạt chitosan có kích thƣớc nanomet. Do có kích thƣớc siêu nhỏ nên nanochitosan dễ dàng đi qua màng tế bào, diện tích và điện tích bề mặt cực lớn nên đƣợc ứng dụng nhiều trong sinh y học mang thuốc, vaccine, trong công nghệ sinh học làm vector chuyển gen (Agnihotri và ctv., 2004; Patel & Jivani, 2009; Trapani và ctv., 2009; Zhang và ctv., 2010), trong việc xử lí kim loại nặng và chất ô nhiễm hữu cơ trong nƣớc sinh hoạt (Ge & Huang, 2010; Tamura và ctv., 2010), trong nông nghiệp cho lúa đã hạn chế sâu bệnh nên không cần sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (Thiện và ctv., 2010). Xuất phát từ những lý do trên tôi quyết định thực hiện đề tài “Đánh giá hiệu quả phòng và trị bệnh của nanochitosan đối với bệnh mốc cam (Neurospora crassa) trên nấm bào ngư xám (Pleurotus sajor-caju)” do TS. Nguyễn Văn Hòa và PGS.TS Trang Sĩ Trung và hƣớng dẫn. 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chitosan 1.1.1. Cấu trúc của chitosan Chitosan là một dẫn xuất của chitin đƣợc hình thành khi tách nhóm acetyl (quá trình deacetyl hóa chitin) khỏi chitin nên chitosan chứa rất nhiều nhóm amino. Chitosan đƣợc phát hiện lần đầu tiên bởi Rouget vào năm 1859. Chitosan thƣờng ở dạng vẩy hoặc dạng bột có màu trắng ngà. 1.1.1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng đƣợc cấu tạo bởi các hợp phần glucosamin và N-acetylglucosamin thông qua liên kết β-glucozit-1,4. Chúng đƣợc tách chiết từ vỏ động vật giáp xác, là một trong những polymer sinh học phổ biến trên thế giới chỉ sau cellulose. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan (Trung, 2010). Tên hóa học của chitosan là: Poly-β-(1,4)-D-glucosamin, hay còn gọi là poly-β -(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose. Công thức phân tử: (C6H11O4N)n (C6H11O4N)n Phân tử lƣợng: Mchitosan= (161,07)n Tuy nhiên trong thực tế thƣờng có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử chitosan (khoảng 10%). Vì vậy công thức chính xác của chitosan đƣợc thể hiện nhƣ sau : Trong đó tỷ lệ phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa 3 Độ deacetyl của chitosan Độ deacetyl của chitin và chitosan là một thông số quan trọng, đặc trƣng cho tỷ lệ giữa 2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose với 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose trong phân tử chitin và chitosan. Chitin có độ deacetyl thấp còn chitosan có độ deacetyl cao, tức là chứa nhiều nhóm amino. D-D-A-D-D-A-A-D-D-D-A-D-D-A-D-D-A-APhân bố dạng random (rời rạc) của phân tử chitosan D-D-D-D-D-D-D-D-D-A-A-A-A-A-A-A-A-APhân bố dạng block (dạng khối) của phân tử chitosan Phân tử lƣợng của chitosan Phân tử lƣợng của chitosan là một thông số cấu trúc rất quan trọng, nó quyết định tính chất của chitosan nhƣ khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật. Chitosan có phân tử lƣợng càng lớn thì độ nhớt càng cao. Thông thƣờng, phân tử lƣợng của chitosan nằm trong khoảng từ 100.000 dalton đến 1.200.000 dalton (Li và ctv., 2000). Phân tử lƣợng của chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin và điều kiện deacetyl và thƣờng rất khó kiểm soát. Tuy nhiên, chitosan có phân tử lƣợng thấp thì thƣờng có hoạt tính sinh học cao hơn, thƣờng có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học. Chitosan có phân tử lƣợng lớn có khả năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt. Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào phân tử lƣợng. Chitosan có phân tử lƣợng thấp có độ nhớt từ 30–200 cps và chitosan có phân tử lƣợng lớn hơn 1 triệu Dalton có độ nhớt lên đến 3.000-4.000 cps. Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc vào độ deacetyl, cƣờng độ ion, pH và nhiệt độ. 1.1.2. Tính chất của chitosan Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng vảy có màu đục. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không hoà tan trong nƣớc, trong dung dịch kiềm. Nhƣng hoà tan trong dung dịch acid loãng, tạo thành dung dịch keo dƣơng. Nhờ đó, keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng nhƣ: Pb3+, Hg+,… 4 Bảng 1.1. Các dung môi thƣờng sử dụng để hòa tàn chitosan (Trung và ctv., 2010) Dung môi Nồng độ thƣờng sử dụng (%) Acid acetic 1-2 Acid fomic 1-2 Acid lactic 1-2 Acid propionic 1-2 Acid clohydric 0,25-0,5 Acid citric 5-10 Acid glutamic 1-3 Acid ascorbic 1-2 Không độc, tính tƣơng ứng sinh học cao và có khả năng phân hủy sinh học nên không dây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đến môi trƣờng. Chitosan là một polymer mang điện tích dƣơng nên đƣợc xem là một polycationic (pH < 6,5) có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm nhƣ protein, alginate, acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (- NH2). Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ sinh học, có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể (Bách, 2004; Trung, 2010; Richardson và ctv., 1999). Tính chất của chitosan nhƣ khả năng hút nƣớc, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm… phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa. Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, tạo phức với kim loại tốt hơn. Tƣơng tự, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan cao hơn ở các mẫu chitosan có độ deacetyl hóa cao. Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan Hoạt tính sinh học cao nhƣ kháng khuẩn, kháng nấm, tăng sinh tế bào, tăng cƣờng khả năng miễn dịch (Jing và ctv., 1997; Trung, 2010). 5 Chitosan không những ức chế những vi khuẩn gram âm gram dƣơng mà cả nấm men và nấm mốc (Devlieghere và ctv., 2004; Liu và ctv., 2001.; Tsai và ctv., 2004). Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc một vài yếu tố nhƣ loại chitosan sử dụng độ DD, Mw, pH môi trƣờng, nhiệt độ, sự có mặt của một số thành phần thực phẩm (No và ctv., 2002). Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó đã đƣợc nghiên cứu bởi một số tác giả trong đó cơ chế kháng khuẩn cũng đã đƣợc giải thích trong một số trƣờng hợp. Mặc dù chƣa có một giải thích đầy đủ cho khả năng kháng khuẩn đối với tất cả các đối tƣợng vi sinh vật, nhƣng hầu hết đều cho rằng khả năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ chitosan lên bề mặt tế bào (Chung và ctv., 2004; Liu và ctv., 2004). Trong đó, chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn gram âm tốt hơn vi khuẩn gram dƣơng (Helander và ctv., 2001). Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của nó đối với cả vi khuẩn Gram âm (Helander và ctv., 2001) và Gram dƣơng (Bae và ctv., 2006; Jeon và ctv., 2001; Kumar và ctv., 2004) là cơ sở để ứng dụng chitosan để tạo ra các chế phẩm bảo quản thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên (Aider, 2010). Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử, độ acetyl hóa (Jeon và ctv., 2001), pH (Holappa và ctv., 2006), nhiệt độ (Tsai và ctv., 1999), nồng độ (Wang và ctv., 2004) và dung dịch hòa tan (Qin và ctv., 2006). Hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất của chitosan đối với các loài nấm bệnh trên dâu tây sau thu hoạch đã đƣợc nghiên cứu bởi El Ghaout và cộng sự. Theo nghiên cứu này thì chitosan với 7,2% nhóm –NH2 đã giảm đƣợc sự phát triển của Botrytis cinerea và Rhizopus stolonifer, tác động kháng nấm rất tốt hơn ở nồng độ cao hơn. Trong một nghiên cứu tƣơng tự, Cuero và cộng sự nhận thấy Ncarboxymethylchitosan làm giảm quá trình tạo độc tố aflatoxin ở Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus hơn 90% , trong khi sự phát triển của nấm giảm đi ít nhất ½. Khả năng tạo màng của chitosan Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt, tính chất cơ lý của màng chitosan nhƣ độ chịu kéo, độ rắn, độ ngậm nƣớc, phụ thuộc nhiều vào phân tử lƣợng và độ deacetyl hóa của chitosan. Chitosan có độ deactyl cao có ứng suất kéo và độ giãn dài giới hạn cao hơn màng chitosan có độ deacetyl thấp; tuy nhiên, chúng có độ trƣơng nở thấp hơn. 6 1.1.3. Ứng dụng của chitosan Khả năng ứng dụng của chitosan theo nhiều hƣớng khác nhau, chẳng hạn nhƣ trong thực phẩm và dinh dƣỡng, công nghệ sinh học, khoa học vật liệu, thuốc và dƣợc phẩm, nông nghiệp và bảo vệ môi trƣờng, gần đây đƣợc sử dụng rất tốt trong liệu pháp gen. Mạng lƣới ion điện tích dƣơng cũng nhƣ sự hiện diện của nhiều nhóm chức năng làm cho phân tử chitosan là phân tử sinh học đƣợc chào đón. Ý nghĩa đối với y sinh học và điều trị của các dẫn xuất chitin/chitosan là một chủ đề quan tâm đáng kể của nhiều ngƣời trên khắp thế giới. Trong y tế, chitosan có tác dụng làm màng chữa bỏng, tá dƣợc độn làm trong cốm, tá dƣợc ổn định viên nén, thuốc trị viêm loét dạ dày tá tràng. Hỗn hợp chitosancollagen làm giảm cholesterol trong máu, giảm sự hấp thụ lipid. Chitin đƣợc làm da nhân tạo, thuốc diệt khuẩn, chỉ tiêu trong phẫu thuật. Trong nông nghiệp, chitosan đƣợc sử dụng để tăng cƣờng sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi trong đất, bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất và tăng cƣờng khả năng nảy mầm của hạt, giảm stress cho cây, kích thích sinh trƣởng và tăng năng suất thu hoạch. Đặc biệt chitosan đóng vai trò kích thích hệ miễn dịch của cây và sự hoạt động của enzyme chitinase. Trong nông nghiệp, oligochitosan làm thuốc tăng trƣởng thực vật và kích thích gây tạo kháng sinh thực vật, thuốc diệt nấm bệnh cho thực vật, gia tăng hệ số nhân và sinh khối tƣơi cho cây nuôi cấy mô. Với tính năng kháng khuẩn, kháng nấm và mang điện tích dƣơng, bề mặt tiếp xúc lớn nên chitosan liên kết với các điện tích âm trên bề mặt và dễ dàng đi qua màng tế bào của các loài vi sinh vật. Do đó, chitosan làm thay đổi tính thấm của màng tế bào dẫn đến màng vi sinh vật không thể trao đổi chất đƣợc mà chết. Vì vậy chitosan đƣợc ứng dụng nhiều trong việc bảo quản, chế biến nông sản, ví dụ nhƣ bảo quản thực phẩm và các loại hoa quả và rau (Duy và ctv., 2004), các loại thịt cá (Miên và ctv., 2003) lọc trong nƣớc quả. Trong công nghiệp thực phẩm, chitosan làm phụ gia thực phẩm duy trì hƣơng vị tự nhiên, ổn định màu, nhũ tƣơng, làm dày cấu trúc, màng bảo quản rau quả tƣơi, làm trong nƣớc ép, giữ màu sắc và hƣơng vị tự nhiên của sản phẩm. 7 Bảng 1.2. Một số ứng dụng chitosan trong thực phẩm (Trung và ctv., 2010) Ứng dụng Đối tƣợng Tạo màng chống Dâu, vải, nhãn, na, Loại Dạng Chitosan Dung dịch Chitosan Dung dịch Chitosan Dung dịch biến nâu, chống mất thanh long, xoài, cà nƣớc, hạn chế hao rốt, rau diếp. hụt lƣợng, trọng kháng nấm, bảo quản trái cây, rau. Kháng khuẩn, Thịt bò tẩm gia vị, kháng nấm, chống xúc xích heo, mực, oxi hóa trong quá cá… trình bảo quản và chế biến thịt cá, đậu phụ, bánh mì. Chitosan làm chất Nƣớc táo, nƣớc vải, trợ lắng, làm trong nƣớc chua, rƣợu… công nghệ sản xuất nƣớc quả và rƣợu. Trong công nghiệp in, chitosan làm chất keo cảm quang, trong công nghiệp nhuộm làm tăng độ màu vải nhuộm. Ngoài ra chitosan còn là vật mang các chất dinh dƣỡng cung cấp cho cây trồng. Một đặc tính quan trọng của nanochitosan là dễ dàng tạo phức với các hợp chất kim loại nhƣ Cu, Zn,… để hạn chế hoạt động của các chất này trong môi trƣờng hay liên kết với mycotoxin là độc tố do nấm tiết ra để hạn chế tác hại của nấm bệnh. Hoạt chất oligosaccharit, oligoglucan, peptidogulucan trong chitosan có vai trò bảo vệ cấu trúc màng tế bào kháng lại các nấm bệnh. Trong lĩnh vực thủy sản đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng chitin/chitosan, đặc biệt trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, đây chỉ là một số nghiên cứu và triển khai bƣớc đầu, còn hạn chế so với tiềm năng ứng dụng của chitin/chitosan trong lĩnh vực thủy sản. Chitin và chitosan đƣợc nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá 8 để kích thích sinh trƣởng, tăng miễn dịch và cải thiện môi trƣờng ao nuôi (Anderson & Siwicki, 1994; Wanichpongpan & Chandrkrachang, 2002). Ngoài ra, chitosan cũng đƣợc ứng dụng làm màng bao, làm chất kết dính để tăng độ ổn định của thức ăn tôm (Trung & Phƣợng, 2005; Phƣợng và ctv., 2008). Trong khoa học kĩ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuếch đại của kính hiển vi, xử lý nƣớc thải công nghiệp và sinh hoạt: thu hồi in kim loại, protein, phenol, thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm (Kumar, 2000; Rinaudo, 2006). Trong công nghệ sinh học, chitin, chitosan và dẫn xuất đƣợc trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào động, thực vât, cố định enzyme, cố định tế bào, làm chất mang DNA. Chitosan đƣợc ứng dụng khá phổ biến trong xử lý môi trƣờng nhờ khả năng hấp phụ, tạo phức với các ion kim loại (Pb3+, Hg+, Cd2+, Fe2+, Cu2+ …), các chất màu, khả năng keo tụ, tạo bông rất tốt với các chất hữu cơ. Do đó, chitin, chitosan đƣợc sử dụng nhƣ là một trong các tác nhân chính để xử lý nƣớc thải. 1.2. Tổng quan về nanochitosan 1.2.1. Tính chất của nanochitosan Chitosan đƣợc sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nanochitosan trong những năm gần đây vì những tính chất ƣu việt của nó ở kích thƣớc nano. Với nhiều tính năng nhƣ tƣơng thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại, nó trở thành nguyên liệu cho nhiều ứng dụng dƣợc sinh học, hạt nanochitosan trở thành hệ thống phân phối thuốc có tiềm năng lớn (Zhang và ctv., 2010). Nanochitosan do có kích thƣớc siêu nhỏ (từ 10-1000nm) nên dễ dàng đi qua màng tế bào, có thể đƣa vào cơ thể qua nhiều đƣờng khác nhau nhƣ dùng ngoài da, dùng qua đƣờng miệng, qua mũi…Nanochitosan có diện tích và điện tích bề mặt cực lớn nên đƣợc ứng dụng trong sinh y học nhƣ mang thuốc, vaccine, vector chuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều trị ung thƣ…Khi sử dụng nanochitosan làm chất dẫn thuốc, thuốc điều trị đƣợc bảo vệ bởi những hạt nanochitosan khỏi sự phân hủy sinh học. Do kích thƣớc rất nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể, đƣa thuốc đến mục tiêu, nâng cao hiệu quả điều trị (Tiyaboonchai, 2003). Trên thế giới, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục tiêu chế tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát triển vector chitosan hƣớng đích thuốc trên những tế bào ung thƣ. Một số công trình tiêu biểu là điều chế hạt chitosan composite với acid polyacrylic để điều khiển và kéo dài thời gian 9