Tài liệu đánh giá đa dạng di truyền và xác định marker phân tử đặc trưng nhận dạng một số mẫu sâm lai châu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -----------***----------- KHƯƠNG THỊ BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ ĐẶC TRƯNG NHẬN DẠNG MỘT SỐ MẪU SÂM LAI CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -----------***----------- KHƯƠNG THỊ BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ ĐẶC TRƯNG NHẬN DẠNG MỘT SỐ MẪU SÂM LAI CHÂU Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mãsố: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. KHUẤT HỮU TRUNG HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.Khuất Hữu Trung. Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung thực.Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó. Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình. Hà Nội, tháng năm 2018 Tác giả Khương Thị Bích i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Di truyền Nông nghiêp, các thầy giáo, cô giáo đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành khóa học này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Phó giáo sư - Tiến sĩ Khuất Hữu Trung - Phó viện trưởng - Viện Di truyền Nông nghiệp, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn: “Đánh giá đa dạng di truyền và xác định marker phân tử đặc trưng nhận dạng một số mẫu Sâm Lai Châu.” Tôi xin được cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất - trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình, đặc biệt là bố mẹtôi, những người luôn bên cạnh và hỗ trợ tôi về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập của mình. Nhân dịp này tôi cũng trân trọng cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp những người đã luôn bên cạnh, động viên, góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, tháng năm 2018 Tác giả Khương Thị Bích ii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT................................................................ v DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ẢNH............................................................................. vii PHẦN I: MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1 PHẦN II: NỘI DUNG..................................................................................... 4 Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4 1.1. Tình hình nghiên cứu cây Sâm Lai Châu trên Thế giới và ở Việt Nam ... 4 1.1.1. Tên gọi, phân loại và hình thái............................................................4 1.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố ..........................................................11 1.1.3. Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế ........................................................14 1.1.4. Các thành phần hoạt chất ở chi Panax ..............................................16 1.2. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm..................................... 19 1.3. Nghiên cứu bảo tồn và phát triển Sâm................................................. 21 1.4. Tổng quan phương pháp nghiên cứu về phân loại thực vật .............. 22 1.4.1. Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái..................................22 1.4.2. Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử ........................................23 Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 30 2.1. Vật liệu .................................................................................................... 30 2.2. Hóa chất .................................................................................................. 31 2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 31 2.3.1. Tách chiết ADN tổng số ....................................................................31 2.3.2. Chu trình PCR ...................................................................................32 2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose..............................................33 2.3.4. Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen..............................................34 2.3.5. Giải trình tự........................................................................................34 iii Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 35 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số............................................................ 35 3.2. Phân tích các sản phẩm khuếch đại của 25 mẫu nghiên cứu............. 36 3.3. Kết quả khảo sát trình tự vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 ở các mẫu nghiên cứu ..................................................................................... 36 3.4. Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 của các mẫu nghiên cứu........................................................................ 40 3.5. Kết quả xây dựng cây quan hệ phát sinh giữa 25 mẫu nghiên cứu........................................................................................................... 45 3.6. Kết quả xác định Marker phân tử phân biệt 25 mẫu Sâm nghiên cứu........................................................................................................... 51 PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................... 58 CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN............................................................................ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 60 PHỤ LỤC: TRÌNH TỰ 25 MẪU SÂM LAI CHÂU NGHIÊN CỨU....... 70 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragments Length Polymorphism cDNA Complementary deoxyribonucleic acid CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DMSO Dimethyl sulfoxide(CH3)2SO DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleoside triphosphates EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide ISSR Inter simple sequence repeat ITS Internal Transcribed Spacer PCR Polymerase chain reaction. Phản ứng nhân theo chuỗi RAPD Random Amplified Polymorphic DNA rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic acid SCAR Sequence Characterised Amplification Regions SSR Simple sequence repeats v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách 25 mẫu Sâm. ................................................................. 30 Bảng 2.2. Danh sách các mồi ITS sử dụng trong nghiên cứu......................... 31 Bảng 3.1. Độ dài các trình tự thuộc 25 mẫu Sâm nghiên cứu và mẫu tham chiếu KJ418192.1 ................................................................. 38 Bảng 3.2. Thành phần bốn loại nucleotide của 25 mẫu nghiên cứu và mẫu tham chiếu KJ418192.1 ......................................................... 39 Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền giữa 25 mẫu nghiên cứu và mẫu tham chiếu KJ418192.1 vào trình tự vùng ITS1-5,8SrRNAITS2................................................................................................ 46 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Sơ đồ vùng ITS của các gen rDNA vùng nhân và vị trí của các mồi ITS (Embong et al., 2008) .............................................. 29 Hình 3.1: Ảnh điện di ADN tổng số của 25 mẫu Sâm nghiên cứu................. 35 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 trên 25 mẫu Sâm với thang chuẩn Marker 100bp và mẫu đối chứng trắng (H2O) ........................................................................ 36 Hình 3.3: Một đoạn giản đồ có các đỉnh với 4 màu sắc khác nhau tương ứng với 4 loại nucleotide của mẫu Sâm PT7 ............................... 37 Hình 3.4: Kết quả gióng hàng, gióng cột 25 trình tự ITS1-5,8SrRNAITS2 của 25 mẫu Sâm và mẫu tham chiếu KJ418192.1 .............. 44 Hình 3.5. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 25 mẫu nghiên cứu ................................................................................................ 47 Hình 3.6. Cây quan hệ phát sinh giữa 25 mẫu nghiên cứu và mẫu tham chiếu KJ418192.1......................................................................... 48 vii PHẦN I: MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Tại các nước châu Á, Nhân sâm được coi là vị thuốc quý đứng đầu trong các loại thuốc quý đông y (sâm, nhung, quế và phụ). Nhân sâm có tác dụng kích thích nhẹ ở liều thấp làm tăng vận động, tăng trí nhớ nhưng tác dụng ức chế ở liều cao đối với hệ thần kinh; làm tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp hồi phục sức lực làm tăng sự thích nghi của cơ thể trước những bất lợi của điều kiện môi trường sống; tác dụng bảo vệ tế bào giúp hồi phục số hồng cầu, bạch cầu bị giảm; tác dụng tăng nội tiết tố sinh dục; tác dụng kháng viêm; tác dụng điều hoà hoạt động của tim; tác dụng hạ cholesterol máu, chống xơ vữa động mạch; tác dụng giải độc gan và tác dụng kháng khuẩn nhất là đối với Streptococcus gây bệnh viêm họng. Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus) có tên gọi khác là Tam thất hoang Mường Tè;Tam thất rừng; Tam thất đen. Năm 2013, loài cây này đã được công bố phát hiện tại Lai Châu và đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế và đăng ký mẫu DNA vào ngân hàng Genbank. Tính đến năm 2016 thì diện tích phân bố tự nhiên của Sâm Lai Châu đã giảm đáng kể chỉ còn lại rất ít trong rừng rậm nguyên sinh mưa mùa nhiệt đới chưa bị tác động hoặc tác động nhẹ thuộc vùng núi cao xã Pa Vệ Sử, xã Ka Lăng, xã Thum Lũm, xã Tá Bạ huyện Mường Tè, cây phân bố rải rác. Sâm Lai Châu có tác dụng tương tự như Nhân sâm: củ và thân rễ dùng làm thuốc bổ; tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sức lực bị suy giảm, kích thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc và bảo vệ gan, điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, chống xơ vữa động mạch, giảm đường huyết và có thể dùng làm thuốc trị viêm họng. Hiện nay, tại Việt Nam, Sâm Lai Châu còn lại rất ít trong tự nhiên. Chính vì vậy, việc bảo tồn và phát triển loại dược liệu quý báu này không chỉ 1 góp phần xoá đói giảm nghèo, tạo công ăn việc làm cho bà con vùng núi mà còn tạo nguồn dược liệu quý, sạch để cung cấp cho các công ty dược phẩm và người tiêu dùng. Để góp phần nghiên cứu bảo tồn loài cây quý hiếm này, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền và xác định marker phân tử đặc trưng nhận dạng một số mẫu SâmLai Châu”. 2. Mục đích nghiên cứu Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử để xác định nguồn gốc, mối quan hệ di truyền của các giống/loài Sâm Lai Châu, phân biệt Sâm Lai Châu với với loài khác cùng chi Panax; phục vụ cho công tác bảo tồn, chọn tạo giống và phát triển nguồn gốc dược liệu quý giá có giá trị kinh tế. Xác định được các chỉ thị/marker phân tử đặc trưng để nhận dạng một số nguồn gen Sâm Lai Châutrong tập đoàn nghiên cứu. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: 25 mẫu Sâm thu thập tại 5 địa điểm ở Lai Châu (Ka Lăng - Mường Tè, Pa Vệ Sử - Mường Tè, Thu Lũm - Mường Tè; Sìn Hồ; Tam Đường và Phong Thổ). - Thời gian thu mẫu: tháng 5 - 6/2017 - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2017 đến tháng 8/2018. - Địa điểm nghiên cứu: thực hiện các thí nghiệm phân tử tại Bộ môn Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp. 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học Hiểu biết về đa dạng di truyền ở mức phân tử của các mẫu Sâm Lai Châu thu được, là cơ sở để phân loại, tuyển chọn những nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn và lai tạo giống mới. Các marker phân tử nhận biết chính xác một số nguồn gen Sâm bản địa quý được sử dụng để xác 2 định tính đúng giống phục vụ công tác nhân giống và kiểm soát cây con giống ở giai đoạn sớm. Kết quả của đề tài rất có ý nghĩa trong việc xây dựng và tiêu chuẩn hoá phương pháp đánh giá nguồn gen làm cơ sở cho việc đăng kí bản quyền ở Ngân hàng gen thế giới, khẳng định chủ quyền Quốc gia về nguồn tài nguyên thực vật bản địa. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài góp phần thu thập các nguồn gen Sâm thu thập tại Lai Châu. Kết quả đề tài góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen Sâm Lai Châu của Việt Nam, phục vụ cho công tác chọn tạo giống mới, chuẩn hóa nguồn cây giống dược liệu góp phần nâng cao thương hiệu cho sản phẩm Sâm Lai Châu của Việt Nam ở khu vực và trên thế giới. 3 PHẦN II: NỘI DUNG Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu cây Sâm Lai Châu trên Thế giới và ở Việt Nam 1.1.1. Tên gọi, phân loại và hình thái v Tên gọi Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai) là cây thân thảo, củ và rễ được sử dụng làm thuốc từ rất lâu đời thuộc chi Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Các loài Nhân sâm được phân biệt dựa vào hình thái, màu sắc và được gọi theo tên địa phương; ví dụ một số loài Sâm chính như sau: - Panax vietnamensis Ha et Grushv.: sâm Việt Nam, sâm Ngọc Linh, sâm Nga Mi, mọc hoang dại, được trồng chủ yếu ở Kon Tum và Quảng Nam. - Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M. Feng: mọc hoang dại ở miền Nam Trung Quốc và Bắc Việt Nam. - Panax ginseng C.A. Meyer: sâm Triều Tiên, sâm Cao ly, nhân sâm, hồng sâm, là loài hoang dại, hiện nay rất hiếm, được trồng ở Đông Bắc, Châu Á. - Panax quinquefolius L.: sâm Mỹ, sâm Tây Dương, mọc hoang, được trồng ở vùng Bắc Mỹ. - Panax notoginseng F.H. Chen ex C.Y. Wu et K.M. Feng: sâm Trung Quốc, tam thất, điền thất, phân bố loài hoang dại chưa rõ, được trồng ở Vân Nam Trung Quốc. - Panax japonicus C.A. Meyer: sâm Nhật Bản, sâm lá tô, sâm đốt tre, mọc hoang dại ở Nhật Bản và Nam Trung Quốc. v Phân loại Phân loại Sâm Lai Châu: Giới : Plantae (Thực vật) Ngành : Magnoliophyta (Ngọc Lan) 4 Lớp : Magnoliopsida (Ngọc Lan) Bộ : Araliales (Nhân sâm) Họ : Araliaceae (Nhân sâm) Chi : Panax (Sâm) Loài :Panax vietnamensis Thứ loài: (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai) Theo Nguyễn Huy Sơn (2016) Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus) có tên gọi khác là Tam thất hoang Mường Tè;Tam thất rừng; Tam thất đen[6]. Loài cây này được Zhu và cộng sự đã mô tả là một thứ mới, bậc phân loại dưới loài của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis). Thứ này được phát hiện đầu tiên tại vùng Jinping, phía nam của tỉnh Vân Nam - Trung Quốc. Đây là cây dược liệu đặc hữu có giá trị thuộc chi Sâm (Panax), họ Ngũ gia bì (Araliaceae).Trong kết quả nghiên cứu của mình tác giả đã mô tả thu mẫu được cả quả chín đốm đen. Chi Sâm Panax L. gồm có 15 loài và dưới loài và hầu hết chúng là nguồn dược liệu cho y học cổ truyền như các loại Nhân Sâm, Nhân Sâm Hoa kỳ, Tam thất, Nhân Sâm Nhật bản và Sâm Ngọc Linh (Nguyễn Tập, 2005) [8].Mới gần đây nhóm nghiên cứu của Phan Kế Long et al., (2013) đã phát hiện thứ Panax vietnamensis var. fuscidiscus nói trên có phân bố ở tỉnh Lai Châu và được gọi tên là Sâm Lai Châu. Loài này có phân bố hẹp trên dãy núi Pu Si Lung và lân cận (Mường Tè và Tây Sìn Hồ, giáp biên giới với Trung Quốc) và dãy núi Pu Sam Cáp nằm giữa các huyện Sìn Hồ và Tam Đường với Thành phố Lai Châu, tỉnh Lai Châu. Sâm Lai Châu bị người dân bản địa khai thác, sử dụng làm thuốc và bán sang Trung Quốc, đang bị đe doạ tuyệt chủng ở mức độ trầm trọng (CR) (Phan Kế Long et al., 2013) [52]. 5 v Đặc điểm hình thái Chi Sâm Panax L. thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae)được mô tả sớm nhất và được ứng dụng phổ biến nhất.Chi Sâm được mô tả đầu tiên cho hai loài là P. quinquefolius L. và P. trifolius L. với đặc điểm khác biệt so với các chi khác trong họ là bầu 2 ô, hoa mẫu 5, xếp van hay xếp lợp (Linnaeus, 1754)[48].De Candolle (1830) đã sắp xếp một số loài thuộc chi Nothopanax vào chi Panax[23]. Tuy nhiên, Decaisne và Planchon (1854) lại cho rằng đặc điểm chính của chi Panax là đài xếp van, nên chuyển 2 loài P. quinquefolius và P. trifolius sang chi Aralia, đồng thời đồng nhất hoá các chi Polyscias Forest, Cheirodendron Nutt, Pseudopanax Koch và Maralia Pet. vào chi Panax[22].Như vậy, với cách phân loại như trên, các tác giả đã cho rằng đặc điểm hình thái của chi Panax bên cạnh đài xếp van còn có đặc điểm thân gỗ và thân thảo. Đồng ý với quan điểm trên, các tác giả Bentham và Hooker (1867), Clarke (1879) tiếp tục xác nhập chi Nothopanax vào chi Panax, đồng thời chuyển chi Panax vào tông (tribe) Panaceae[17], [19]. Seemann (1868) đã nghiên cứu sự khác biệt giữa chi Panax so với chi khác trong họ Araliaceae là: thân dạng củ, đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô. Dựa vào kết quả trên, tác giả đã chuyển 61 loài không có thân dạng củ ra khỏi chi Panax, đồng thời chuyển các loài có thân dạng củ trước đây ở các chi khác vào chi Panax, và chi này chỉ còn lại các loài: P. trifolium L., P. quinquefolius L., P. ginseng Mey., P. pseudoginseng Wall., P. japonicus Mey. và P. bipinnatifidus Seem. Với loài P. fructicosus có đặc điểm là đài xếp van, tác giả xếp vào chi Nothopanax và đồng thời lấy loài này là danh pháp cho chi Nothopanax (Seemann, 1868) [57]. Năm 1987, Harm cho rằng chi Panax có nguồn gốc từ chi Aralia dựa trên các đặc điểm của các loài Nhân sâm phân bố trên thế giới như: cơ quan sinh sản, cơ quan sinh dưỡng[32].Britton và Brown (1913) cho rằng loài P. quinquefolius được mô tả lần đầu tiên và có đặc điểm 6 đại diện cho chi Panax như thân dạng củ, hoa mẫu 5 xếp van hay xếp lợp, bầu 2 ô, nên lấy loài này để phân loại danh pháp cho chi [18]. Nhiều nghiên cứu cho rằng chi Panax có mối quan hệ gần gũi với chi Aralia(Hara 1970; Wen, 1993; Wen và Zimmer, 1996; Plunkett et al., 1996; Xiang và Lowry, 2007)[31], [65], [66], [54], [69]. Theo các tác giả, cách phân loại các loài thuộc chi Panax sẽ dựa vào hình thái của thân rễ (Rhizome type: thân rễ có dạng thân củ (carot type); thân rễ có đốt kéo dài; và thân rễ có đốt ngắn như đốt trúc); các đặc điểm cơ quan sinh dưỡng; đặc điểm hình thái, hình thái giải phẫu, hạt phấn và sinh học phân tử. Bên cạnh cách phân loại dựa trên các hình thái còn có một số nghiên cứu phân loại khác dựa trên thành phần hoạt chất và số lượng nhiễm sắc thể (Tsai và Feng, 1975; Yang, 1981) [63], [70]. Ví dụ, Tsai và Feng (1975) đã chỉ ra có 2 nhóm triterpenoid saponin chính tồn tại trong các loài Sâm khác nhau: Triterpenoid dammarane gồm có các loài: P. ginseng, P. notogingseng và Triterpenoid oleanane gồm các loài: P. pseudoginseng, P. zingiberensis, P. japonicus, P. japonicus var. angustifolius, P. japonicus var. major, P. japonicus var. bipinatifidus, P. stipuleanatus. Ngoài ra, kết hợp với các đặc điểm hình thái của thân rễ, các tác giả chia các loài Sâm ở Trung Quốc thành 2 nhóm chính: Nhóm 1 gồm các loài có thân rễ ngắn, giống thân củ cà rốt, hạt lớn, đồng thời hoạt chất chính là tetracyclic triterpenoid có trong thân rễ; Nhóm 2 gồm các loài có thân rễ dài hay dạng đốt trúc, hạt nhỏ, đồng thời có hoạt chất pentacyclic triterpenoid. Yang (1981) đã chỉ ra số lượng nhiễm sắc thể của 7 loài Sâm. Tác giả cũng cho rằng hai loài P. gingseng và P. quinquefolius không là tổ tiên của chi Panax vì 2n = 48 (44), mà tổ tiên của chi Panax phải là P. japonicus với bộ nhiễm sắc thể 2n = 24). 7 Tuy nhiên, số lượng các loàiSâm củachi Panax vẫn chưa rõ ràngvì một số tác giả xác định cùng một loài nhưng lại cho các kết quả khác nhau. Nhiều nghiên cứu xác định các loài Sâm đã sử dụngphương pháp hình thái học, tế bào học, giải phẫu học, sinh lý học và sinh thái học (Woo et al., 2004; Yu et al., 2009; Jee et al., 2014; Bai et al., 2015; Kim et al., 2015) [68], [73], [35], [13], [40]. Sử dụng như đặc điểm hình thái để phân biệt giữa các loài có thể dẫn đến sự nhầm lẫn bởi vì các đặc điểm biểu hiện có thể là kết quả kết hợp của di truyền và môi trường (Jo et al., 2013) [37]. Hơn nữa, kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng để bổ sung thêm một mức độ phân loại các loài thông qua các nghiên cứu về DNA (Lim và Choi 1990; Lim et al., 1993; Hon et al., 2003) [46], [47], [33]. Để phân loại các loài thực vật, các kỹ thuật như RFLP, RAPD, AFLP và SSR đã được sử dụng. Trong đó các kỹ thuật marker SSR hoặc microsatellite có tiềm năng rất lớn do có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao, có thể phân biệt được sự sai khácmà không xác định được bằng các marker khác như RAPD và RFLP(Powell et al., 1996; Kim et al., 2007; Silva et al., 2013)[55], [42], [58].Những nghiên cứu ứng dụng marker SSR để đánh giá đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ di truyền, so sánh gen, lựa chọn trợ giúp của marker đã mang lại nhiều kết quả khả quan, vì bộ gen của Nhân sâm là rất lớn (3.12 tỷ cặp base) và có rất nhiều giống phát triển gần đây. Bảng 1.1 cho thấy việc phân loại các taxon thuộc chi Panax dựa vào đặc điểm hình thái với các kết quả rất khác nhau, đòi hỏi cần tiếp tục có những nghiên cứu về phân loại. 8 Bảng 1.1: Phân loại các taxon Panax ở Châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1996-2014 Hệ thống phân Loài loại Dựa trên hình thái Panax ginseng, P. japonicas, P.bipinnatifidus (Sichuan, China), P. và vùng omeiensis, P. bipinnatifidus (Hubei, ITS1-5,8S-ITS2 China), P. major ((Syn.: P. japonicus var. major; P. pseudoginseng subsp. himalaicus), P. wangianus (Syn.: P. japonicus var. angustifolius), P. sinensis, P. zingiberensis, P. pseudoginseng, P. notoginseng, P. stipuleanatus Dựa trên hình P. ginseng, P. aponicus, P. thái, các barcode bipinnatifidus, P. elegantior, P. ITS, barcode lục assamicus, P. shangianus, P. lạp và kỹ thuật variabilis, P. omeiensis,P. major, P. AFLP wangianus, P. sinensis, P. zingiberensis, P. vietnamensis, P. pseudoginseng, P. notoginseng,P. stipuleanatus Dựa trên hình Panax ginseng, P. japonicus (Japan), thái, trình tự gene P. japonicus (China), P. japonicus 18S rDNA và var. bipinnatifidus gene matK/trnK P. japonicus var. major, P. pseudoginseng subsp. Himalaicus, P. japonicus var. angustifolius, P. zingiberensis, P. vietnamensis, P. vietnamensis var. fuscidiscus, P. pseudoginseng, P. notoginseng, P. stipuleanatus 9 Nguồn Wen và Zimmer (1996)[66] Zuo et al., (2011, 2014)[75], [76] Shu et al., (2003) [61] Ở Việt Nam, loài cây này đã được công bố phát hiện tại Lai Châu năm 2013 và đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế và đăng ký mẫu DNA vào ngân hàng Genbank. Tính đến năm 2016 thì diện tích phân bố tự nhiên của Sâm Lai Châu đã giảm đáng kể chỉ còn lại rất ít trong rừng rậm nguyên sinh mưa mùa nhiệt đới chưa bị tác động hoặc tác động nhẹ thuộc vùng núi cao xã Pa Vệ Sử, xã Ka Lăng, xã Thum Lũm, xã Tá Bạ huyện Mường Tè, cây phân bốrải rác. Sâm Lai Châu là cây thảo, sống nhiều năm, cao 40-80 cm. Thân rễ hợp trục, nằm ngang hay hơi chếch, mập, nạc có nhiều chỗ lõm do vết thân để lại; ít khi phân nhánh; đường kính củ 1,5-3 cm. Mỗi cây thường có 1 thân mang lá, ít khi 2 hoặc 3 trừ trường hợp đầu thân rễ bị tổn thương, sau phân nhánh và mọc lên số chồi thân tương ứng. Thân đơn độc, vỏ màu đen hoặc lục, mọc thẳng đứng, nhẵn, cao 0,3m (khi chưa có hoa); 0,7m (khi có hoa); khi tươi đường kính 0,3-0,6 cm, mặt cắt ngang hình tròn hay hơi có 3 cạnh, xốp ở giữa khi tươi, rỗng khi khô. Lá kép chân vịt, gồm 3-4 cái có khi lên đến 5-6 cái, mọc vòng ở ngọn; có cuống dài 5-10 cm. Lá chét 5; có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, nhọn 2 đầu, 5-13 x 2-4 cm; mép có răng cưa, hoặc ở một số ít cây non có thể gặp dạng xẻ lông chim nông, mép của thuỳ nông cũng khía răng cưa; thường có lông ở gân mặt trên lá. Mùa ra hoa tháng 4-5, quả tháng 7-9 (10). Tái sinh chủ yếu tự nhiên bằng hạt. Thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc lên từ đầu thân rễ vào đầu mùa xuân năm sau. Cây Sâm Lai Châu có phân bố tập trung chủ yếu ở tỉnh Lai Châu, cây có cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn, hiếm khi có thêm 1 tán phụ, nhỏ. Cuống cụm hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, giữa vòng lá cao tán lá, dài đến 25 cm, gấp 1,5-2 lần cuống lá. Cụm hoa có dạng hình cầu. Lá hoa tổng bao hình tam giác hẹp, dài khoảng 2mm, mép nguyên. Cuống hoa dài 1-1,5cm, mang dày đặc 10 nhú mịn, mọng chất tiết giống như trên cuống cụm hoa. Cụm hoa có đường kính 2,5-4cm. Số hoa trên 1 tán từ 70-100 hoa, có khi hơn tuỳ vào kích thước và tuổi cây, nhưng tỷ lệ đậu quả thấp, chỉ đạt từ khoảng 40-50%. Hoa màu vàng xanh nhạt, 5 lá đài nhỏ; 5 cánh hoa; 5 nhị; bầu 2 ô, có đầu nhuỵ thường chẻ đôi. Nhị đực màu trắng, chỉ nhị hình sợi, dài khoảng 2,5mm; bao phấn hình thuôn ngắn, dài khoảng 1mm. Đĩa tuyến mật trên đỉnh bầu thoạt đầu hơi hình nón, sau dẹt dần, toàn bộ màu mận chín. Thường có đến 80% số lượng hoa chỉ có một ô cùng một vòi nguyên phát triển, ô còn lại sớm bị tiêu giảm. Quả mọng, gần hình cầu dẹt (thận) dẹt theo hướng lưng bụng, đường kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ có chấm đen. Có 1 hạt, gần giống hạt đậu tròn, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt. 1.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố Trong vùng phân bố, Sâm mọc tự nhiên dưới tán rừng có độ cao từ 1500m trở lên, phù hợp với điều kiện khí hậu ôn hòa, mát mẻ quanh năm. Nhiệt độ trung bình từ 200C đến 250C, tổng tích ôn từ 7200-75000C/năm. Nhiệt độ tối thấp trên 50C và nhiệt độ tối cao là 330C, nhiệt độ quá cao và thấp sẽ ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây. Hạt Sâm có thể mọc mầm trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời kỳ hạt Sâm mọc yêu cầu nhiệt độ từ 100C trở nên. Cây Sâm mọc tự nhiên dưới tán rừng nên yêu cầu về độ ẩm không khí và độ ẩm đất tương đối cao từ 80% đến 90% so với độ ẩm tối đa. Ở thời kỳ sinh trưởng, thân khí sinh yêu cầu độ ẩm cao, lượng mưa trung bình từ 200-250 mm/tháng. Ngoài ra, trong quá trình sinh trưởng của cây, các yếu tố như mưa dông, mưa đá, sương muối đều không thích hợp, gây tổn hại đến cây. Chế độ ánh sáng, đặc biệt là chất lượng ánh sáng và thời gian chiếu sáng rất quan trọng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Sâm. Chế độ ánh sáng trực xạ chiếm 10% và tán xạ chiếm 90% là ánh sáng được xem là thích hợp nhất cho sinh trưởng của cây. Cây Sâm phát triển tốt dưới tán rừng, nơi đất đai tơi xốp, 11