Tài liệu đặc điểm phân tử gen vp2 của virut parvo trên lợn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN HÙNG CƯỜNG ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN VP2 CỦA VIRUT PARVO TRÊN LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN HÙNG CƯỜNG ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN VP2 CỦA VIRUT PARVO TRÊN LỢN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 02 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY Hà Nội – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nêu trong Luận văn chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các số liệu, ví dụ và trích dẫn trong Luận văn đảm bảo tính chính xác, tin cậy và trung thực. Tôi đã hoàn thành tất cả các môn học và đã thanh toán tất cả các nghĩa vụ tài chính theo quy định của Phòng Đào tạo sau Đại học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật. Vậy tôi viết Lời cam đoan này đề nghị Phòng Đào tạo sau Đại học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật xem xét để tôi có thể bảo vệ Luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! NGƯỜI CAM ĐOAN Nguyễn Hùng Cường 1 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Diệu Thúy, Trưởng phòng Công nghệ gen động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ chỉ bảo tận tình về chuyên môn và sự động viên chân thành của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ gen động vật, Viện Công nghệ sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cô Phòng Đào tạo sau đại học - Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày… tháng … năm 2018 Học Viên NGUYỄN HÙNG CƯỜNG 2 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................1 NGƯỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................1 LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................2 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................5 MỞ ĐẦU .......................................................................................................................10 NỘI DUNG....................................................................................................................12 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................12 1.1. Khái quát về hội chứng gây suy giảm sinh sản ở lợn (PPV - Porcine parvovirut)12 1.1.1. Sự phát hiện và phát sinh dịch bệnh của bệnh PPV ...........................................12 1.1.2. Triệu chứng lâm sàng .........................................................................................12 1.1.3. Đường truyền lây của virut .................................................................................13 1.2. Tổng quan về virut PPV (Porcine Parvovirut) ......................................................15 1.2.1. Đặc điểm của virut..............................................................................................15 1.2.2. Cấu trúc virut ......................................................................................................15 1.3. Các phương pháp phát hiện PPV ...........................................................................16 1.3.1. Chẩn đoán lâm sàng............................................................................................17 1.3.2. Phân lập virut .......................................................................................................17 1.3.3. Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học ...........................................................17 1.3.4. Phương pháp chẩn đoán dựa trên nguyên lý PCR ..............................................18 1.4. Tình hình nghiên cứu di truyền PPV trên thế giới ................................................20 1.4.1. Biến đổi di truyền trên protein cấu trúc VP2......................................................20 1.4.2. Phân loại PPV .....................................................................................................22 1.5. Tình hình nghiên cứu PPV ở Việt Nam .................................................................27 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................29 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .........................................................................29 2.2. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................29 2.2.1. Mồi sử dụng ........................................................................................................29 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất..............................................................................30 2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................31 2.3.1. Tách ADN tổng số ..............................................................................................31 2.3.2. Điện di ADN trên gel agarose ............................................................................32 2.3.3. Phương pháp PCR khuếch đại gen phát hiện virut PPV và khuếch đại đoạn gen VP2 ................................................................................................................................33 2.3.4. Tinh sạch đoạn gen để giải trình tự ....................................................................33 3 2.3.5. Phân tích trình tự gen và axit amin tương ứng của các chủng PPV ...................34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................................35 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ............................................................................35 3.2. Kết quả PCR phát hiện virut PPV .........................................................................35 3.3. Kết quả nhân gen VP2 của virut PPV1 .................................................................40 3.4. Kết quả giải trình tự đoạn gen VP2 của virut PPV1 .............................................41 3.4.1. So sánh sự khác nhau về trình tự nucleotit của VP2 của virut PPV1 .................41 3.4.2. So sánh sự khác nhau về axit amin của VP2 ......................................................44 3.4.3. So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotit và axit amin suy diễn của đoạn gen VP2 .........................................................................................................................47 3.5. Phân tích cây phả hệ của PPV ở đoạn gen VP2 ....................................................48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................................50 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................51 PHỤ LỤC ......................................................................................................................56 4 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic ARN Ribonucleic acid Axit Ribonucleic bp Base pair Cặp bazơ cs cs Cộng sự aa Amino acid Axit amin nt Nucleotide Nucleotit Deoxyribonucleic acid Deoxynucleoside triphotphat dNTP triphosphate LB Loading buffer Đệm tra mẫu Number Số lượng mẫu PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase ORF Open reading frame Khung đọc mở Nsp Non-structural protein Protein không cấu trúc PPV Porcine Parvovirus Virut PPV PCV2 Porcine Circovirus type 2 Virut Cirro loại 2 RNase Ribonuclease Ribonucleaza TBE Tris – EDTA Đệm TBE Tris boric acid - EDTA Đệm TE n TE 5 µg Microgram Mi – cro – gam µl Microlitre Mi – cro – lít single-strand DNA ADN sợi đơn Viral coat and capsid Proteins Gen mã hóa capsid protein ssDNA VP 6 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại các chủng PPV lưu hành trên thế giới ................................ 22 Bảng 2.1. Trình tự mồi dùng để khuếch đại gen ................................................. 29 Bảng 2.2 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm................................................... 30 Bảng 2.3. Các dung dịch đệm cần pha ................................................................ 30 Bảng 2.4. Các các hóa chất sử dụng.................................................................... 31 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR ................................................................. 33 Bảng 2.6. Chu trình nhiệt PCR............................................................................ 33 Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm PPV1, PPV2, PPV3 phân lập ở VN ............................... 38 Bảng 3.2. Tỷ lệ đồng nhiễm PPV ........................................................................ 39 Bảng 3.3. Vị trí axit amin của VP2 ở các chủng PPV châu Âu, châu Á và Việt Nam ............................................................................................................................. 46 Bảng 3.4. Tỷ lệ phần trăm tương đồng về trình tự nucleotit (phía trên đường chéo) và axit amin suy diễn (phía dưới đường chéo) của gen VP2 .................... 47 7 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh thai gỗ do lợn nái nhiễm PPV. ............................................ 13 Hình 1.2. Các mốc thời gian chính của sự nhiễm virut PPV và đáp ứng miễn dịch (Meszaros và cs., 2017) ............................................................................... 14 Hình 1.3. Cấu trúc của Parvovirut (viralzone.expasy.org) ................................. 15 Hình 1.4. Cấu trúc hệ gen Parvovirut điển hình (viralzone.expasy.org) ............ 16 Hình 1.5. Cấu trúc ba chiều gen VP2 của virut PPV (Streck và cs., 2011). ....... 21 Hình 1.6. Cây phả hệ di truyền dựa trên trình tự bộ gen capsid các chủng thuộc PPV1, PPV2, PPV3 và PPV4 phân lập từ lợn nuôi và lợn rừng (Cadar và cs., 2012) ............................................................................................................................. 24 Hình 1.7. Bản đồ các chuỗi gen capsid giả định của PPV1, PPV2, PPV3 và PPV4 cho thấy các đặc tính nucleotit và axit amin đặc trưng và cấu trúc thứ cấp dự đoán. Bản đồ được xây dựng bằng phần mềm Geneious 4.8.5 (Cadar và cs., 2013) .................................................................................................................... 26 Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành thí nghiệm .................................................. 31 Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số của mẫu phân lập. ............................................................................................................................. 35 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với kiểu gen PPV1 kích thước 194 bp. ............................................................................................................................. 35 Hình 3.3. Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen 194 bp bằng công cụ BLAST.... 36 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với kiểu gen PPV2 kích thước222 bp. ............................................................................................................................. 36 Hình 3.5. Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen PPV2 bằng công cụ BLAST ..... 37 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với kiểu gen PPV3 kích thước 392 bp ............................................................................................................................. 37 Hình 3.7. Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen PPV3 bằng công cụ BLAST ..... 38 Hình 3.8. Vị trí các đoạn mồi thuộc gen VP2 của virut PPV1 ........................... 40 Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen VP2-I có kích thước 841 bp. ............................................................................................................................. 41 8 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen VP2-II có kích thước 666 bp. ........................................................................................................................ 41 Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen VP2-III có kích thước 568 bp. ........................................................................................................................ 41 Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotit đoạn gen VP2 của các mẫu PPV phân tích .............................................................................................................. 42 Hình 3.13. Kết quả so sánh axit amin suy diễn trên gen VP2 của các mẫu phân tích ở Việt Nam với các chủng PPV phân lập từ các khu vực khác nhau trên thế giới. ..... 45 Hình 3.14. Cây phân loại di truyền các chủng PPV của đoạn gen VP2 ............. 49 9 MỞ ĐẦU Chăn nuôi lợn là một nghề truyền thống ở nước ta, nó đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân nói chung cũng như của mỗi gia đình nông dân Việt Nam nói riêng. Vai trò đó ngày càng được khẳng định trong giai đoạn hiện nay khi xã hội có nhu cầu càng cao về thịt để nâng cao chất lượng bữa ăn. Chúng ta đã nhập nhiều giống lợn ngoại có năng suất cao để cải tạo đàn lợn nội. Nhờ vậy mà ngành chăn nuôi lợn ngày càng phát triển. Tuy nhiên bệnh tật luôn là mối đe dọa cho bất cứ ngành chăn nuôi nào. Có rất nhiều bệnh truyền nhiễm, bệnh do ký sinh trùng làm thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi. Bên cạnh đó hội chứng suy giảm sinh sản do virut PPV gây nên cũng là một mối đe dọa cho sự phát triển của ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt là nuôi lợn sinh sản. Trong những năm gần đây hội chứng suy giảm sinh sản lợn do virut PPV đã nổi lên như một vấn đề cần quan tâm của ngành chăn nuôi lợn. Qua những biểu hiện suy giảm sinh sản của lợn và phân tích về dịch tễ học thì PPV được cho là một trong những tác nhân chính gây chết phôi và thai, dẫn tới suy giảm khả năng sinh sản. Ngoài ra PPV còn có thể làm tăng các ảnh hưởng bất lợi gây ra bởi virut PCV2 (Porcine Circoviral virus type 2) trong Hội chứng còi cọc sau cai sữa, gây ra những thiệt hại về kinh tế trong chăn nuôi lợn công nghiệp Thực tế cho thấy các tác nhân gây bệnh là virut ngày càng có sự biến đổi di truyền cao, do đó hình thành nên nhiều biến chủng/dòng khác nhau, gây khó khăn cho công tác chẩn đoán chính xác bệnh. Cho đến nay, các biện pháp khống chế bệnh được áp dụng ở nhiều nước bằng cách sử dụng vaccine nhưng vẫn chưa đem lại hiệu quả như mong muốn. Phương pháp PCR đã được sử dụng khá rộng rãi trên thế giới để đồng thời nhận diện, phân biệt nhiều loại virut hoặc các chủng/dòng khác nhau của virut PPV trong cùng một mẫu dựa vào kích thước đoạn gen được khuếch đại. Tuy nhiên, chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu về đặc trưng di truyền và trình tự nucleotit hệ gen PPV phân lập tại Việt Nam. Xuất phát từ thực tiễn và yêu cầu trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Đặc điểm phân tử gen VP2 của virut Parvo trên lợn”. 10 Mục tiêu của đề tài:  Giải trình tự toàn bộ gen VP2 của virut PPV phân lập tại Việt Nam.  Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ nucleotit và axit amin của các chủng virut PPV phân lập.  So sánh, đánh giá về quan hệ di truyền của các chủng virut PPV đang lưu hành tại Việt Nam với các chủng virut đã phân lập trước đây, các chủng nguyên thủy, các chủng đang lưu hành ở các vùng địa lý khác nhau trong khu vực và trên thế giới. Nội dung nghiên cứu:  Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện virut PPV.  Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn toàn bộ gen VP2 của virut PPV  Tối ưu điều kiện PCR.  Giải trình tự gen VP2 của virut PPV  Phân tích và so sánh số liệu về mức độ tương đồng/khác biệt về trình tự nucleotit/axit amin tương ứng của gen VP2 của các chủng PPV phân lập trong nước, so sánh với các chủng trong khu vực và trên thế giới.  Xây dựng cây phân loại di truyền dựa trên trình tự gen VP2 của các chủng PPV phân lập ở Việt Nam, cùng với các chủng trong khu vực và trên thế giới. 11 NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát về hội chứng gây suy giảm sinh sản ở lợn (PPV - Porcine parvovirut) 1.1.1. Sự phát hiện và phát sinh dịch bệnh của bệnh PPV  Trên thế giới Porcine Parvovirut (PPV) được công nhận là nguyên nhân gây ra suy giảm sinh sản hay còn gọi là hội chứng SMEDI (Stillbirth, mummification, embronic death and infertility: chết non, ướp xác, chết phôi và vô sinh) trên lợn vào cuối những năm 1960. Vì vậy, bệnh này thường được gọi với tên dân dã là “Bệnh thai gỗ” (Hình 1.1). Bệnh này được mô tả lần đầu tiên ở Đức và Mỹ vào năm 1965, sau đó là trên phạm vi toàn thế giới (Cartwright & Huck., 1967; Johnson., 1973; Joo và cs., 1976; Vannier., 1978). PPV được xem là tác nhân chính gây rối loạn sinh sản ở lợn ở hầu hết các nước trên thế giới (Straw, B.E., 2006).  Tại Việt Nam Trong những năm gần đây hội chứng suy giảm sinh sản lợn do virut PPV đã nổi lên như một vấn đề cần quan tâm của ngành chăn nuôi lợn. Bệnh gây ảnh hưởng đến các đàn lợn nái sinh sản. Tần số rối loạn sinh sản ở các lứa đầu cao hơn các lứa sau. Các vùng sinh thái khác nhau được cho là không có ảnh hưởng đáng kể tới tỷ lệ rối loạn sinh sản ở lợn nái. Kết quả xét nghiệm 4.166 mẫu huyết thanh lấy từ các trang trại lợn nái tỉnh Long An cho thấy số mẫu dương tính với virut PPV chiếm 69,5%. Phân tích 52 mẫu thai chết lưu đã phát hiện thấy có sự xuất hiện đồng thời của virut PPV và kháng thể PPV (Nguyễn Huỳnh., 2000). 1.1.2. Triệu chứng lâm sàng Dấu hiệu lâm sàng chính của lợn nái nhiễm PPV đặc trưng bởi hiện tượng sảy thai, đẻ non, thai hóa gỗ với nhiều kích thước khác nhau, chết phôi và giảm khả năng sinh sản (giảm lứa đẻ). Hầu hết các trường hợp nhiễm PPV đơn thuần không gây triệu chứng lâm sàng ở lợn trưởng thành hoặc lợn con. Độc lực của PPV được xác định bởi mức độ nghiêm trọng của sự suy giảm khả năng sinh sản mà nó có thể gây ra ở lợn nái. 12 Hình 1.1. Hình ảnh thai gỗ do lợn nái nhiễm PPV. (https://www.pig333.com/pathology-atlas/mummified-fetuses_56 ) Biểu hiện bệnh chỉ thấy ở lợn nái chửa, lợn nái sinh sản. Các kết quả nghiên cứu cho thấy 7 - 8 ngày sau khi lợn nái chửa bị nhiễm virut thì bị sốt kèm theo giảm lượng bạch cầu. Đây là kết quả của sự nhiễm trùng huyết. Trong thời gian này, virut có thể được phân lập từ máu và trong các mô tổ chức có khả năng sinh trưởng cao như niêm mạc phổi, tế bào gan, lách, thận, tinh trùng, nhau thai và bào thai. Ngay sau khi virut vào đến bào thai, chúng gây chết thai của nái chửa dưới 44 ngày. Các bào thai chết ở các nái này có thể bị phân huỷ và được hấp thụ ngược lại hoàn toàn nếu bào thai dưới 35 - 36 ngày tuổi. Lúc đó, lợn lại có thể động dục trở lại. Nếu virut vào sau 44 ngày kể từ khi mang thai thì quá trình chửa vẫn xảy ra bình thường nhưng khi đó sẽ có một số thai chết hoặc phát triển kém cho đến lúc sinh, trong khi đó một số thai vẫn phát triển bình thường. Phụ thuộc vào thời điểm nhiễm virút gây bệnh, nên lúc lợn đẻ ta có thể thấy có sự khác nhau lớn trong quá trình phát triển của bào thai của cùng 1 nái đẻ: khi thì bị thai khô, khi thì thai chết, một số con thì phát triển bình thường với các kích cỡ khác nhau. Lúc đẻ ra con thì chết yểu ngay sau khi đẻ, con sống bình thường. Đôi khi chúng ta cũng ghi nhận được một số nái bị sảy thai. Song sảy thai không phải là dấu hiệu điển hình của bệnh. 1.1.3. Đường truyền lây của virut Bệnh xảy ra chủ yếu trên lợn nái hậu bị, nái đã đẻ nhiều lứa và lợn đực dưới 70 - 80 ngày tuổi, đặc biệt với những con nái không có miễn dịch thường nhiễm PPV vào giai đoạn đầu của thai kỳ. Virut được tìm thấy trong dịch mũi, hạch, amidan, nước tiểu và phân. Đối với nái: virut thường xuất hiện ở màng niêm mạc âm hộ, trên lợn nọc: 13 virut thường ờng có ở dịch tinh hoàn và tinh trùng. Con đường ờng xâm nhiễm chính của PPV là qua mũi, miệng và đường sinh dục. Virut xâm nhiễm qua đường ờng mũi miệng hay đường ờng sinh dục, khoản khoảng 10 ngày sau trên lợn cái virut đi vào đường ờng máu gây giảm bạch cầu, và từ ngày 10 – 14 virut vào đến nhau thai. Virut có thểể xuyên qua màng nhau thai ở ngày thứ 30 sau khi thụ tinh và làm cho toàn bộộ số phôi bị lây nhiễm bị chết và hóa gỗ. Những nái bị nh nhiễm virut vào giai đoạn ạn cuối của thời kỳ mang thai có thểể không gây chết thai. Riêng đối với lợn đực, có thểể phát hiện thấy virut trong dịch tinh hoàn và tinh trùng khoảng 5 – 9 ngày sau khi nhiễm. ễm. Ngoài ra, bệnh có thể lây lan từ nọc sang lợn nái hoặc ng ngược lại do giao phối ối trực tiếp với heo mắc bệnh hoặc gieo tinh nhân tạo từ tinh dịch của nọc mắc bệnh. PPV cũng ũng truyền từ mẹ sang con qua nhau thai. Kết quả nhiễm trùng ở bào thai tùy thuộc vào thời điểm ểm nhiễm PPV trên lợn nái mang thai. Các nghiêm cứu thực nghiệm ệm và nghiên cứu dịch tễ chỉ ra rằng nhiễm PPV trong 6 tháng đầu của thai kỳ có thể dẫn đến việc sảy thai. Phôi thai lợn có khả năng miễn dịch sau ngày thứ 70 của thai kỳ. Sự lây truyền ền theo chiều dọc từ mẹ sang con thông qua nhau thai mất từ 12 đến 18 ngày, do đó nếu ếu lợn nái bị nhiễm PPV sau ngày thứ 56 của thai kỳ th thường không gây tổn hại cho đàn con. Hình 1.2. Các mốc ốc thời gian chính của sự nhiễm virut PPV và đáp ứng miễn dịch (Meszaros và cs., 2017) Hình 1.2 cho thấy ấy dòng màu xanh lá cây thể hiện thòi gian các kháng thể từ ccơ thểể lợn nái bảo vệ thai thụ động cho đến ến 22 tuần tuổi. Các con nái nên được tiêm chủng ngay sau khoảng ảng thời gian này khi các kháng thể bắt đầu ầu cạn kiệt, nhờ có sự tăng cường của vaccine con nái sẽẽ duy tri miễn dịch lâu dài. Dòng màu đỏ thể hiện 14 khoảng thời gian phôi dễ bị nhiễm virut PPV cho đến khi phát triển của khả năng miễn dịch ở sau ngày thứ 70 của thai kỳ (Meszaros và cs., 2017) Virut PPV có thể tồn tại được ở môi trường bên ngoài và truyền nhiễm bệnh trong nhiều tháng. Các dụng cụ chăn nuôi và chuồng trại bị ô nhiễm có thể là nguồn truyền nhiễm PPV liên lục. Loại virut này cũng có thể bám vào quần áo của người chăn nuôi và di chuyển từ trang trại này sang trang trại khác, và ngoài ra người ta cũng cho rằng các loài gặm nhấm có thể đưa tác nhân này vào các đàn gia súc mới (Streck và cs., 2011). 1.2. Tổng quan về virut PPV (Porcine Parvovirut) 1.2.1. Đặc điểm của virut Tác nhân gây bệnh là virut thuộc giống Parvovirut, phân họ Parvoviride nhiễm trên động vật có xương sống. Các nghiên cứu về dịch tễ và chẩn đoán đã chứng minh rằng PPV là nguyên nhân chính gây nên chết phôi và làm suy giảm sinh sản ở lợn. PPV là virut không vỏ, có kích thước nhỏ, hình dạng tròn, đường kính khoảng 18 26 nm, cấu trúc đối xứng 20 mặt (Hình 1.3). Đây là loại virut bền với các yếu tố môi trường, có thể chịu được ngưỡng pH rộng từ 3,0 - 8,0 có khả năng chịu nhiệt đến hàng giờ ở 80°C. PPV có đặc điểm không dễ dàng nhân lên trong điều kiện in vitro bởi vì virut này có xu hướng tạo ra nhiều tiểu phần tương tác khiếm khuyết đặc biệt trong trường hợp nuôi cấy với nồng độ cao hoặc nhiều lần cấy chuyển (Choi và cs., 1987). 1.2.2. Cấu trúc virut Hình 1.3. Cấu trúc của Parvovirut (viralzone.expasy.org) CP: capsid protein; ssDNA (single-strand DNA): ADN sợi đơn. Vật liệu di truyền của virut là ADN sợi đơn, mạch thẳng, âm, với kích thước phân tử khoảng 5kb (Molitor và cs., 1983). 15 Cấu trúc hệ gen điển hình của Parvovirut được trình bày ở hình 1.4. Hệ gen của PPV được đặc trưng bởi cấu trúc kẹp tóc (hairpin) ở hai đầu tận cùng 5’- 3’ (Bergeron và cs., 1993; Tattersalvà cs., 2006) và 2 khung đọc mở (Open reading frame – ORF) mã hóa cho protein không cấu trúc (non-structural protein – NSP) và protein vỏ capsid (VP). Đầu 3’ của ADN virut có cấu trúc hình dạng chữ Y giống với Parvovirut của loài gặm nhấm. Đầu 5’- chứa vùng lặp lại 127 về phía đầu C- của protein capsid. ORF1 mã hóa cho các protein không chức năng (NS1, NS2 và NS3) tổng hợp các enzyme có hoạt tính helicase và nickase cần thiết cho quá trình sao chép, có tính bảo tồn cao, ORF2 mã hóa cho các protein chức năng (VP1, VP2 và VP3) như capsid protein. VP1 và VP2 được dịch mã bởi các ARN khác nhau, trong khi đó VP3 được tạo nên do việc phân cắt protein từ VP2 (Molitor và cs., 1983; Ran và cs., 1989; Bergeron và cs., 1993). Hình 1.4. Cấu trúc hệ gen Parvovirut điển hình (viralzone.expasy.org) Non-structural ORF: Khung đọc mở mã hóa protein không chức năng StructuralORF: Khung đọc mở mã hóa protein chức năng NS: Gen mã hóa protein không chức năng; VP: Gen mã hóa capsid protein 1.3. Các phương pháp phát hiện PPV Phương pháp sinh học phân tử là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong chẩn đoán nhằm phát hiện một số đặc điểm của vật liệu di truyền (ADN, ARN) ở tác nhân bệnh, thường được sử dụng để sàng lọc nhanh, phát hiện, định type, định lượng, xác định tính kháng thuốc của các tác nhân bệnh, chủ yếu là virut và vi khuẩn. Bên cạnh ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu, phát hiệm sớm, thời gian xét nghiệm nhanh, chẩn đoán phân tử vẫn có một số nhược điểm như khả năng cho kết quả dương tính và âm tính giả, ý nghĩa lâm sàng của kết quả chẩn đoán trong một số 16 trường hợp không rõ ràng, thiếu tính thống nhất trong kết quả thu được từ các kit khác nhau, cần thiết bị đắt tiền và kỹ thuật viên lành nghề. Dưới đây là một số phương pháp cho phép phát hiện và chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh. 1.3.1. Chẩn đoán lâm sàng Heo nái bị bệnh thường không có dấu hiệu lâm sàng rõ ràng. Một số biểu hiện có thể nhận thấy là nái đẻ ra ít con, tỷ lệ đẻ thấp (36 %), số con ít (dưới 5 con) hoặc đẻ ra với nhiều thai khô. Nhiều trường hợp heo sinh con ra bị chết. Các dấu hiệu rối loạn sinh sản thường thấy là phối nhiều lần không đậu thai, chậm động dục hoặc heo nái đang mang thai có thể động dục trở lại và có biểu hiện động dục không thường xuyên, sẩy thai và tăng số lượng thai khô hoặc số đẻ non, kéo dài thời gian mang thai, đẻ không có con. Tùy theo giai đoạn nái mang thai bị nhiễm mà số lượng thai bị tiêu biến, thai khô, thai chết hoặc đẻ ra yếu ớt có thay đổi khác nhau. Sự nhiễm bệnh ở con đực không gây ảnh hưởng gì đến khả năng sinh dục của chúng, nhưng là nguồn lây lan bệnh qua tinh dịch. Vì vậy, cần phải Kiểm tra định kỳ tinh dịch để loại bỏ các heo đực nhiễm PPV tránh lây truyền cho heo nái qua đường giao phối. 1.3.2. Phân lập virut Virut PPV thường được phân lập từ nhiều mẫu bệnh có biểu hiện lâm sàng khác nhau bao gồm: huyết thanh, tinh dịch, màng tế bào, máu, tim, gan, phổi, lá lách… Trong đó dịch thu nhận từ phổi và huyết thanh là những mẫu dùng để phân lập virut tốt nhất khi có dịch PPV bùng nổ. Môi trường phân lập virut chủ yếu là môi trường MARC-145. Virut được nhận diện và phân loại bằng nhuộm màu miễn dịch với kháng huyết thanh đặc hiệu. Việc phân lập thành công virut PPV phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện lấy mẫu, giai đoạn lấy mẫu. 1.3.3. Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học Có nhiều nghiên cứu để pháp hiện các kháng thể trong huyết thanh đối với virut PPV. Phản ứng kháng thể huỳnh quang trực tiếp (Indirect fluorescent antibody - IFA); trung hòa virut huyết thanh (Serum virut neutralization - SNV); xét nghiệm đơn lớp kỹ thuật ôxyhóa (Immunoperoxidase monolayer assay - IMPA) và kỹ thuật xét nghiệm ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay - ELISA) tất cả đều có thể được sử dụng cho việc phát hiện kháng thể đặc hiệu với virut PPV. Phản ứng IFA, SNV và ELISA được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các phòng thí nghiệm ở miền nam 17 nước Mỹ trong khi đó, IMPA được sử dụng nhiều hơn ở Châu Âu. Theo Tamošiūnas PL và cs. (2013) ELISA cho kết quả có độ đặc hiệu và độ nhạy cao đối với việc phát hiện kháng thể virut PPV trong huyết thanh. Nhược điểm của phương pháp này là cho kết quả dương tính giả. 1.3.4. Phương pháp chẩn đoán dựa trên nguyên lý PCR Kỹ thuật PCR được phát triển để phát hiện virut PPV trong các mẫu bệnh phẩm. Vì không cần phải phân lập virut trong môi trường nuôi cấy tế bào nên phương pháp PCR giúp tiết kiệm thời gian để phát hiện virut PPV hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào. PCR còn được xem là một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.  Phương pháp Realtime-PCR Realtime-PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn cDNA chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang. Trong phản ứng real time-PCR, quá trình nhân bản cDNA đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp. Realtime-PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản cDNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang, độ phát quang này tỷ lệ thuận với số lượng sản phẩm ADN được tạo thành. Phương pháp này có độ đặc hiệu cao, chính xác tuy nhiên giá thành của phương pháp tương đối đắt, thiết kế phản ứng khó khăn và đòi hỏi kỹ thuật tay nghề cao và chuyên sâu. Xiao và cs. (2013) sử dụng phương pháp realtime-PCR trong việc pháp hiện sớm, nhanh sự đa dạng di truyền của các chủng virut PPV trong mẫu bệnh phẩm thu thập từ: huyết thanh, phân và mô phổi của những con lợn bị nhiễm bệnh. Tỷ lệ phát hiện được tìm thấy phổ biến ở Mỹ với tỷ lệ nhiễm là 20,7 % trong mô phổi và 7,6 % ở mẫu phân. Điều này tương tự như nghiên cứu đã được mô tả trước đây ở Hungary, nơi PPV có tổng thể tỷ lệ nhiễm là 10,5 % (4/38) trong mẫu phổi, 6,0 % (13 /215) trong mẫu phân và 1,8 % (2/111) trong mẫu huyết thanh (Csagola và cs., 2012).  Phương pháp PCR Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn ADN mà không qua tạo dòng. Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1986 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các ống eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao ADN. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của 18