Tài liệu đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông cửu long

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC HUỲNH VĂN TIỀN MSHV: 62031104 ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƢỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH VI SINH VẬT HỌC 2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC HUỲNH VĂN TIỀN MSHV: 62031104 ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƢỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGS. TS. TRƢƠNG TRỌNG NGÔN PGS. TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG 2015 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn: PGS.TS. Trương Trọng Ngôn, GS.TS. Cao Ngọc Điệp, PGS. TS. Hà Thanh Toàn và PGS. TS. Ngô Thị Phương Dung đã dành thời gian quý báu tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án Quý Thầy Cô giảng dạy chương trình nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học, trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập. Cán bộ phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật và Sinh học Phân tử của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án. Cám ơn gia đình và tất cả bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thời gian thực hiện đề tài! Tác giả HUỲNH VĂN TIỀN i CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của NCS Huỳnh Văn Tiền với sự hướng dẫn của PGS. TS. Trương Trọng Ngôn và PGS. TS. Ngô Thị Phương Dung. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố riêng lẻ bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào trước đây. Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận văn PGS. TS. TRƢƠNG TRỌNG NGÔN PGS. TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG ii HUỲNH VĂN TIỀN MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ .......................................................................................................... i Lời cam đoan ..................................................................................................... ii Mục lục .............................................................................................................. iii Danh sách bảng .................................................................................................. vii Danh sách hình................................................................................................... x Danh mục từ viết tắt ........................................................................................... xiii Tóm tắt ............................................................................................................... xv Abstract .............................................................................................................. xvii Chƣơng 1: Giới thiệu ....................................................................................... 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................ 1 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ............................................................. 2 1.2.1 Mục tiêu đề tài ...................................................................................... 2 1.2.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 2 1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 3 1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ................................................................................................................. 3 1.5 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học ....................................................... 4 Chƣơng 2: Tổng quan tài liệu ......................................................................... 5 2.1 Tổng quan về chất thải chăn nuôi heo................................................................5 2.1.1 Đặc điểm của nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo ........... 5 2.1.2 Quản lý chất thải chăn nuôi heo trên thế giới....................................... 5 2.1.3 Quản lý chất thải chăn nuôi heo tại Việt Nam ..................................... 6 2.2 Xử lý nƣớc thải trong chăn nuôi............................................................... 7 2.2.1 Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước ................................................. 7 2.2.2 Biện pháp xử lý nước thải .................................................................... 8 2.3 Kết tụ sinh học trong nƣớc........................................................................ 9 2.3.1 Kết tụ sinh học (Bioflocculant) ............................................................ 9 2.3.2 Nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ............................. 18 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kết tụ của vi khuẩn .................... 23 2.3.4 Ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước thải ........................................................................................................ 29 iii 2.3.5 Quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trong xử lý nước thải ............................................................................ 31 Chƣơng 3: Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................... 33 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................................ 33 3.1.1 Thời gian............................................................................................... 33 3.1.2 Địa điểm ............................................................................................... 33 3.1.3 Vật liệu ................................................................................................. 33 3.1.4 Thiết bị.................................................................................................. 34 3.1.4 Hóa chất ................................................................................................ 34 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 35 3.2.1 Chuẩn bị mẫu ........................................................................................ 35 3.2.2 Phân lập và làm thuần .......................................................................... 36 3.2.3 Phân tích và xử lý số liệu ..................................................................... 38 3.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 38 3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát .................................................................. 38 3.3.2 Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kế tụ sinh học ................................................................................................. 40 3.3.3 Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bằng sinh học phân tử ........................................................................................... 41 3.3.4 Phân tích các chỉ số đa dạng di truyền dựa trên trình tự 16S rRNA..................................................................................................... 46 3.3.5 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chất kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn được tuyển chọn ..................... 47 3.3.6 Ly trích chất kết tụ sinh học ................................................................ 53 3.3.7 Thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải chăn nuôi heo sau biogas của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ............................... 54 3.7.8 Ứng dụng các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước thải sau biogas ................................................................... 55 Chƣơng 4: Kết quả và thảo luận ................................................................. 56 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học… ................. 56 4.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học .......... 57 4.2.1 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein ................................................................................................... 57 4.2.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide ...................................................................................... 58 iv 4.3 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ............................................................................................................. 59 4.3.1 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein ............................................................................................ 59 4.3.2 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide................................................................................ 59 4.4 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long ............................................................................... 61 4.4.1 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein ......................................... 61 4.4.2 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide ............................ 68 4.5 Phân tích đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học .......................................................................................... 74 4.5.1 Đa dạng về chủng giữa của các loài vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa vào chỉ số Shannon ................................................ 76 4.5.2 Đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ................................................................................................. 77 4.6 Xác định các điều kiện tối ƣu cho khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium LA51P (protein) và chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai KG12S (polysaccharide) ...................................................................................... 91 4.6.1 Mối tương quan giữa thời gian nuôi ủ, tỷ lệ kết tụ và mật độ vi khuẩn ................................................................................................ 91 4.6.2 Nhiệt độ nuôi ủ ..................................................................................... 93 4.6.3 Giá trị pH .............................................................................................. 94 4.6.4 Sự tương tác giữa các điều kiện nuôi sinh khối về thời gian, pH và nhiệt độ của hai chủng vi khuẩn ................................................ 97 4.6.5 Nguồn carbon, nguồn nitrogen và khoáng vô cơ ................................. 101 4.6.6 Xác định ảnh hưởng tương tác của 3 yếu tố dinh dưỡng đến hiệu quả kết tụ sinh học ........................................................................ 102 4.6.7 Ion kim loại bổ sung ............................................................................. 106 4.6.8 Nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung ............................................................ 108 4.6.9 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số vi khuẩn và tỷ lệ kết tụ của 2 chủng vi khuẩn sau khi tối ưu ................................... 109 4.6.10 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn protein ................................................................................................... 110 v 4.6.11 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn polysaccharide ...................................................................................... 111 4.6.12 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học cao được chọn thử nghiệm hiệu suất ứng dụng .................................... 112 4.7 Ly trích chất kết tụ sinh học đƣợc tổng hợp từ hai chủng vi khuẩn Bacillus megaterium LA51P và Bacillus aryabhattai KG12S và thử nghiệm hiệu quả kết tụ sinh học .................................. 113 4.7.1 Kết quả ly trích ..................................................................................... 113 4.7.2 Hiệu suất kết tụ sinh học ...................................................................... 114 4.8 Thử nghiệm hiệu quả xử lý nƣớc thải sau biogas từ trại chăn nuôi heo .................................................................................................... 115 4.8.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ kết tụ (%) các chủng vi khuẩn khi thử nghiệm ở nước thải ngoài thực tế ............................................. 115 4.8.2 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 10 lít ......................................................................................... 119 4.8.3 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của 2 chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 100 lít ....................................................................................... 121 4.9 Hiệu quả xử lý nƣớc thải chăn nuôi heo sau biogas của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 1 m3 và 40 m3 ............ 122 4.9.1 Hiệu suất xử lý ở thể tích 1 m3 ............................................................. 122 4.9.2 Hiệu suất xử lý ở thể tích 40 m3 ........................................................... 122 Chƣơng 5: Kết luận và đề xuất ....................................................................... 125 5.1 Kết luận ....................................................................................................... 125 5.2 Đề xuất ........................................................................................................ 126 Tài liệu tham khảo ........................................................................................... 127 Phụ lục .............................................................................................................. 145 vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Chất kết tụ sinh học được tổng hợp từ các chủng vi khuẩn khác nhau từ năm 2007 – 2013......................................................... 16 Bảng 2.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học ............................................................................................. 19 Bảng 2.3 Một số cặp mồi sử dụng để nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ................................................................................... 20 Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen đến hiệu quả tổng hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Klebsiella sp. ....................... 26 Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến hiệu quả tổng hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Serratia fiacria ............................................................................................... 27 Bảng 2.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến sự kết tụ của các vi sinh vật tổng hợp chất kết tụ sinh học ...................................................... 27 Bảng 2.7 Liều lượng của các vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học khác nhau cho tỷ lệ kết tụ (%) ở dung dịch kaolin ........................... 29 Bảng 2.8 Ảnh hưởng của liều lượng, nhiệt độ và pH lên khả năng kết tụ của chất kết tụ M-1 ....................................................................... 29 Bảng 2.9 Kết quả xử lý nước thải tinh bột bởi các nhân tố kết tụ ................... 30 Bảng 2.10 Hiệu quả xử lý các loại nước thải bởi chất kết tụ sinh học từ vi khuẩn Serratia ficaria .................................................................. 31 Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu của nước thải tại trại chăn nuôi heo (sau biogas) ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long ................................... 34 Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học .......... 35 Bảng 3.3 Thành phần cho 1 mẫu DNA thực hiện phản ứng PCR ................... 42 Bảng 3.4 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí nghiệm 1 ........................................................................................... 47 Bảng 3.5 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí nghiệm 2a ......................................................................................... 49 Bảng 3.6 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí nghiệm 2b ......................................................................................... 49 Bảng 3.7 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí nghiệm 3 ........................................................................................... 50 Bảng 3.8 Nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát sự tương tác 3 yếu tố thời gian, pH và nhiệt độ ủ đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi khuẩn ................................................................................................ 50 Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 yếu tố nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ ..................................... 51 vii Bảng 3.10 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ carbon, nitrogen và khoáng vô cơ ............................................................... 51 Bảng 3.11 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải ở điều kiện phòng thí nghiệm ............................................................ 54 Bảng 4.1 Số mẫu phân lập và số dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học .......................................................................... 56 Bảng 4.2 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein có tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL ..................................... 59 Bảng 4.3 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide có tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL ................................. 60 Bảng 4.4 Đặc điểm sinh học của 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein ............................................................................ 62 Bảng 4.5 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 18 dòng vi khuẩn với các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene ........................................... 64 Bảng 4.6 Kết quả định danh 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein ................................................................................ 67 Bảng 4.7 Đặc điểm sinh học của 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide................................................................ 69 Bảng 4.8 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 16 dòng vi khuẩn so với các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene ..................................... 71 Bảng 4.9 Kết quả định danh 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide .................................................................... 73 Bảng 4.10 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa trên cây phả hệ mối quan hệ di truyền ...................... 75 Bảng 4.11 Chỉ số đa dạng giữa các loài trong quần thể vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học .................................................................. 76 Bảng 4.12 Chỉ số đa dạng giữa các chủng trong quần thể vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học.......................................................... 77 Bảng 4.13 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học........................................................................................... 83 Bảng 4.14 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn ................... 85 Bảng 4.15 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học Bacillus megaterium và Bacillus aryabhattai .................. 87 Bảng 4.16 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học Bacillus megaterium và Bacillus aryabhattai ...................................................................................... 88 Bảng 4.17 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus megaterium ..................................................................................... 88 Bảng 4.18 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai ..................................................................................... 88 viii Bảng 4.19 Mã di truyền chuỗi nucleotide ........................................................ 90 Bảng 4.20 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào vi khuẩn và chỉ số OD660 .................................................................... 92 Bảng 4.21 Ảnh hưởng của thời gian, độ pH và nhiệt độ đến tỷ lệ kết tụ của 2 chủng vi khuẩn ...................................................................... 98 Bảng 4.22 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của yếu tố nhiệt độ, thời gian và pH đến chủng vi khuẩn Bacillus aryhadtai KG12S ............................................................ 100 Bảng 4.23 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi khuẩn ........................................ 102 Bảng 4.24 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ tinh bột, glutamate và CaCl2 đến tỷ lệ kết tụ sinh học ..................................................... 103 Bảng 4.25 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ glucose, glutamate và K2HPO4 + KH2PO4 đến tỷ lệ kết tụ sinh học ................................ 103 Bảng 4.26 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3 nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium LA51P ...................................................................... 105 Bảng 4.27 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3 nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus aryhadtai KG12S .......................................................................................... 106 Bảng 4.28 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào của hai chủng vi khuẩn sau khi tối ưu ................................................ 110 Bảng 4.29 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất protein ở điều kiện tối ưu ............................................................. 111 Bảng 4.30 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất polysaccharide ở điều kiện tối ưu ................................................. 112 Bảng 4.31 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn cho tỷ lệ kết tụ sin học cao ở 2 môi trường phân lập ......................................................... 113 Bảng 4.32 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ các mẫu chất thải sau biogas của các trại chăn nuôi heo .......................................... 116 Bảng 4.33 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của các chủng vi khuẩn ở thể tích 10 lít .................................................... 120 Bảng 4.34 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 100 lít....... 121 Bảng 4.35 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 1 m3 ......... 122 Bảng 4.36 Kết quả phân tích các chỉ tiêu trong nước thải sau hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 40 m3 sau xử lý ....... 123 ix DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Mô hình quản lý chất thải rắn chăn nuôi trên thế giới ........................ 6 Hình 2.2 Xử lý nguồn chất thải chăn nuôi ở Việt Nam ..................................... 8 Hình 2.3 Công thức cấu tạo kaolin .................................................................. 10 Hình 2.4 Cơ chế kết tụ của chất kết tụ sinh học DYU500 ............................... 12 Hình 2.5 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S rDNA của vi khuẩn 8-37-0-1............................................................ 17 Hình 2.6 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S rDNA của vi khuẩn Klebsiella sp. .................................................... 17 Hình 2.7 Quy trình phân lập, nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ............................................................................................. 18 Hình 2.8 Đa hình đơn nucleotide (SNPs) và haplotype ................................... 21 Hình 2.9 Quy trình ứng dụng chỉ số SNP trong công nghệ sinh học .............. 22 Hình 2.10 Quy trình phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học vào xử lý nước thải ................................. 32 Hình 3.1 Xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt .................................................................................................... 37 Hình 3.2 Sơ đồ tổng quát các bước nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ................................................................................... 39 Hình 3.3 Pha loãng mẫu phân lập (A), tách ròng khuẩn lạc (B) các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học .................................... 40 Hình 3.4 Tóm tắt các bước nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bằng kỹ thuật sinh học phân tử .......................................... 41 Hình 3.5 Chu kỳ gia nhiệt (thực hiện phản ứng PCR) ..................................... 43 Hình 3.6 Phương pháp xác định tỷ lệ kết tụ sinh học bằng dung dịch kaolin ................................................................................................ 48 Hình 4.1 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học .................................................................................................... 57 Hình 4.2 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein ............................................................................................... 61 Hình 4.3 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein ....................................................... 65 Hình 4.4 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide .................................................................................. 68 Hình 4.5 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide ........................................... 72 Hình 4.6 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học .................................................................... 78 x Hình 4.7 Giá trị đa dạng nuleotide (Pi) biến đổi theo trình tự chuỗi nucleotide ......................................................................................... 79 Hình 4.8 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein ....................................................... 81 Hình 4.9 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide ........................................... 82 Hình 4.10 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi nucleotide 18 chủng vi khuẩn tổng hợp Protein ............................. 84 Hình 4.11 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi nucleotide 16 chủng vi khuẩn tổng hợp polysaccharide ................ 84 Hình 4.12 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus megaterium strain ............................................................................................... 87 Hình 4.13 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus aryabhattai strain ............................................................................................... 87 Hình 4.14 Ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh khối đến hiệu quả kết tụ sinh học của 2 chủng vi khuẩn ....................................................... 91 Hình 4.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hiệu quả kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn ............................................................ 94 Hình 4.16 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi sinh khối đến hiệu quả kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn .......................................... 95 Hình 4.17 Ảnh hưởng của pH môi trường kaolin đến hiệu quả kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn .................................................... 96 Hình 4.18 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết tụ theo thời gian = 120 giờ, pH = X (5 - 7) và nhiệt độ = Y (30 - 34) .......................................................................................... 99 Hình 4.19 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết tụ ở nhiệt độ = 33oC, Thời gian = X (96 - 144) và pH = Y (5 - 7) .............................................................................................. 99 Hình 4.20 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn .......................................................... 107 Hình 4.21 Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung đến khả năng kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn ............................... 108 Hình 4.22 Khối lượng chất kết tụ ly trích từ 100 ml dịch nuôi sinh khối của hai chủng vi khuẩn ........................................................ 114 Hình 4.23 Tỷ lệ kết tụ của dịch sinh khối vi khuẩn và chất kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn .......................................................... 115 xi Hình 4.24 Mối quan hệ thuận giữa pH chất thải và số dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học........................................................ 117 Hình 4.25 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh học của các chủng vi khuẩn.......................................................... 118 Hình 4.26 Nghiệm thức phối hợp chất trợ lắng với dịch vi khuẩn ................ 118 Hình 4.27 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể tích 8 lít ......................................................................................... 119 Hình 4.28 Thử nghiệm xử lý nước thải sau hệ thống biogas của trại chăn nuôi heo................................................................................ 119 Hình 4.29 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo biogas ở thể tích 1 m3 .................................................................................................. 122 Hình 4.30 Mô hình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước thải sau biogas trại chăn nuôi heo .............................. 124 Hình 4.31 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể tích 40 m3...................................................................................... 124 Hình 4.32 Sơ đồ quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ............ 126 xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ANOVA BLAST BOD Bp BTNMT BVMT C CBI CFU COD CTAB C/N CV dATP dCTP ddNTPs dGTP DNA dNTPs dTTP ĐBSCL EDTA EPS FTIR GDP HPAM ITS LSD MEGA MPN NCBI NC & PT NCS Ngđ OD PAC PAM Analysis Of Variance Basic Local Alignment Search Tool Biochemical Oxygen Demand Base pair Bộ Tài Nguyên Môi Trường Bảo Vệ Môi Trường Carbon Codon Bias Index Colony-Forming Unit Chemical Oxygen Demand Cetyltrimethylammonium bromide Carbon/Nitrogen Coefficient of Variation Deoxyadenosine Triphosphate Deoxycytidine Triphosphate Dideoxynucleotide Triphosphates Deoxyguanosine triphosphate Deoxyribonucleic Acid Deoxynucleotide Triphosphates Deoxythymidine Triphosphate Đồng bằng sông Cửu Long Ethylenediaminetetraacetic acid Exopolysaccharides Fourier Transform Infrared Gross Domestic Product Anionic Polyacrylamide Internal Transcribed Spacer Least Significant Difference Molecular Evolutionary Genetics Analysis Most probable number National Center for Biotechnology Information Nghiên Cứu và Phát Triển Nghiên Cứu Sinh Ngày đêm Optical Density Poly Aluminum Chloride Nonionic Polyacrylamide xiii PCR PGA Pi QCVN rDNA RNA rRNA SBR SDS SEM SNP SS TAE TBE TCVN TE TN TP TSS UASB UV VSV VK WHO XPS Polymerase Chain Reaction Poly-glutamic Acid Polymorphism in information Quy Chuẩn Việt Nam Ribosomal deoxyribonucleic acid Ribonucleic acid Ribosomal ribonucleic acid Sequencing Batch Reactor Sodium Dodecyl Sulfate Scanning Electron Microscope Single Nucleotide Polymorphism Suspended Solid Tris-acetate-EDTA Tris-borate-EDTA Tiêu chuẩn Việt Nam Tris-EDTA Total Nitrogen Total Phosphorus Total Suspended Solids Upflow Anaerobic Sludge Blanket Ultraviolet Vi Sinh Vật Vi Khuẩn World Health Organization X-ray Photoelectron Spectroscopy xiv TÓM TẮT Đề tài “Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường thuộc Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ và các phòng thí nghiệm có liên quan từ tháng 10/2010 đến tháng 08/2014. Mục tiêu luận án là (i) phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học có tỷ lệ kết tụ cao từ nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long; (ii) đánh giá đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn; (iii) tiến hành tối ưu hóa điều kiện tổng hợp chất kết tụ sinh học của 2 dòng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học cao nhất, đặc trưng cho từng môi trường phân lập và ứng dụng xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas. Kết quả phân lập được 221 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trên 2 môi trường chọn lọc có tỷ lệ kết tụ từ 1,21 - 80,28%. Khảo sát 34 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được tuyển chọn, có tỷ lệ kết tụ từ 21,34 - 80,28% cho thấy đa số khuẩn lạc hình tròn, có bề mặt ướt và nhày nhớt, tế bào vi khuẩn chủ yếu có dạng hình que, chuyển động và thuộc nhóm Gram dương. Xây dựng cây phả hệ di truyền dựa vào trình tự gen 16S rRNA bằng phương pháp Maximum-Likelihood, đánh giá đa dạng nucleotide thông qua chỉ số đa hình trình tự nucleotide (Pi), đa hình chiều dài nucleotide (Theta) và số Haplotype. Kết quả xác định mối quan hệ di truyền 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein, có 14/18 dòng vi khuẩn tương đồng 9799% với các chủng thuộc loài Bacillus megaterium; có 3/18 dòng vi khuẩn tương đồng 98-99% với các chủng thuộc loài Bacillus aryabhattai; dòng vi khuẩn còn lại tương đồng 100% với chủng thuộc chi Bacillus sp.. Qua khảo sát 16 dòng vi khuẩn tổng hợp hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide có 11/16 dòng vi khuẩn tương đồng với chi Bacillus; 3/16 dòng vi khuẩn tương đồng với chi Klebsiella; 2/16 dòng vi khuẩn thuộc chi Sphingobacterium. Xác định mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn, có 24/34 chủng vi khuẩn tương đồng 99-100% thuộc loài Bacillus megaterium và loài Bacillus aryabhattai; 10/34 chủng tương đồng 98-100% thuộc loài Klebsiella pneumoniae, Bacillus amyloliquefaciens và Sphingobacterium sp. và các chỉ số đa dạng nucleotide giữa các chủng vi khuẩn này lần lượt là Pi = 0,090, Theta = 0,156 và Haplotypes = 16. Từ các kết quả trên cho thấy sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cũng như sự đa dạng sinh học của vi khuẩn trong tự nhiên. Kết quả tối ưu điều kiện tổng hợp xv chất kết tụ sinh học của 2 chủng vi khuẩn đặc trưng cho 2 môi trường phân lập: (1) Điều kiện tối ưu cho chủng vi khuẩn Bacillus megaterium strain LA51P: pH môi trường nuôi cấy 5,7, nhiệt độ 29oC và thời gian 124 giờ với thành phần môi trường tối ưu gồm tinh bột (0,85%), glutamate (6,6%) và CaCl2 (0,9%) cho tỷ lệ kết tụ 95,78% với dung dịch kaolin ở pH 7, sau 5 phút để lắng, bổ sung dung dịch MgSO4 (0,1%) và 0,2% dịch nuôi sinh khối vi khuẩn. Khối lượng chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu là 4,9g/l cho tỷ lệ kết tụ tương đương với dịch vi khuẩn. (2) Điều kiện tối ưu cho chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai strain KG12S: pH môi trường nuôi cấy 5,9, nhiệt độ 29oC và thời gian 122 giờ với thành phần môi trường tối ưu cho khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học gồm glucose (1,12%), glutamate (5,7%), K2HPO4 (0,4%) và KH2PO4 (0,8%) cho tỷ lệ kết tụ 96,87% với dung dịch kaolin sau 5 phút để lắng, bổ sung dung dịch CaCl2 (0,1%) và 0,2% dịch nuôi sinh khối vi khuẩn. Chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu là 4,8g/l và tỷ lệ kết tụ với dung dịch kaolin tương đương với dịch vi khuẩn. Ứng dụng 2 chủng vi khuẩn trong thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải sau hệ thống biogas của trại chăn nuôi heo đều cho hiệu quả tốt, ở thể tích 40 m3 các chỉ tiêu phân tích COD (< 75 mg/l), TSS (< 50 mg/l) và BOD (< 30 mg/l) đạt tiêu chuẩn A theo quy chuẩn QCVN_40/2011/BTNMT. Từ khóa: Bacillus sp, đa dạng di truyền của vi khuẩn, kết tụ sinh học, nước thải sau biogas, tỷ lệ kết tụ, vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xvi ABSTRACT The thesis “Analysis genetic diversity of bioflocculant-producing bacteria and its application in piggery wastewater treament after biogas system in Mekong Delta” was carried out in the laboratory of Biotechnology Research & Development Institute, Can Tho University and other laboratories, from January, 2010 to August, 2014. The objectives were (i) isolating and selecting some high flocculant activity bacterial strains in piggery wastewater treament after biogas system in Mekong Delta provinces; (ii) evaluating the genetic diversity among these strains; (iii) two strains with the highest flocculating activity were chosen to determinate the optimal conditions for bioflocculant-producing and to apply in piggery wastewater treament after biogas system. The results revealed that two hundred and twenty-one bacterial isolates with flocculant activity (from 1.21% to 80.28%) were isolated on selective media and thirty-four isolates with high flocculating rate (from 21.34% to 80.28%) were selected from thirteen provinces or cities. The colony characteristics of these isolates are generally round-shaped, wet and mucous covered. Cells are mostly short rods, mobile and belong to the Gram-positive bacteria. Then phylogenetic trees were established based on the 16S rRNA sequences by the Maximum-Likelihood method. Nucleotide diversity were evaluated from analyzing the sequence polymorphism (Pi), theta per sequence (Theta) and number of Haplotypes core were done. Eighteen protein bioflocculant-producing strains with high flocculating rate were tested, the result showed that fourteen out of them belonged to Bacillus megaterium with the identity from 97% to 99%; three isolates were identical with Bacillus aryabhattai from 98% to 99% and one isolate was 100% of the identity with Bacillus sp. Moreover, eleven out of sixteen polysaccharide bioflocculantproducing isolates with high flocculating rate were related to Bacillus genus with 98% to 100% identity; three isolates were related to Klebsiella genus with 98% to 100% identity; two isolates were 98% to 99% of the identity with Sphingobacterium genus. Based on the nucleotide sequences of thirty-four bioflocculant-producing bacterial strains, the genetic relationships among them were determined, twenty-four strains had from 98% to 100% identity to Bacillus megaterium and Bacillus aryabhattai; ten strains performed the identity from 98% to 100% with Klebsiella pneumoniae, Bacillus amyloliquefaciens and Sphingobacterium. Genetic diversity analysis showed that nucleotide polymorphism was 0.090, sequence polymorphism per site was xvii 0.156 and number of haplotypes was 16. These results showed that genetic diversity of bioflocculant-producing bacteria is as well as the biodiversity of bacteria in the nature. The optimal conditions for the bioflocculant production varied between two bacterial strains which were selected from selective media: (1) Bacillus megaterium strain LA51P reached to 95.78% after 124 hours cultivation with initial pH 5.7, cultivating temperature 29oC and the optimal medium consisting of starch (0.85%), glutamate (6.8%), CaCl2 (0.75%) with kaolin solution after 5 minutes together with MgSO 4 (0.1%) and 0.2% inoculant (bacterial liquid). The maximal bioflocculant production (4.9 g/l) was obtained in the optimal medium and the flocculant rate was the same as the broth. (2) Bacillus aryabhattai strain KG12S reached to 96.87% after 122 hours cultivation at initial pH 5.9, cultivating temperature 29oC and the optimal medium for Bacillus aryabhattai strain KG12S consisting of glucose (1.12%), glutamate (5.7%), and K2HPO4 (0.4%) + KH2PO4 (0.8%), with kaolin solution after 5 minutes together with CaCl2 (0.1%) and 0.2% inoculant (bacterial liquid). The maximal bioflocculant production (4.8 g/l) was obtained in the optimized medium and the flocculant rate was the same as the broth. From those above results, two strains that were used to treat piggery wastewater after biogas system performed a great potential for piggery wastewater pretreament. For the scale of 40 m3, some parameters reached to A standard of QCVN_40/2011/BTNMT such as Chemical Oxygen Demand [COD] (< 75 mg/l); total solid suspension [TSS] (< 50 mg/l) and Biochemical Oxygen Demand [BOD] (< 30 mg/l). Keywords: Bacillus sp., bioflocculant-producing bacteria, flocculation, flocculating rate, genetic diversity of bacteria, piggery wastewater xviii