Tài liệu Công nghệ sinh học thực vật giáo trình mai xuân lương

TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC ÑAØ LAÏT F7G GIAÙO TRÌNH COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC THÖÏC VAÄT GS.TS. MAI XUAÂN LÖÔNG 2005 Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät -1- MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................- 1 PHAÀN I. NHAÂN GIOÁNG IN VITRO ....................................................................- 3 MÔÛ ÑAÀU ..............................................................................................................- 3 CHÖÔNG I. NHÖÕNG NGUYEÂN TAÉC CUÛA NUOÂI CAÁY MOÂ ............................- 5 TRONG COÂNG TAÙC VI NHAÂN GIOÁNG.............................................................- 5 I. GIÔÙI THIEÄU CHUNG...................................................................................- 5 II. TAÙI SINH CAÂY CON TRONG NUOÂI CAÁY MOÂ. ........................................- 6 1. Nhaân gioáng töø haït trong ñieàu kieän voâ truøng. .............................................- 6 2. Nuoâi caáy phoâi............................................................................................- 6 3. Nuoâi caáy teá baøo tröùng................................................................................- 6 III. NHAÂN GIOÁNG CAÂY CON BAÈNG BIEÄN PHAÙP NUOÂI CAÁY MOÂ. ............- 7 1.Giai ñoaïn I. Kieán laäp vaø oån ñònh maãu caáy. ................................................- 7 2.Giai ñoaïn 2: nhaân gioáng.............................................................................- 9 3.Giai ñoaïn 3: hình thaønh reã. ........................................................................- 9 4.Giai ñoaïn 4. Laøm cho caùc caây taùi sinh thích nghi khí haäu........................- 10 IV. SÔ LÖÔÏC LÒCH SÖÛ PHAÙT TRIEÅN CUÛA NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT.- 11 CHÖÔNG II. PHOØNG THÍ NGHIEÄM NUOÂI CAÁY MOÂ TEÁ BAØO THÖÏC VAÄT. - 15 I. BAÛO ÑAÛM ÑIEÀU KIEÄN VOÂ TRUØNG.........................................................- 15 1. YÙ nghóa cuaû voâ truøng trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät. ..................................- 15 2. Nguoàn nhieãm taïp. ..................................................................................- 15 3. Voâ truøng duïng cu ïthuûy tinh, nuùt ñaäy vaø moâi tröôøng. ...............................- 15 4. Voâ truøng moâ caáy. ....................................................................................- 16 5. Voâ truøng nôi thao taùc caáy vaø tuû caáy voâ truøng. .........................................- 17 II. CHUAÅN BÒ MOÂI TRÖÔØNG.......................................................................- 17 1. Ñöôøng. ....................................................................................................- 18 2. Caùc muoái khoaùng ña löôïng. ....................................................................- 18 3. Caùc muoái khoaùng vi löôïng. .....................................................................- 19 4.Caùc vitamin..............................................................................................- 19 5. Caùc chaát kích thích sinh tröôûng (phytohormone). ...................................- 20 6. Caùc chaát höõu cô khaùc. .............................................................................- 21 7. Chuaån bò caùc dung dòch ñaäm ñaëc vaø dung dòch laøm vieäc. .......................- 21 8. Vaán ñeà löïa choïn moâi tröôøng....................................................................- 23 III. CHOÏN VAØ XÖÛ LYÙ MOÂ CAÁY. ..................................................................- 23 IV. PHOØNG THÍ NGHIEÄM NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT. ...........................- 24 1.Caùch boá trí phoøng thí nghieäm nuoâi caáy moâ. .............................................- 24 2. Caùc thieát bò chuû yeáu cuûa phoøng thí nghieäm nuoâi caáy moâ thöïc vaät. .........- 24 CHÖÔNg III. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP NUOÂI CAÁY MOÂ ......................................- 26 I. NUOÂI CAÁY ÑÆNH SINH TRÖÔÛNG............................................................- 26 1/ Nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng caây khoai taây.................................................- 27 2/ Nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng caây ñòa lan.....................................................- 29 II. NHAÂN GIOÁNG BAÈNG CON ÑÖÔØNG PHAÙT SINH PHOÂI VOÂ TÍNH ......- 32 III. NHAÂN GIOÁNG BAÈNG CAÙCH TAÏO MOÂ SEÏO (CALLUS). .....................- 34 IV. NHAÂN GIOÁNG BAÈNG NUOÂI CAÁY LAÙT MOÛNG....................................- 36 - GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät -2- V. ÖÙNG DUÏNG KYÕ THUAÄT VI GHEÙP TRONG NHAÂN GIOÁNG. ................- 38 VI. NUOÂI CAÁY TUÙI PHAÁN ...........................................................................- 41 1.Choïn vaät lieäu khôûi nguyeân.......................................................................- 41 2.Taïo caùc toå hôïp gen môùi baèng phöông phaùp lai höõu tính. .........................- 41 3.Nuoâi caáy tuùi phaán caây lai. ........................................................................- 42 VII. NUOÂI CAÁY VAØ DUNG HÔÏP PROTOPLAST ÔÛ THÖÏC VAÄT ................- 45 1. Taùch vaø nuoâi caáy protoplast thöïc vaät. .................................................- 46 2. Dung hôïp protoplast................................................................................- 48 VIII. CHUYEÅN GEN THÖÏC VAÄT .................................................................- 51 1. Agrobacterium. .......................................................................................- 51 2. Chuyeån gen nhôø Agrobacterium.............................................................- 52 PHAÀN II. NHAÂN GIOÁNG VOÂ TÍNH TRONG VÖÔØM ÖÔM.............................- 54 CHÖÔNG I. YEÁU TOÁ MOÂI TRÖÔØNG CUÛA NHAÂN GIOÁNG ...........................- 54 I. CAÙC YEÁU TOÁ CÔ BAÛN VEÀ VI KHÍ HAÄU CUÛA MOÂI TRÖÔØNG NHAÂN GIOÁNG. ..........................................................................................................- 54 1.Aùnh saùng ..................................................................................................- 54 2. Nöôùc vaø ñoä aåm........................................................................................- 55 3. Nhieät ñoä. .................................................................................................- 55 4. Khí vaø trao ñoåi khí. .................................................................................- 55 5. Dinh döôõng khoaùng.................................................................................- 55 II. KHAY, CHAÄU TROÀNG CAÂY....................................................................- 56 1.Khay phaúng ñaùy. ......................................................................................- 56 2. Chaäu ñaát nung. ........................................................................................- 56 3. Chaäu plastic. ...........................................................................................- 56 4. Chaäu sôïi. .................................................................................................- 56 5. Chaäu giaáy................................................................................................- 57 6. Tuùi polyethylene.....................................................................................- 57 7. Khay troàng baèng goã. ...............................................................................- 57 III. QUAÛN LYÙ CAÙC YEÁU TOÁ THOÅ NHÖÔÕNG TRONG NHAÂN GIOÁNG VAØ SAÛN XUAÁT CAÂY GIOÁNG..............................................................................- 57 CHÖÔNG II. KYÕ THUAÄT NHAÂN GIOÁNG MOÄT SOÁ CAÂY PHOÅ BIEÁN. ...........- 63 I. KÍCH THÍCH TAÏO REÃ. ..............................................................................- 63 II. SÖÛ DUÏNG PHYTOHORMONE KÍCH THÍCH CAØNH CHIEÁT RA REÃ. ...- 64 III. NHAÂN GIOÁNG CAÂY TROÀNG TÖØ REÃ. ....................................................- 65 IV. NHAÂN GIOÁNG TÖØ VAÛY CUÛ ...................................................................- 69 V. NHAÂN GIOÁNG TÖØ LAÙ. .............................................................................- 70 VI. NHAÂN GIOÁNG BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP CHIEÁT CAØNH.........................- 72 VII. NHAÂN GIOÁNG CAÂY ÑOÃ QUYEÂN. ........................................................- 73 VIII. GHEÙP CAØNH. ........................................................................................- 74 - GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät -3- PHAÀN I. NHAÂN GIOÁNG IN VITRO MÔÛ ÑAÀU Gioáng laø moät khaâu raát quan troïng trong saûn xuaát noâng nghieäp. Coâng taùc gioáng chuû yeáu bao goàm caùc khaâu thu thaäp nguoàn gen, baûo quaûn quyõ gen, lai taïo, tuyeån choïn, thöû nghieäm gioáng vaø nhaân gioáng. Nhôø phöông phaùp nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät neân ngaøy nay phaàn lôùn caùc coâng vieäc naøy ñöôïc thöïc hieän moät caùch khaù thuaän lôïi vaø nhanh choùng. Söï hình thaønh vaø phaùt trieån cuûa phöông phaùp nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät laø keát quaû cuûa nhöõng phaùt hieän sau ñaây trong lónh vöïc sinh lyù thöïc vaät vaø di truyeàn hoïc phaân töû: 1. Tính toaøn theå (potipotency) cuûa moâ vaø teá baøo thöïc vaät cho pheùp taùi sinh ñöôïc caây hoaøn chænh töø moâ, thaäm chí töø moät teá baøo nuoâi taùch rôøi; 2. Khaû naêng taïo caùc caây ñôn boäi qua nuoâi caáy tuùi phaán, töø ñoù taïo caùc doøng ñoàng hôïp töû tuyeät ñoái vaø nhôø ñoù ruùt ngaén ñöôïc chu trình lai taïo; 3. Khaû naêng haáp thu ADN ngoaïi lai vaøo teá baøo thöïc vaät vaø khaû naêng chuyeån gen ñeå gaây bieán ñoåi (transformation) ôû thöïc vaät do ADN ngoaïi lai nhôø coâng ngheä gen (genetic engineering); 4. Khaû naêng nuoâi caáy caùc teá baøo thöïc vaät nhö nuoâi caáy vi sinh vaät daãn ñeán khaû naêng öùng duïng di truyeàn phaân töû vaøo thöïc vaät baäc cao ñeå phuïc vuï cho coâng taùc taïo gioáng; 5. Kyõ thuaät nuoâi caáy protoplast vaø khaû naêng dung hôïp protoplast, taùi sinh caây hoaøn chænh töø protoplast lai (cybrid); 6. Khaû naêng loaïi tröø virus baèng phöông phaùp nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng, taïo caùc doøng voâ tính saïch beänh ôû caùc caây nhaân gioáng voâ tính; 7. Khaû naêng duøng choài naùch, caùc theå choài protocorm vaøo nhaân gioáng voâ tính vôùi toác ñoä cöïc nhanh moät soá caây troàng; 8. Khaû naêng söû duïng phöông phaùp nuoâi caáy phoâi ñeå khaéc phuïc hieän töôïng baát thuï khi lai xa; 9. Khaû naêng baûo quaûn caùc nguoàn gen baèng nuoâi caáy trong oáng nghieäm; 10. Khaû naêng toàn tröõ caùc teá baøo thöïc vaät soáng trong thôøi gian daøi vaø ôû nhieät ñoä thaáp maø khoâng maát tính toaøn theå cuûa teá baøo. Nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät khoâng chæ goùp phaàn giaûi quyeát moät caùch coù hieäu quaû coâng taùc gioáng caây troàng maø coøn môû ra moät chaân trôøi môùi trong nghieân cöùu di GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät -4- truyeàn thöïc vaät, caùc cô cheá sinh toång hôïp ôû thöïc vaät, sinh lyù phaùt trieån, vai troø cuûa phytohormone trong ñôøi soáng thöïc vaät vaø nhieàu vaán ñeà sinh hoïc cô baûn khaùc. Nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät coøn laø coâng cuï ñeå thu nhaän caùc chaát coù hoaït tính sinh hoïc (alcaloid, steroid...) qua nuoâi caáy moâ teá baøo caây thuoác ôû quy moâ lôùn. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät -5- CHÖÔNG I. NHÖÕNG NGUYEÂN TAÉC CUÛA NUOÂI CAÁY MOÂ TRONG COÂNG TAÙC VI NHAÂN GIOÁNG I. GIÔÙI THIEÄU CHUNG. Khaû naêng kieán laäp vaø duy trì caùc cô quan vaø caùc moâ thöïc vaät (phoâi, ñænh sinh tröôûng, reã, hoa teá baøo, callus, teá baøo traàn) trong nhaân gioáng voâ truøng ñeå taùi sinh nhöõng caây môùi töø chuùng laø keát quaû cuûa nhöõng nghieân cöùu cô baûn vaø nghieân cöùu öùng duïng trong caùc phoøng thí nghieäm thöïc vaät hoïc, beänh hoïc vaø di truyeàn hoïc töø cuoái theá kyû 19. Coâng vieäc naøy ñöôïc goïi chung laø nuoâi caáy moâ vaø cô quan, nuoâi caáy trong oáng nghieäm, vi nhaân gioáng vaø thuaät ngöõ môùi nhaát laø coâng ngheä sinh hoïc. Caùc quy trình chính cuûa coâng ngheä sinh hoïc bao goàm taùi sinh choài, taùi sinh caây con, taïo callus vaø taïo phoâi voâ tính. Vi nhaân gioáng khaùc vôùi phöông phaùp nhaân gioáng truyeàn thoáng ôû choã quaù trình ñöôïc chia thaønh nhieàu giai ñoaïn ñeå coù theå kieåm moãi khía caïnh cuûa quaù trình taùi sinh vaø phaùt trieån caây con. Moãi böôùc cuûa traät töï coâng vieäc coù theå ñöôïc thao taùc (hoaëc laäp chöông trình) baèng caùch choïn maãu caáy vaø kieåm tra moâi tröôøng nhaân gioáng. Nhìn saâu vaøo caùc cô cheá sinh hoïc cuûa moãi quaù trình vi nhaân gioáng seõ coù theå tìm thaáy khaû naêng öùng duïng noù trong phöông phaùp nhaân gioángcaây con phuïc vuï saûn xuaát ñaïi traø. Trong chöông naøy seõ moâ taû caùc coâng vieäc ñaõ neâu vaø xaùc ñònh caùc cô sôû hình thaùi, sinh lyù vaø di truyeàn cuûa quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa caây trong nuoâi caáy moâ. Tröôùc heát haõy cuøng nhau naém vöõng yù nghóa cuûa moät soá thuaät ngöõ quan troïng. • Nuoâi caáy moâ. Thuaät ngöõ naøy duøng cho moät traät töï caùc thao taùc duøng ñeå duy trì vaø sinh tröôûng cuûa caùc moâ thöïc vaät (taïo callus, teá baøo, teá baøo traàn), cuûa caùc cô quan trong nuoâi caáy voâ truøng. Kyõ thuaät naøy duøng ñeå nhaân gioáng, caûi bieán genotype (töùc taïo gioáng môùi), saûn xuaát sinh khoái chöùa caùc saûn phaåm hoùa sinh hoïc, nghieân cöùu beänh hoïc thöïc vaät, baûo quaûn phoâi vaø caùc nghieân cöùu khoa hoïc. Taát caû caùc thao taùc naøy ñeàu ñöôïc goïi chung laø coâng ngheä sinh hoïc. • Vi nhaân gioáng. Thuaät ngöõ duøng ñeå aùm chæ coâng vieäc nhaân gioáng thöïc vaät trong oáng nghieäm. Coù 4 giai ñoaïn phaùt trieån ñaëc tröng cuûa coâng vieäc naøy laø kieán laäp, nhaân choài, taïo reã vaø laøm cho caây con taùi sinh thích nghi vôùi khí haäu. • Maãu caáy. Ñoù laø maãu thöïc vaät duøng ñeå nhaân gioáng. Maãu caáy coù theå laø ñoaïn caønh caét, laùt moûng, choài hoaëc haït. • Taïo phoâi voâ tính. Söï hình thaønh phoâi töø caùc teá baøo sinh döôõng chöù khoâng phaûi töø hôïp töû sau khi thuï phaán. • Callus. Söï hình thaønh caùc teá baøo khoâng phaân hoùa (thöôøng laø töø caùc teá baøo nhu moâ). GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät -6- II. TAÙI SINH CAÂY CON TRONG NUOÂI CAÁY MOÂ. Phöông phaùp nhaân gioáng trong oáng nghieäm coù theå ñöôïc söû duïng coù hieäu quaû trong haøng loaït kieåu thao taùc cho naåy maàm vaø taùi sinh caây con neáu coù bieän phaùp baûo veä ñeå traùnh söï nhieãm taïp vaø khi nhöõng trôû ngaïi mang tính di tröyeàn cuûa maãu caáy ñöôïc khaéc phuïc. 1. Nhaân gioáng töø haït trong ñieàu kieän voâ truøng. Thaønh coâng cuûa phöông phaùp nhaân gioáng töø haït ñaït ñöôïc ñoái vôùi haït hoa lan. Haït hoa lan raát beù, khoâng chöùa chaát dinh döôõng döï tröõ vaø noùi chung phuï thuoäc vaøo quan heä coäng sinh vôùi moät soá loaïi naám ñaëc hieäu ñeå tieáp nhaän chaát dinh döôõng. Ngöôøi ta ñaõ tính ñöôïc khoaûng 30.000 haït trong moät quaû Catleya. Naêm 1922 Levis Knudson thoâng baùo keát quaû nuoâi caáy thaønh coâng hoa lan trong moâi tröôøng nuoâi caáy khoâng coäng sinh coù cung caáp muoái khoaùng vaø ñöôøng saccharose. Cô sôû cuûa söï thaønh coâng naøy laø söï phaùt hieän raèng calcium hypochloride coù theå ñöôïc söû duïng ñeå khöû truøng beà maët maø khoâng gaây ñoäc cho phoâi ñang naåy maàm. Quy trình naøy ñaõ ruùt ngaén ñaùng keå thôøi gian nhaân gioáng. Hieän nay noù vaãn ñöôïc söû duïng ñeå cho naåy maàm caùc haït lai. 2. Nuoâi caáy phoâi. Nuoâi caáy phoâi bao goàm taùch phoâi töø haït vaø cho noù naåy maàm trong moâi tröôøng voâ truøng. Coâng duïng chuû yeáu cuûa kyõ thuaät naøy laø “cöùu” caùc phoâi khoâng theå naåy maàm beân trong haït tröôùc khi quaû chín. Raát nhieàu caây lai giöõa caùc loaøi böôùc ñaàu ñöôïc nhaân gioáng baèng phöông phaùp naøy raát coù keát quaû nhöng ñoâi khi phoâi bò hoûng trong quaù trình phaùt trieån (hieän töôïng baát thuï cuûa phoâi voâ tính). Nhöõng doøng chín sôùm cuûa nhieàu loaïi caây aên quaû coù xu höôùng cho quaû chín tröôùc khi phoâi cuûa chuùng phaùt trieån ñaày ñuû. Trong ñieàu kieän töï nhieân nhöõng phoâi naøy deã bò hoûng nhöng neáu taùch chuùng vaø nuoâi chuùng trong moâi tröôøng nuoâi caáy thích hôïp thì coù theå laøm cho chuùng naåy maàm. ÖÙng duïng thöù hai cuûa nuoâi caáy phoâi laø kích thích naåy maàm nhöõng haït chín ñang nguû ñeå ruùt ngaén chu trình nhaân gioáng. 3. Nuoâi caáy teá baøo tröùng. Heä thoáng naøy bao goàm nuoâi caáy voâ truøng tröùng taùch rôøi, noaõn (ñaõ thuï phaán hoaëc chöa thuï phaán), vaø thöïc giaù noaõn gaén beân trong teá baøo tröùng. Maëc duø kyõ thuaät naøy ñaõ ñöôïc söû duïng laàn ñaàu tieân ñeå nghieân cöùu caùc vaán ñeà veà caây aên quaû vaø söï phaùt trieån cuûa haït, quy trình thích hôïp ñaõ ñöôïc söû duïng trong nhaân gioáng, ñaëc bieät laø trong vieäc laøm hoaøn thieän boä gen. Teá baøo tröùng chöa thuï tinh ñöôïc taùch vaø caáy trong moâi tröôøng dinh döôõng cuøng vôùi phaán hoa vaø sau ñoù cho thuï phaán trong oáng nghieäm. Quy trình naøy ñaõ ñöôïc söû duïng raát coù hieäu quaû ñoái vôùi nhöõng caây coù nhieàu loaïi teá baøo tröùng. Phaán hoa coù theå ñaët tröïc tieáp vaøo thöïc giaù noaõn ñeå oáng phaán coù theå phaùt trieån tröïc tieáp vaøo teá baøo tröùng. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät -7- Teá baøo tröùng nuoâi caáy raát coù hieäu quaû trong vieäc cöùu phoâi khi coøn raát non neáu nhö chuùng chöa bò taùch khoûi caây meï. Ñaây laø kyõ thuaät ñôn giaûn hôn nhieàu so vôùi nuoâi caáy phoâi. Caùc teá baøo tröùng coù theå ñöôïc khöû truøng deã daøng hôn vaø noùi chung coù theå sinh tröôûng deã daøng trong moâi tröôøng cô baûn coù chöùa muoái khoaùng, ñöôøng vaø ñoâi khi caàn theâm moät soá phytohormone. Kyõ thuaät nuoâi teá baøo tröùng ít phoå bieán vaø coù nhu caàu dinh döôõng khoaùng thay ñoåi. Ñoái vôùi ña soá caùc loaøi moâi tröôøng cô baûn veà muoái khoaùng voâ cô vaø ñöôøng laø quan troïng, nhöng auxin coù theå caàn ñöôïc söû duïng ñeå kích thích sinh tröôûng. III. NHAÂN GIOÁNG CAÂY CON BAÈNG BIEÄN PHAÙP NUOÂI CAÁY MOÂ. Vi nhaân gioáng phaàn lôùn caây troàng bao goàm 4 giai ñoaïn chuû yeáu ñöôïc thöïc hieän treân caùc moâi tröôøng khaùc nhau vaø chòu caùc bieän phaùp kieåm tra khaùc nhau: - Giai ñoaïn I: Kieán laäp, töùc taïo caùc ñieàu kieän caàn thieát ñeå taùi sinh caây con töø maãu caáy; Giai ñoaïn II: Nhaân caây gioáng Giai ñoaïn III: Taïo reã; Giai ñoaïn IV: Laøm cho caùc caây taùi sinh thích nghi khí haäu. 1.Giai ñoaïn I. Kieán laäp vaø oån ñònh maãu caáy. Muïc tieâu cuûa giai ñoaïn I laø ñaët thaønh coâng maãu caáy vaøo moâi tröôøng voâ truøng baèng caùch traùnh bò nhieãm taïp vaø chuaån bò ñaày ñuû moâi tröôøng trong oáng nghieäm ñeå taùi sinh ñöôïc caây con moät caùch oån ñònh. Giai ñoaïn naøy bao goàm caùc noäi dung sau: 1/ Choïn maãu caáy. Söï löïa choïn vaø duy trì nguoàn thöïc vaät laø yeáu toá quan troïng ñaûm baûo söï thaønh coâng cuûa vi nhaân gioáng. Coù 3 khía caïnh ñoøi hoûi phaûi ñaëc bieät quan taâm: a/ Ñaëc ñieåm di truyeàn vaø phaùt sinh caù theå cuûa nguoàn thöïc vaät duøng ñeå nhaân gioáng. b/ Kieåm tra nguoàn gaây beänh. c/ Ñieàu kieän sinh lyù cuûa caây cho pheùp söû duïng noù trong nhaân gioáng. Tröôùc heát, xaùc ñònh ñuùng ñaëc ñieåm di truyeàn laø raát quan troïng bôûi vì söï nhaàm laãn ôû giai ñoaïn naøy coù theå laøm naåy sinh nhöõng vaán ñeà phöùc taïp vaø gaây neân söï thieät haïi ñaùng keå veà kinh teá tröôùc khi tìm ñöôïc con ñöôøng chuyeån sang caùc giai ñoaïn tieáp theo. Trong soá caùc loaøi vaø gioáng caây troàng khaùc nhau coù söï bieán ñoäng ñaùng keå veà khaû naêng taùi sinh caây con trong caùc ñieàu kieän nhaân gioáng khaùc nhau. Caàn phaûi thöïc hieän söï nghieân cöùu moät caùch coù heä thoáng ñeå coù ñöôïc nhöõng kieán thöùc vaø kinh nghieäm caàn thieát ñoái vôùi töøng loaïi caây. Caàn phaûi daønh thôøi gian ñeå xaùc ñònh nhu caàu cuûa nhöõng gioáng caây chöa quen thuoäc, maëc duø, noùi chung, coù theå tìm ñöôïc thoâng tin veà nhöõng gioáng caây ñoù trong caùc taøi lieäu ñaõ xuaát baûn. Noùi chung, nhöõng thöïc vaät deã nhaân gioáng baèng caùc bieän phaùp thoâng thöôøng thì cuõng ñeã thöïc hieän vi nhaân gioáng. Ví duï caùc loaïi thaûo moäc vöøa deã nhaân gioáng thoâng thöôøng vöøa deã thöïc hieän vi nhaân gioáng. Trong khi ñoù caùc loaïi caây goã thì khoù GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät -8- taùi sinh hôn nhieàu vaø ñeã nhaân gioáng chuùng caàn phaûi tìm ñöôïc caùc phöông phaùp thích hôïp. Thaønh coâng trong vi nhaân gioáng caùc loaøi caây goã raát phuï thuoäc vaøo ñaëc ñieåm cuûa caây non duøng ñeå nhaân gioáng. Vi nhaân gioáng caây con moïc töø haït deã hôn nhieàu so vôùi nhöõng caây ñaõ tröôûng thaønh, vaø caùc chuûng khaùc nhau cuûa cuøng moät loaøi caây troàng thöôøng coù caùc yeâu caàu ñaëc tröng rieâng trong vi nhaân gioáng. Noùi chung, yeáu toá haïn cheá trong vi nhaân gioáng laø söï hình thaønh reã chöù khoâng phaûi laø taêng sinh tröôûng boä reã ñaõ hình thaønh. Caùc thao taùc nhaèm thu nhaän nhöõng caây gioáng treû hoùa bao goàm söï löïa choïn nhöõng boä phaän coøn treû cuûa phaàn goác caây con sinh ra töø haït ñeå taïo ra choài baát ñònh vaø phoái hôïp baèng caùch gheùp nhöõng choài baát ñònh naøy vôùi caây con sinh tröôûng töø haït. Muïc ñích cuûa vi nhaân gioáng laø taïo ñöôïc caây gioáng treû hoùa coù ñaày ñuû khaû naêng ra reã. Söï tieán boä veà khaû naêng ra reã vaø song song vôùi noù laø nhöõng bieán ñoåi veà söùc khoûe vaø hình thaùi cuûa caây con ñaõ ñöôïc ghi nhaän ôû moät soá loaøi caây goã. 2/ Khöû truøng maãu caáy. Caùc yeáu toá gaây nhieãm trong vi nhaân gioáng bao goàm: a/ Nhieãm naám, naám moác, naám men vaø vi khuaån treân beà maët maãu caáy; b/ Nhieãm virus vaø caùc cô theå töông töï virus; c/ Caùc nguoàn beänh beân trong. Trong moät soá tröôøng hôïp caùc yeáu toá gaây nhieãm khoâng chæ laøm öùc cheá sinh tröôûng vaø söï ra reã cuûa caây con thu nhaän ñöôïc trong vi nhaân gioáng maø coøn duy trì taùc duïng öùc cheá naøy sau khi troàng caây con thu nhaän ñöôïc ra vöôøn öôm. Caùc yeáu toá gaây nhieãm haàu nhö coù maët khaép moïi nôi. Ñeå dieät tröø chuùng thöôøng hay söû duïng caùc chaát hoùa hoïc maø thoâng duïng nhaát laø Calcium hypochloride vaø Natrium hypochloride. Nhöõng chaát naøy gaây taùc duïng ñoäc cho vi sinh vaät gaây nhieãm nhöng ít ñoäc ñoái vôùi caây troàng ñöôïc nhaân gioáng trong oáng nghieäm. 3/ Ñieàu kieän sinh lyù laø söï xöû lyù maãu caáy ñeå vieäc nuoâi caáy deã thaønh coâng hôn. Coù 3 ñieàu kieän sinh lyù quan troïng laø: a/ Maãu caáy laáy töø nhöõng caây troàng trong caùc thuøng chöùa nuoâi trong nhaø kính vôùi söï kieåm tra moâi tröôøng chaët cheõ; b/ Phaûi taïo ñöôïc nhöõng caây gioáng khoûe maïnh; c/ Xöû lyù phytohormone. 4/ Moâi tröôøng nuoâi caáy. Moâi tröôøng nuoâi caáy thöôøng duøng laø moâi tröôøng nöûa raén coù chöùa agar hoaëc caùc saûn phaåm thöông maïi töông töï, caùc muoái khoaùng dinh döôõng ña löôïng vaø vi löôïng, nguoàn naêng löôïng maø chuû yeáu laø ñöôøng saccharose vaø moät soá vitamin caàn thieát. Ngoaøi ra, trong phaàn lôùn moâi tröôøng coøn coù chöùa caùc loaïi phytohormone thuoäc hai nhoùm auxin vaø cytokinin vôùi tyû leä thích hôïp ñoái vôùi töøng loaïi caây. Toác ñoä taùi sinh caây con trong caùc moâi tröôøng naøy tuøy thuoäc vaøo töøng loaïi caây troàng. 5/ Dòch ræ trong vi nhaân gioáng. Moät hieän töôïng khoâng mong muoán thöôøng xaûy ra khi tieán haønh vi nhaân gioáng vaø hieän töôïng dòch ræ töø maãu caáy thoaùt ra. Gaây taùc GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät -9- haïi nhieàu nhaát laø caùc hôïp chaát phenol khaùc nhau. Khi chuùng bò oxy hoùa seõ laøm cho moâi tröôøng ngaõ sang maøu naâu, öùc cheá söï taùi sinh vaø sinh tröôûng cuûa caây con. Ñeå haïn cheá taùc haïi cuûa loaïi dòch ræ naøy caàn phaûi coù bieän phaùp xöû lyù maø chuû yeáu laø söû duïng caùc chaát choáng oxy hoùa, keå caû boå sung caùc chaát haáp phuï vaøo moâi tröôøng nhö polyvinylpyrrolidone hoaëc than hoaït tính. 6/ Laøm oån ñònh maãu caáy. Caùc maãu caáy ñoøi hoûi phaûi ñöôïc caét vaø caáy chuyeàn nhieàu laàn ñeå taïo ra nhöõng caây con ñoàng nhaát vaø sinh tröôûng toát. Phaàn lôùn caây moät naêm vaø caây thaûo moäc ñöôïc oån ñònh nhanh choùng sau moät soá laàn caáy, trong khi ñoù caây goã ñoøi hoûi nhieàu laàn caáy hôn, thaäm chí raát khoù ñaït ñöôïc tính oån ñònh. Söï khoù khaên trong vieäc laøm oån ñònh maãu caáy thöôøng gaèn lieàn vôùi traïng thaùi sinh tröôûng cuûa maãu caáy: maãu caáy coøn non deã ñöôïc oån ñònh hôn. Muøa vuï sinh tröôûng cuûa maãu caáy cuõng lieân quan vôùi söï oån ñònh naøy. 2.Giai ñoaïn 2: nhaân gioáng. Muïc ñích cuûa giai ñoaïn 2 laø duy trì vieäc vi nhaân gioáng ôû traïng thaùi oån ñònh vaø nhaân ñöôïc nhieàu caây con theo yeâu caàu. Moâi tröôøng cô baûn cuûa giai ñoaïn 2 cuõng gioáng nhö giai ñoaïn 1.Toác ñoä vi nhaân gioáng nhanh choùng saûn phaåm thöông maïi coù theå ñoøi hoûi söï toái öu hoùa khoâng nhöõng caùc nguyeân toá voâ cô maø caû caùc yeáu toá khaùc cuûa moâi tröôøng. Ñieàu. naøy coù theå thöïc hieän ñöôïc baèng caùch thöû moät caùch heä thoáng caùc noàng ñoä khaùc nhau cuûa caùc nguyeân toá söû duïng trong söï phoái hôïp vôùi caùc yeáu toá khaùc. Caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng ñöôïc duøng ñeå duy trì möùc ñoä sinh tröôûng cô baûn cuõng nhö phaûn öùng phaùt trieån cuûa caây nhaân gioáng. Cytokinin ôû moät soá noàng ñoä coù taùc duïng khaù maïnh trong vieäc kích thích taïo choài. Noùi chung, noàng ñoä toái thieåu cuûa cytokinin kích thích taïo choài ñöôïc löïa choïn trong quaù trình nhaân gioáng. Noàng ñoä cao cuûa cytokinin vaãn kích thích taïo choài nhöng coù theå öùc cheá quaù trình sinh tröôûng cuûa choài theo chieàu daøi. Vì vaäy, xaùc ñònh chính xaùc noàng ñoä cytokinin laø raát caàn thieát. Auxin thöôøng ñöôïc duøng vôùi noàng ñoä thaáp hoaëc khoâng ñöôïc söû duïng ôû giai ñoaïn 2. Tæ leä nhaân gioáng laø soá caây thu ñöôïc trong moät laàn vi nhaân gioáng. Noùi chung, tæ leä nhaân gioáng töø choái baát ñònh lôùn hôn so vôùi töø choài naùch. Tuy nhieân, tæ leä nhaân gioáng töø moät soá loaïi choài ñaëc bieät thöôøng coù theå cao hôn choài baát ñònh. Vì vaäy, tæ leä nhaân gioáng cao nhaát khoâng nhaát thieát phaûi laø ñaùng ao öôùc nhaát ñeå duy trì chaát löôïng cuûa caây con thu ñöôïc.Taàn soá nhaân gioáng coù theå keùo daøi töø hai ñeán taùm tuaàn. Kyõ thuaät caáy chuyeàn caàn ñöôïc toái öu hoaù ñoái vôùi töøng loaïi caây troàng, bao goàm kích thöôùc vaø tính muøa vuï cuûa maãu caáy, phöông phaùp caét vaø höôùng ñaët maãu caáy leân moâi tröôøng. 3.Giai ñoaïn 3: hình thaønh reã. Chöùc naêng cuûa giai ñoaïn naøy laø taïo reã cho maãu caáy chuyeàn ñeå sau ñoù mang chuùng ra troàng treân moâi tröôøng voâ truøng cuûa vöôøn öôm. Vieäc taïo reã coù theå ñöôïc thöïc hieän beân trong hoaëc beân ngoaøi oáng nghieäm vaø bao goàm caùc caùch sau: Taïo reã trong oáng nghieäm. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 10 - a/ Caáy chuyeàn caùc ñoát caáy sang moâi tröôøng taïo reã coù tæ leä phytohormone thay ñoåi baèng caùch giaûm hoaëc hoaøn toaøn khoâng chöùa cytokinin vaø taêng auxin. Haøm löôïng muoái khoaùng thöôøng giaûm ñi moät nöûa. b/ Caáy chuyeàn caùc ñoát caáy sang moâi tröôøng taïo reã (thöôøng laø moâi tröôøng nöôùc) trong moät vaøi ngaøy vaø sau ñoù caáy chuyeàn chuùng sang moâi tröôøng khoâng chöùa auxin ñeå taïo reã. Maãu caáy coù theå ñöôïc ñaët döôùi aùnh saùng hoaëc trong toái ñoái vôùi vaøi loaøi, trong moâi tröôøng coù theå chöùa caùc yeáu toá boå sung höõu ích, ví duï phloroglucinol. Taïo reã beân ngoaøi oáng nghieäm Nhieàu heä thoáng vi nhaân gioáng thöông maïi hoaëc thöïc nghieäm traùnh taïo reã trong oáng nghieäm baèng caùch xöû lyù maãu caáy baèng auxin maø ñaët chuùng tröïc tieáp vaøo moâi tröôøng taïo reã trong ñieàu kieän söông muø hoaëc coù ñoä aåm cao ñeå cho chuùng ra reã. Phöông phaùp naøy khoâng nhöõng taïo ra söï di chuyeån toát ñeïp maãu caáy töø moâi tröôøng oáng nghieäm ra ñieàu kieän beân ngoaøi maø coøn giuùp tieát kieäm thieát bò nuoâi caáy. Coù hai caùch thöïc hieän: a/ Xöû lyù maãu caáy baèng auxin (thöôøng duøng IBA) baèng caùch nhuùng nhanh chuùng vaøo dung dòch phytohormone vaø gaén chuùng vaøo moâi tröôøng trong vöôøn öôm coù ñoä aåm cao; b/ Xöû lyù maãu caáy baèng auxin töø 5 ñeán 15 ngaøy nhö xöû lyù trong oáng nghieäm treân agar hoaëc trong moâi tröôøng nöôùc, sau ñoù röûa saïch agar vaø ñaët chuùng vaøo moâi tröôøng ngoaøi oáng nghieäm. Coù söï khaùc bieät roõ raøng veà hình thaùi giöõa söï hình thaønh reã trong oáng nghieäm vaø ngoaøi oáng nghieäm. Caùc maãu caáy ngoaøi oáng nghieäm coù xu höôùng taïo reã “bình thöôøng” hôn caù maãu caáy trong oàng nghieäm. Sau khi chuyeån ra troàng ôû vöôøn öôm nhöõng caây taïo reã trong oáng nghieäm coù theå bò cheát, trong khi nhöõng caây taïo reã ngoaøi oáng nghieäm deã thích nghi vôùi ñieàu kieän moâi tröôøng hô vaø coù tæ leä soáng soùt cao. Moät khía caïnh toát cuûa nhaân gioáng trong oáng nghieäm laø nhieàu loaïi thöïc vaät thoâng thöôøng khoù ra reã baèng caùch giaâm caønh ngoaøi oáng nghieäm laïi coù theå ra reã khi tieán haønh vi nghaân gioáng trong oáng nghieäm. Ñieàu naøy chuû yeáu lieân quan vôùi traïng thaùi tröôûng thaønh cuûa caây duøng laøm maãu caáy, bôùi vì nhöõng maãu caáy laáy töø khu vöïc coøn non cuûa caây thöôøng deã nhaân gioáng hôn. 4.Giai ñoaïn 4. Laøm cho caùc caây taùi sinh thích nghi khí haäu. Giai ñoaïn naøy bao goàm söï di chuyeån töø ñaëc ñieåm dò döôõng (caàn cung caáp ñöôøng) sang ñaëc ñieåm töï döôõng (coù khaû naêng quang hôïp) vaø söï thích nghi cuûa caây con môùi taùi sinh vôùi moâi tröôøng ngoaøi oáng nghieäm. Giöõ cho soá caây con naøy tieáp tuïc sinh tröôûng laø raát quan troïng vì söï thích nghi vôùi khí haäu vaø phaùt trieån trong ñieàu kieän töï döôõng raát phuï thuoäc vaøo khaû naêng sinh tröôûng tieáp tuïc cuûa caây con töø sau khi ñöa chuùng ra khoûi oáng nghieäm. Nhöõng caây con taùi sinh trong oáng nghieäm caàn phaûi giöõ trong ñieàu kieän coù ñoä aåm cao ñeå thích nghi daàn vôùi ñieàu kieän moâi tröôøng, ñaëc bieät laø laøm cho chuùng traùnh bò maát nöôùc. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 11 - Nhöõng choài con hình thaønh trong quaù trình vi nhaân gioáng coù hình thaùi laù khaù ñaëc bieät. Kích thöôùc laù vaø soá lôùp teá baøo taïo ra laù thaáp hôn ñaùng keå so vôùi nhöõng laø hình thaønh sau khi chuyeån caây con ra vöôøn öôm. Do ñoä aåm cao trong oáng nghieäm treân laù khoâng phaùt trieån lôùp saùp baûo veä vôùi soá löôïng vaø chaát löôïng caàn thieát. Keát quaû laø nhöõng laù hình thaønh trong vi nhaân gioáng bò khoâ raát nhanh sau khi ñöôïc ruùt ra khoûi oáng nghieäm. Xöû lyù ñeå thuùc ñaåy toác ñoä thích nghi vôùi khí haäu. Tröôùc khi ñöa caây ra khoûi oáng nghieäm: a/ Laøm giaûm ñoäâ aåm (khoaûng 35%) cuûa moâi tröôøng trong oáng nghieäm tröôùc khi ñöa caây con ra ngoaøi. Coâng vieäc naøy coù theå ñöôïc thöïc hieän baèng caùch ñaët chaát huùt aåm vaøo oáng nghieäm hoaëc laøm laïnh ñaùy oáng nghieäm. Môû naép oáng nghieäm töø 5 ñeán 7 ngaøy tröôùc khi ñem caây con ra ngoaøi coù theå laø moät bieän phaùp hieäu quaû. b/ Laøm taêng khaû naêng thaåm thaáu cuûa moâi tröôøng (thöôøng ñöôïc thöïc hieän baèng caùch boå sung theâm ñöôøng saccharose). c/ Söû duïng caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng tröôùc khi ñöa caây con ra ngoaøi coù theå mang laïi caùc keát quaû khaû quan khaùc nhau. Sau khi ñöa caây ra khoûi oáng nghieäm: a/ Giaûm töø töø ñoä aåm laø bieän phaùp xöû lyù thoâng duïng nhaát ñeå laøm cho caây con thích nghi vôùi khí haäu. Ñoä aåm coù theå duy trì baèng caùch xöû lyù söông muø giaùn ñoän hoaëc ñaët caây con trong maøng polyethylene. Ñaây laø böôùc raát quan troïng trong quaù trình cho caây laøm quen vôùi khí haäu. b/ Choáng thoaùt hôi nöôùc baèng caùc ñoäc toá thöïc vaät. Coâng vieäc naøy khoâng ñöôïc söû duïng roäng raõi vôùi muïc ñích thöông nghieäp. IV. SÔ LÖÔÏC LÒCH SÖÛ PHAÙT TRIEÅN CUÛA NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT. Sau khi hoïc thuyeát teá baøo cuûa Schwan vaø Schleiden ra ñôøi naêm 1838 nhieàu nhaø sinh hoïc tin töôûng raèng baèng caùch nuoâi caáy ngöôøi ta coù theå taïo thaønh coâng caùc phoâi nhaân taïo, vaø töø ñoù taïo caùc caây con hoaøn chænh, töø caùc teá baøo sinh döôõng. Giai ñoaïn ñaàu tieân cuûa lòch söû phaùt trieån cuûa nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät coù theå ñöôïc ñaùnh daáu baèng nhöõng thí nghieäm ñaàu tieân cuûa Kotte vaø Robbins. Naêm 1922 hai nhaø khoa hoïc naøy ñaõ böôùc ñaàu thaønh coâng trong vieäc duøng ñænh sinh tröôûng ñeå nuoâi caáy reã cuûa moät caây hoøa thaûo trong moâi tröôøng loûng coù chöùa muoái khoaùng vaø glucose. Giai ñoaïn thöù hai ñöôïc baét ñaàu naêm 1934 khi White, moät nhaø sinh hoïc ngöôøi Myõ, ñaõ nuoâi caáy thaønh coâng trong moät thôøi gian daøi ñaàu reã caø chua (Lycopersicum esculenttum) trong moät moâi tröôøng loûng chöùa muoái khoaùng, glucose vaø nöôùc chieát naám men, vaø sau ñoù thay theá nöôùc chieát naám men baèng hoãn hôïp 3 loaïi vitamin nhoùm B laø vitamin B1, vitamin B6 vaø vitamin PP. Sau khi Went vaø Thimann phaùp hieän chaát kích thích sinh tröôûng thöïc vaät ñaàu tieân laø IAA, naêm 1939 Gautheret ñaõ söû duïng thaønh coâng chaát naøy vaø caùc vitamin GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 12 - nhoùm B noùi treân ñeå kích thích sinh tröôûng moâ seïo cuûa caây caø roát vaø duy trì sinh tröôûng cuûa moâ seïo naøy trong thôøi gian voâ haïn treân moâi tröôøng thaïch. Naêm 1941 Overbeck chöùng minh taùc duïng kích thích sinh tröôûng cuûa nöôùc döøa trong nuoâi caáy phoâi caây hoï caø (Dacura); vaø sau ñoù, naêm 1948, Steward xaùc nhaän taùc duïng cuûa nöôùc döøa treân moâ seïo caø roát. Trong thôøi gian naøy cuøng vôùi IAA moät soá auxin khaùc ñaõ ñöôïc phaùt hieän vaø toång hôïp thaønh coâng, nhö NAA vaø 2,4D. Nhieàu taùc giaû nhaän thaáy cuøng vôùi nöôùc döøa 2,4D vaø NAA ñaõ giuùp taïo moâ seïo vaø phaân chia teá baøo ôû nhieàu thöïc vaät raát khoù nuoâi caáy. Naêm 1954 Skook phaùt hieän moät loaïi phytohormone ñaàu tieân thuoäc nhoùm cytokinin laø 6-furfuryllaminopurin (kinetin) töø dòch thuûy phaân ADN vaø taùc duïng kích thích sinh tröôûng cuûa noù ñoái vôùi moâ thaân caây thuoác laù. Vieäc phaùt hieän vai troø cuûa IAA, NAA, 2,4D, vaø kinnetin cuøng vôùi phaùt hieän vai troø cuûa nöôùc döøa vaø vitamin laø nhöõng böôùc tieán raát quan troïng trong quaù trình phaùt trieån cuûa nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät. Ñoù laø tieàn ñeà kyõ thuaät cho vieäc xaây döïng caùc moâi tröôøng nuoâi caáy oån ñònh veà maët hoùa hoïc ñeå thöïc hieän caùc thí nghieäm vaø nghieân cöùu khaùc nhau, daãn ñeán söï phaùt trieån nhanh choùng cuûa kyõ thuaät nuoâi caáy moâ trong giai ñoaïn tieáp theo. Ñaëc bieät quan troïng laø phaùt hieän cuûa Skoog vaø Miller naêm 1957 veà aûnh höôûng cuûa tæ leä cytokinin/auxin trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñoái vôùi söï hình thaønh cô quan cuûa moâ seïo thuoác laù. Khi tæ leä naøy thaáp moâ seïo coù khuynh höôùng phaùt trieån reã; ngöôïc laïi, khi tæ leä naøy cao thì moâ seïo coù khuynh höôùng taïo choài. Hieän töôïng naøy ñöôïc xaùc nhaän ôû nhieàu caây khaùc nhau vaø ñoùng goùp raát lôùn vaøo vieäc ñieàu khieån sinh tröôûng, phaùt trieån, phaùt sinh cô quan cuûa moâ teá baøo nuoâi caáy. Thaønh coâng cuûa Skoog vaø Miller daãn ñeán nhieàu phaùt hieän quan troïng khaùc, môû ñaàu cho giai ñoaïn thöù ba cuûa nuoâi caáy moâ thöïc vaät. Giai ñoaïn naøy ñöôïc ñaùnh daáu baèng nhöõng thaønh coâng sau ñaây: - Taùch vaø nuoâi caáy thaønh coâng caùc teá baøo ñôn ôû daïng huyeàn phuø vaø nuoâi caáy chuùng trong thôøi gian daøi (Muir, Hildebrandt vaø Riker, 1954 – 1959;, Nickell, 1956; Bergman, 1960...) Nhieàu taùc giaû ñaõ thaønh coâng trong vieäc taïo ñöôïc caây hoaøn chænh töø moät teá baøo, chöùng minh cho tính toaøn theå cuûa teá baøo thöïc vaät. Thaønh coâng naøy môû ra nhöõng trieån voïng môùi trong vieäc taïo ra caùc doøng teá baøo ñoät bieán, caùc doøng teá baøo sieâu saûn xuaát (over-production) moät saûn phaåm thöù caáp naøo ñoù vaø khaû naêng taàn soá ñoät bieán trong di truyeàn ñoät bieán ôû thöïc vaät baäc cao; - Thaønh coâng trong nuoâi caáy tuùi phaán ñeå taïo caây ñôn boäi (Guha vaø Maheswari, 1966 ñoái vôùi caây caø ñoäc döôïc; Bourgin vaø Nitsch 1967 ñoái vôùi caây thuoác laù...). Ngaøy nay vieäc taïo caây ñôn boäi qua nuoâi caáy tuùi phaán vaø haït phaán ñaõ thaønh coâng ôû raát nhieàu caây vaø ñaõ ñoùng goùp voâ cuøng to lôùn vaøo vieäc taêng theâm kieán thöùc di truyeàn thöïc vaät vaø thöïc tieãn choïn gioáng. - Phaùt hieän cuûa Cooking (1960) trong vieäc phaân huûy voû cellulose cuûa vaùch teá baøo thöïc vaät, taïo ra caùc teá baøo traàn (protoplast). Sau ñoù (1970) Nagata vaøTakebe taïo laïi ñöôïc voû cellulose cho nhöõng teá baøo traàn naøy vaø Takabe, Labid Melchers ñaõ GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 13 - nuoâi caáy vaø taùi sinh caùc caây hoaøn chænh töø protoplast. Do protoplast coù khaû naêng dung hôïp vôùi nhau vaø haáp thu caùc phaân töû lôùn hoaëc thaäm chí caùc cô quan töø beân ngoaøi neân vieäc nuoâi caáy thaønh coâng protoplast vaø taùi sinh caây hoaøn chænh töø chuùng môû ra trieãn voïng öùng duïng thaønh coâng naøy trong coâng taùc taïo gioáng, choïn gioáng. Ngaøy nay hy voïng naøy ñaõ ñöôïc thöïc hieän, khi nhieàu nhoùm nghieân cöùu khaùc nhau treân theá giôùi coâng boá lai thaønh coâng giöõa loaøi nhôø kyõ thuaät protoplast, moät vieäc khoâng theå thöïc hieän ñöôïc baèng lai höõu tính coå ñieån. Veà maët lyù luaän, protoplast laø coâng cuï khoâng thay theá ñöôïc ñeå nghieân cöùu hieän töôïng nhieãm saéc theå hoøa hôïp cuûa caùc teá baøo khaùc loaøi sau khi dung hôïp vaø vai troø cuûa ADN trong caùc cô quan töû vaø quan heä cuûa chuùng vôùi ADN cuûa nhaân teá baøo. - Thaønh coâng trong coâng ngheä chuyeån gen töø nhöõng naêm 1980-1982. Ngöôøi ta söû duïng caùc plasmid, töùc caùc phaân töû ADN voøng thöôøng coù trong caùc teá baøo vi khuaån ñeå chuyeån taûi caùc gen töø protoplast naøy ñeán protoplast khaùc. Baèng caùch ñoù ngöôøi ta ñaõ ñöa ñöôïc caùc gen ngoaïi lai vaøo teá baøo thöïc vaät. Tieáp sau ñoù ngöôøi ta coøn söû duïng caùc bieän phaùp khaùc ñeå chuyeån gen trong nuoâi caáy protoplast nhö kyõ thuaät söû duïng thieát bò xung ñieän (electroprorator), kyõ thuaät vi tieâm ( microinjection), kyõ thuaät sieâu aâm (ultrasonic gen transfer), kyõ thuaät baén gen (gene gun) ... - Thaønh coâng trong coâng taùc nhaân gioáng vaø phuïc traùng gioáng baèng phöông phaùp nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng. Ngay töø 1969 Morel ñaõ nhaän thaáy ñænh sinh tröôûng cuûa caùc loaøi ñòa lan (Cymbidium) khi ñem nuoâi caáy seõ hình thaønh caùc protocorm. Khi chia caét nhöõng protocorm naøy ñeå tieáp tuïc nuoâi caáy seõ hình thaønh nhöõng protocorm môùi. Khi ñeå trong nhöõng ñieàu kieän nhaát ñònh, nhöõng protocorm naøy seõ taùi sinh thaønh nhöõng caây hoaøn chænh. Hôn nöõa, caùc teá baøo ôû ñænh sinh tröôûng cuûa thöïc vaät chöùa raát ít hoaëc hoaøn toaøn khoâng chöùa virus, do ñoù, vôùi phöông phaùp nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng Morel coù theå phuïc traùng, taïo caùc doøng voâ tính khoâng bò nhieãm virus. Vieäc öùng duïng nuoâi caáy moâ thöïc vaät trong nhaân gioáng ñöôïc Nozeran naâng leân moät möùc môùi khi oâng nhaän thaáy söï hoùa treû cuûa caùc choài naùch caây nho vaø caây khoai taây ñem nuoâi caáy vaø caáy chuyeàn nhieàu laàn trong oáng nghieäm. Vieäc öùng duïng nuoâi caáy moâ trong nhaân gioáng vaø phuïc traùng gioáng ngaøy nay khoâng coøn haïn cheá ôû moät vaøi loaïi caây maø ñaõ ñöôïc thöïc hieän ôû quy moâ thöông maïi ñoái vôùi haøng loaït caây troàng coù yù nghóa kinh teá nhö chuoái, caø pheâ, coï daàu, saén, khoai lang, khoai taây, mía, caây aên quaû coù muùi v.v... vaø ñaõ coù nhöõng ñoùng goùp to lôùn cho noâng nghieäp theá giôùi. Ngaøy nay chuùng ta ñang böôùc vaøo giai ñoaïn phaùt trieån thöù tö cuûa nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät. Ñoù laø giai ñoaïn nuoâi caáy moâ thöïc vaät ñöôïc öùng duïng maïnh meõ vaøo thöïc tieãn choïn gioáng, nhaân gioáng, vaøo vieäc saûn xuaát caùc chaát coù hoaït tính sinh hoïc vaø vaøo nghieân cöùu lyù luaän di truyeàn thöïc vaät baäc cao. Nhöõng hieåu bieát cô baûn veà ñôøi soáng cuûa moâ, cuûa teá baøo taùch rôøi trong moâi tröôøng nhaân taïo, veà nhu caàu cuûa chuùng ñoái vôùi nguoàn carbon, dinh döôõng khoaùng, vitamin, phytohormone... nhöõng kyõ thuaät cô baûn ñeå taùch, nuoâi caáy, ñieàu khieån söï phaân hoùa töø caùc boä phaän khaùc nhau GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 14 - cuûa caây troàng ... laø nhöõng tieàn ñeà ñaõ ñöôïc chuaån bò töø nhöõng giai ñoaïn tröôùc. Ñoàng thôøi, nhieàu coâng ngheä môùi, nhieàu trang thieát bò hieän ñaïi ñaõ ñöôïc phaùt minh ñeå phuïc vuï cho vieäc öùng duïng caùc thaønh töïu cuûa nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät vaøo thöïc tieãn saûn xuaát. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 15 - CHÖÔNG II. PHOØNG THÍ NGHIEÄM NUOÂI CAÁY MOÂ TEÁ BAØO THÖÏC VAÄT. ÔÛ caùc cô sôû nghieân cöùu vaø saûn xuaát coù söû duïng kyõ thuaät nuoâi caáy moâ khaùc nhau tuøy thuoäc vaøo hoaøn caûnh thöïc teá ngöôøi ta coù theå xaây döïng caùc phoøng thí nghieäm vôùi caùc trang thieát bò vôùi möùc ñoä hieän ñaïi khaùc nhau. Tuy nhieân, taát caû caùc phoøng thí nghieäm naøy ñeàu phaûi ñaûm baûo ñöôïc ba yeâu caàu sau ñaây: - Baûo ñaûm ñieàu kieän voâ truøng; Choïn ñuùng moâi tröôøng vaø chuaån bò moâi tröôøng ñuùng caùch; Choïn moâ caáy thích hôïp, xöû lyù moâ caáy thích hôïp tröôùc vaø sau khi caáy. I. BAÛO ÑAÛM ÑIEÀU KIEÄN VOÂ TRUØNG. 1. YÙ nghóa cuaû voâ truøng trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät. Moâi tröôøng nuoâi caáy moâ thöïc vaät raát thích hôïp cho naám vaø vi khuaån phaùt trieån. Do toác ñoä sinh tröôûng cuûa naám vaø vi khuaån raát nhanh so vôùi teá baøo thöïc vaät, neân neáu trong thôøi gian nuoâi caáy chæ nhieãm moät vaøi baøo töû naám hoaëc vaøi vi khuaån thì chæ sau vaøi ngaøy hoaëc vaøi tuaàn toaøn boä beà maët cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy moâ seõ bò naám hoaëc vi khuaån phuû ñaày, laøm cho maãu moâ caáy khoâng theå tieáp tuïc sinh tröôûng vaø cheát daàn. Thoâng thöôøng moät chu kyø nuoâi caáy moâ thöïc vaät keùo daøi töø 1 ñeán 5 thaùng, khaùc vôùi thí nghieäm vi sinh vaät, coù theå keát thuùc trong vaøi ngaøy. Nhö vaäy, möùc ñoä voâ truøng trong thí nghieäm nuoâi caáy moâ thöïc vaät ñoøi hoûi raát nghieâm khaéc. 2. Nguoàn nhieãm taïp. Coù ba nguoàn nhieãm taïp chính laø: - Duïng cuï thuûy tinh, moâi tröôøng vaø nuùt ñaäy khoâng ñöôïc voâ truøng tuyeät ñoái; - Treân beà maët hoaëc beân trong moâ caáy toàn taïi caùc sôïi naám, baøo töû naám hoaëc vi khuaån; - Trong khi thao taùc laøm rôi naám hoaëc vi khuaån theo buïi leân beà maët moâi tröôøng. 3. Voâ truøng duïng cu ïthuûy tinh, nuùt ñaäy vaø moâi tröôøng. Duïng cuï thuûy tinh duøng trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät caàn phaûi chòu ñöôïc nhieät ñoä 160-180oC khi voâ truøng khoâ vaø 120oC khi voâ truøng öôùt. Tröôùc khi söû duïng, duïng cuï thuûy tinh caàn ñöôïc röûa saïch, ñeå raùo nöôùc vaø khöû truøng khoâ trong tuû saáy ôû 160oC trong 1 giôø. Sau khi ñeå nguoäi ñöôïc laáy ra ñeå vaøo caùc hoäp giaáy kín caát vaøo choã ít buïi. Nuùt ñaäy: thöôøng duøng nhaát laø boâng khoâng thaám nöôùc. Nuùt phaûi töông ñoái chaët ñeå khoâng cho buïi ñi qua, ñoàng thôøi nöôùc töø moâi tröôøng khoâng bò boác hôi quaù deã daøng trong quaù trình nuoâi caáy. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 16 - Gaàn ñaây ngöôøi ta duøng nhieàu loaïi nuùt ñaäy khaùc thay theá nuùt boâng, nhö nuùt nhöïa (vaø caû bình caáy) chòu nhieät, nuùt cao su, nuùt kim loaïi raát thuaän tieän cho vieäc khöû truøng khoâ hay öôùt. Moâi tröôøng: Noùi chung, moâi tröôøng ñöôïc pha cheá trong ñieàu kieän khoâng voâ truøng vaø ñem haáp voâ truøng khi ñaõ phaân phoái vaøo caùc bình caáy vaø ñaõ ñaäy nuùt hoaëc naép. Thôøi gian voâ truøng töø 20 ñeán 45 phuùt ôû 120oC. Sau khi voâ truøng caàn phaûi laøm khoâ nuùt boâng hoaëc naép ñaäy. Caùc dung dòch meï duøng ñeå pha moâi tröôøng (nhö dung dòch muoái khoaùng, vitamin, phytohormone v.v... khoâng neân pha nhieàu (100-200ml) vaø caàn ñöôïc baûo quaûn trong ngaên ñaù cuûa tuû laïnh. Ñoái vôùi caùc chaát khoâng chòu nhieät, coù theå bò phaân huûy ôû nhieät ñoä 120oC caàn tieán haønh loïc voâ truøng (ví duï loïc qua pheãu loïc thuûy tinh soá 5 hay qua caùc loaïi maøng loïc voâ truøng) tröôùc khi ñöôïc ñöa vaøo moâi tröôøng ñaõ haáp voâ truøng. 4. Voâ truøng moâ caáy. Moâ caáy coù theå laø taát caû caùc boä phaän khaùc nhau cuûa thöïc vaät. Tuøy theo söï tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng, caùc boä phaän naøy ñeàu chöùa nhieàu hay ít vi khuaån vaø naám. Ñoøng luùa non khi coøn trong beï hay moâ thòt quaû thöôøng ít nhieãm vi sinh vaät, ngöôïc laïi, laù, thaân, ñaëc bieät laø reã do naèm trong ñaát neân coù ñoä nhieãm vi sinh vaät raát cao. Vì vaäy ñoái vôùi caùc loaïi moâ caáy khaùc nhau ngöôøi ta khöû truøng baèng caùc phöông phaùp khaùc nhau. Phöông phaùp voâ truøng moâ caáy thoâng duïng nhaát hieän nay laø duøng caùc chaát hoùa hoïc coù hoaït tính dieät naám dieät khuaån. Hieäu löïc dieät naám, khuaån cuûa caùc chaát naøy phuï thuoäc vaøo thôøi gian xöû lyù, noàng ñoä vaø khaû naêng xaâm nhaäp cuûa chuùng vaøo caùc keõ ngaùch loài loõm treân beà maët moâ caáy, khaû naêng ñaåy heát caùc boït khí baùm treân beà maët moâ caáy. Ñeå taêng tính linh ñoäng vaø khaû naêng xaâm nhaäp cuûa chaát dieät khuaån, thoâng thöôøng ngöôøi ta xöû lyù moâ caáy trong voøng 30 giaây trong röôïu ethylic 70%, sau ñoù môùi xöû lyù dung dòch dieät khuaån. Ñoàng thôøi, ngöôøi ta theâm caùc chaát giaûm söùc caêng beà maët nhö Tween 80, fotoflo, teepol... vaøo dung dòch dieät naám khuaån. Caùc chaát dieät naám khuaån thöôøng duøng vaø cho keát quaû raát toát laø calcium hypochloride 9-10% xöû lyù trong thôøi gian 5-30 phuùt, natrium hypochloride 9-10% xöû lyù trong thôøi gian 5-30 phuùt vaø nöôùc broâm 1-2% xöû lyù töø 2-10 phuùt. Ngoaøi ra, hydro peroxide 10-12% xöû lyù trong 5-10 phuùt vaø chlorua thuûy ngaân 0,1-1,0% xöû lyù trong 2-10 phuùt cuõng cho keát quaû toát ñoái vôùi töøng loaïi moâ caáy. Trong thôøi gian xöû lyù moâ caáy phaûi ngaäp hoaøn toaøn trong dung dòch dieät khuaån. Caùc boä phaän coù nhieàu buïi ñaát, tröôùc khi xöû lyù caàn ñöôïc röûa saïch baèng nöôùc maùy. Khi xöû lyù xong, maãu caáy caàn ñöôïc röûa saïch (ít nhaát 3 laàn) baèng nöôùc caát voâ truøng. Nhöõng phaàn treân moâ caáy bò dung dòch khöû truøng laøm cho traéng ra caàn ñöôïc caét boû tröôùc khi ñaët moâ caáy leân moâi tröôøng. Voâ truøng moâ caáy laø moät thao taùc khoù, ít khi thaønh coâng ngay laàn ñaàu tieân. Vì vaäy, caàn phaûi kieân trì tìm cho ñöôïc noàng ñoä vaø thôøi gian voâ truøng thích hôïp cho töøng loaïi moâ caáy. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 17 - 5. Voâ truøng nôi thao taùc caáy vaø tuû caáy voâ truøng. Moät trong nhöõng nguoàn nhieãm taïp quan troïng vaø thöôøng xuyeân nhaát laø buïi rôi vaøo duïng cuï nuoâi caáy chöùa moâi tröôøng trong khi môû naép hoaëc nuùt boâng trong khi thao taùc caáy. Caàn aùp duïng nhieàu bieän phaùp khaùc nhau ñeå traùnh söï nhieãm taïp naøy. Buoàng caáy: thöôøng laø caùc buoàng coù dieän tích heïp, roäng töø 10-15 m2, coù hai lôùp cöûa ñeå traùnh khoâng khí chuyeån ñoäng töø beân ngoaøi tröïc tieáp ñöa buïi vaøo. Buoàng caáy caàn coù saøn laùt gaïch traùng men, töôøng sôn ñeå coù theå lau röûa thöôøng xuyeân. Maët baøn laøm vieäc cuõng caàn laùt gaïch traùng men hay phuû kính ñeå tieän laøm veä sinh haøng ngaøy. Tröôùc khi laøm vieäc phaûi lau maët baøn baèng coàn 90%. Tröôùc khi ñöa vaøo söû duïng, buoàng caáy caàn ñöôïc xöû lyù hôi formol baèng caùch roùt formol 40% ra moät soá naép ñóa petri ñeå raõi raùc vaøi nôi trong phoøng cho bay hôi töï do. Ñoùng kín cöûa phoøng caáy trong 24 giôø, sau ñoù boû formol ñi vaø khöû hôi formol thöøa baèng dung dòch ammoniac 25% cuõng trong 24 giôø. Caùc duïng cuï mang vaøo buoàng caáy ñeàu phaûi ñöôïc khöû truøng tröôùc: töø quaàn aùo choaøng, muõ vaûi, khaåu trang cuûa ngöôøi caáy ñeán dao keùo, keïp, giaáy boïc, boâng, oáng nghieäm, bình ñöøng nöôùc caát v.v... Treân baøn caáy thöôøng xuyeân coù moät ñeøn coàn ñeå söû duïng trong khi caáy vaø moät soá coác ñöïng coàn 90% ñeå nhuùng caùc duïng cuï laøm vieäc. Tröôùc khi caáy, ngöôøi caáy caàn lau tay kyõ ñeán khuyûu tay baèng coàn 90%. Ñeå ñaûm baûo möùc ñoä voâ truøng cao, trong phoøng caáy caàn coù moät ñeøn töû ngoaïi 40W treo treân traàn. Chæ baät saùng ñeøn naøy khi khoâng coù ngöôøi trong phoøng caáy. Caàn giaûm söï chuyeån ñoäng khoâng khí ôû trong buoàng caáy ñeán möùc toái thieåu, vì vaäy caàn traùnh ra vaøo buoàng caáy nhieàu laàn. Ñeå traùnh söï ngoät ngaït trong buoàng caáy, coù theå quaït khoâng khí qua caùc lôùp boâng thuûy tinh ngaên buïi vôùi toác ñoä nhoû vaøo buoàng caáy. Tuû caáy: Trong moät soá tröôøng hôïp ngöôøi ta söû duïng caùc tuû caáy ñoùng baèng goã hoaëc gheùp baèng kính. Tuy nhieân, ngaøy nay caùc loaïi tuû caáy voâ truøng lamine (laminar-aie-flow cabinet) ñöôïc duøng khaù phoå bieán. Ñoù laø loaïi tuû caáy coù thieát bò thoåi khoâng khí ñaõ loïc voâ truøng vaøo choã thao taùc caáy. Nhôø coù heä thoáng maøng loïc, tuû caáy lamine loaïi tröø moät caùch coù hieäu quaû nguoàn nhieãm taïp töø beân ngoaøi vaø taïo ñieàu kieän thoaûi maùi cho ngöôøi caáy. II. CHUAÅN BÒ MOÂI TRÖÔØNG. Thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy moâ thöïc vaät thay ñoåi tuyø thuoäc loaøi, boä phaän nuoâi caáy, muïc ñích nuoâi caáy vaø nhieàu yeáu toá khaùc. Tuy vaäy, taát caû caùc moâi tröôøng nuoâi caáy bao giôø cuõng goàm 3 thaønh phaàn: - Ñöôøng laøm nguoàn carbon, - Caùc muoái khoaùng ña löôïng, - Caùc muoái khoaùng vi löôïng - Caùc vitamin, GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - - 18 - Caùc phytohormone. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coøn thöôøng theâm vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy moät soá chaát höõu cô thaønh phaàn hoùa hoïc xaùc ñònh (aminoacid, EDTA...) hoaëc khoâng xaùc ñònh (nöôùc döøa, nöôùc chieát naám men...) 1. Ñöôøng. Trong nuoâi caáy moâ, nguoàn carbon ñeå moâ, teá baøo thöïc vaät toång hôïp neân caùc chaát höõu cô giuùp teá baøo phaân chia, taêng sinh khoái cuûa moâ khoâng phaûi do quang hôïp cung caáp maø do ñöôøng trong moâi tröôøng. Hai daïng ñöôøng thöôøng söû duïng nhaát laø saccharose vaø gucose, nhöng saccharose ñöôïc duøng phoå bieán hôn. Tuøy theo muïc ñích nuoâi caáy, noàng ñoä saccharose bieán ñoåi töø 1-6% (w/v), thoâng duïng nhaát laø 2%, töông öùng vôùi 58,4mM. Trong tröôøng hôïp nuoâi caáy teá baøo quang hôïp noàng ñoä ñöôøng coù theå giaûm xuoáng hoaëc boûhaün. 2. Caùc muoái khoaùng ña löôïng. Nhu caàu muoái khoaùng cuûa moâ teá baøo taùch rôøi khoâng khaùc nhieàu so vôùi caây troàng trong ñieàu kieän töï nhieân. Caùc nguyeân toá ña löôïng caàn phaûi cung caáp laø nitô, phospho, kali, magieâ, saét. Nguoàn nitô: Moâ teá baøo thöïc vaät trong nuoâi caáy coù theå söû duïng caùc daïng nitô khoaùng nhö amoân vaø nitrat, ñoàng thôøi coù theå söû duïng caùc daïng nitô höõu cô nhö aminoacid. Tyû leä giuõa nitô daïng amoân vaø nitrat thích hôïp tuøy theo loaøi caây vaø traïng thaùi phaùt trieån cuûa moâ. Nitrat ñöôïc cung caáp döôùi daïng muoái canxi nitrat (Ca(NO3)2,4H2O), kali nitrat (KNO3), natri nitrat (NaNO3) hoaëc amoân nitrat (NH4NO3). Amoân cung caáp döôùi daïng muoái amoân sulphat (NH4)2SO4 hoaëc amoân nitrat NH4NO3. Trong moät soá ít tröôøng hôïp coù theå ñöôïc cung caáp ôû daïng ureâ. Toång noàng ñoä cuûa NO3- vaø NH4+ trong moâi tröôøng thay ñoåi töø 3 ñeán 6mM, thoâng thöôøng khoaûng 2mM. Nguoàn phospho: Hai daïng phospho thöôøng duøng nhaát laø NaH2PO4.7H2O vaø KH2PO4. Noàng ñoä phospho trong moâi tröôøng bieán thieân töø 0,15 ñeán 4,00mM, thöôøng duøng khoaûng 1,00mM. Nguoàn kali: Ngöôøi ta thöôøng cung caáp kali cho moâ nuoâi caáy döôùi daïng kali nitrat KNO3, kali chlorua KCl,kali phosphat KH2PO4. Noàng ñoä K+ trong moâi tröôøng bieán thieân töø 2 ñeán 25 mM, trung bình khoaûng 10mM. Nguoàn canxi: Canxi ñöôïc cung caáp döôùi daïng muoái canxi nitrat Ca(NO3)2.4H2O), canxi chlorua CaCl2.6H2O hoaëc CaCl2.2H2O. Noàng ñoä Ca2+ trong moâi tröôøng töù 1,0 ñeán 3,5mM, trung bình laø 2,0mM. Nguoàn magieâ: Magieâ ñöôïc cung caáp döôùi daïng magieâ sunphat MgSO4.7H2O, vôùi noàng ñoä trong moâi tröôøng khoaûng 0,5 – 3,0mM. GS.TS. Mai Xuaân Löông Khoa Sinh hoïc Coâng ngheä Sinh hoïc thöïc vaät - 19 - Nguoàn saét: Nhöõng moâi tröôøng coå ñieån duøng saét ôû daïng chlorua saét FeCl2.FeCl3.6H2O, sulphat saét FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, citrat saét Fe(C4H4O6). Hieän nay haàu heát caùc phoøng thí nghieäm ñeàu duøng saét ôû daïng chelat keát hôïp vôùi Na2ethylen diamintetraacetat (EDTA). ÔÛ daïng naøy saét khoâng bò keát tuûa vaø giaûi phoùng daàn ra moâi tröôøng theo nhu caàu cuûa moâ thöïc vaät. 3. Caùc muoái khoaùng vi löôïng. Nhu caàu muoái khoaùng vi löôïng cuûa moâ thöïc vaät trong nuoâi caáy moâ laø lónh vöïc coøn ít ñöôïc nghieân cöùu. Ñeå an toaøn, ngöôøi ta cung caáp haàu heát caùc nguyeân toá vi löôïng caàn thieát ñoái vôùi caây cho moâ nuoâi caáy trong moâi tröôøng nhaân taïo, vì vaäy söï cung caáp naøy coù tính chaát kinh nghieäm chuû nghóa, trong nhöõng tröôøng hôïp cuï theå coù theå laø khoâng caàn thieát. Caùc vi löôïng thoâng duïng ñöôïc giôùi thieäu trong baûng 1. Baûng 1. Caùc vi löôïng thoâng duïng Teân vi löôïng Noàng ñoä µM Daïng söû duïng Mangan (Mn) MnSO4.4H2O 15 – 100 Bo (B) H3BO3 6 – 100 Keõm (Zn) ZnSO4.7H2O 15 – 30 Ñoàng (Cu) CuSO4.5H2O 0,04 – 0,08 Molypden (Mo) (NH4)6Mo7O24.4H2O, NaMoO4.2H2O 0,007 – 1,0 Coban (Co) CoCl2.6H2O 0,1 – 0,4 Ioát (I) KI 2,5 – 20,0 4.Caùc vitamin. 2). Caùc vitamin sau ñaây thöôøng ñöôïc duøng trong caùc moâi tröôøng nuoâi caáy (baûng Baûng 2. Caùc vitamin thöôøng ñöôïc duøng trong caùc moâi tröôøng nuoâi caáy moâ. Teân vitamin Myo-inozitol Noàng ñoä söû duïng (mg/l) 100 Acid nicotinic (Niacin, vitamin PP) 0,5 – 1,0 Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0,05 – 0,5 Thiamine HCl (vitamin B1) 10 - 50 Panthotenat canxi GS.TS. Mai Xuaân Löông 1–5 Khoa Sinh hoïc