Tài liệu Công nghệ lên men glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Enzyme Glucoamylase Mục lục Lời nói đầu ...................................................................................................................................... 3 I. Tổng quan về nguyên liệu ....................................................................................................... 4 1. Enzyme glucoamylase .......................................................................................................... 4 1.1 Cấu tạo hóa học enzym glucoamylase .......................................................................... 4 1.2. Cấu trúc không gian enzym glucoamylase ................................................................... 5 1.3 Các tính chất của glucoamylase ................................................................................... 6 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme glucoamylase ...................... 6 1.5. Tính chất của glucoamylase ......................................................................................... 7 1.6. Ứng dụng của enzym glucoamylase ............................................................................. 9 2. Nấm mốc Aspergillus niger .................................................................................................. 9 2.1. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger ...................................................................... 9 2.2. Vị trí phân loại của Aspergillus niger ........................................................................ 10 2.3. Đặc điểm sinh hoc của Aspergillus niger ................................................................... 10 2.4. Sinh trưởng của nấm mốc A.Niger ............................................................................. 11 2.5. Tiêu chí chọn giống .................................................................................................... 15 3. Môi trường lên men............................................................................................................ 16 4. Phương pháp nuôi cấy ....................................................................................................... 20 II. Quy trình công nghệ .......................................................................................................... 21 1. Trộn .................................................................................................................................... 22 2. Tiệt trùng............................................................................................................................ 23 3. Quá trình nhân giống ......................................................................................................... 25 4. Cấy giống ........................................................................................................................... 26 5. Lên men .............................................................................................................................. 27 6. Nghiền ................................................................................................................................ 29 7. Trích li................................................................................................................................ 31 8. Li tâm ................................................................................................................................. 32 9. Siêu lọc UF ........................................................................................................................ 33 1 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 10. Sắc kí lọc Gel..................................................................... Error! Bookmark not defined. 11. Thẩm thấu ngược RO ........................................................ Error! Bookmark not defined. 12. Sấy thăng hoa ................................................................................................................. 36 13. Phối trộn......................................................................................................................... 40 14. Đóng gói ......................................................................................................................... 41 III. Sản phẩm............................................................................................................................ 42 1. Mô tả sản phẩm và chỉ tiêu chất lượng sản phẩm ............................................................. 42 2. Các phương pháp bảo quản enzyme glucoamylase ........................................................... 43 Tài liệu tham khảo ........................................................................................................................ 44 2 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Lời nói đầu Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật trên thế giới đã được tiến hành ở mức độ công nghiệp, với qui mô lớn – hàng nghìn tấn mỗi năm, sản phẩm thu được là các chế phẩm enzyme khác nhau, ở dạng thô dùng cho chăn nuôi, và các ngành công nghiệp dệt, thuộc da,… hoặc dạng tinh khiết cho thực phẩm, y dược học. Nhật là một trong những nước đi đầu trong lĩnh vực này với hơn 20 công ty sản xuất chế phẩm enzyme. Hàng năm Nhật sản xuất 9850 tấn amylase, 8906 tấn protease, 2200 tấn glucoamylase, 100 tấn lipase, 200 tấn các enzyme khác … Ở các nước phát triển như Đức, Hungary, Pháp, Anh, Đan Mạch, v.v… ngành công nghiệp sản xuất enzyme cũng được chú ý và phát triển khá mạnh. Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase gồm các loại α – amylase, β – amylase, γ – amylase hay glucosamylase, oligo – 1,6 – glucosidase, transglucosyldase. Trong đó glucoamylase được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Hiện nay Glucoamylase là một enzyme chiếm vị trí hàng đầu trong sản xuất công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp lương thực thực phẩm và dược phẩm. Do khả năng thủy phân triệt để, sản phẩm cuối của phản ứng xúc tác chủ yếu là α – glucose, nên Glucoamylase được sử dụng trong quy trình sản xuất α – glucose. Glucose có thể được dùng bổ sung vào một số dược phẩm, hay làm cơ chất cho công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến thực phẩm. Sử dụng Glucoamylase trong sản xuất rượu bia giúp thay thế một lượng lớn malt bằng các loại tinh bột khác rẻ tiền hơn như bột gạo, bột mì… giúp giảm bớt chi phí sản xuất và giảm giá thành sản phẩm, nhất là đối với những nước phải nhập khẩu nguồn malt nguyên liệu như Việt Nam. 3 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn I. Tổng quan về nguyên liệu 1. Enzyme glucoamylase Giới thiệu chung Glucoamylase được các nhà khoa học Nhật tách ra lần đầu tiên từ Aspergillus awamori (Katihara, Kurushima, 1966). Sau đó được tìm thấy ở Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và các nhóm vi sinh vật khác cũng như ở mô động vật. Glucoamylase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal, tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme. Các glucoamylase chủ yếu được tạo nên từ hai iso enzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng. Glucoamylase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại glucoamylase II không có cả hai tính chất này. 1.1 Cấu tạo hóa học enzym glucoamylase Glucoamylase I và glucoamylase II. Cả hai dạng glucoamylase đều là những chuổi glyco – protein, trong phân tử có chứa D – gluco, D – maltose, D – galactose, thành phần carbonhydrate trong phân tử glucoamylase I chiếm khoảng 18%, còn với phân tử glucoamylase II là 10%. Phân tử carbonhydrate tham gia trong thành phần cấu tạo enzyme glucoamylase đóng vai trò giúp ổn định cấu trúc enzyme. Ngoài ra chúng còn giúp tạo liên kết với cơ chất là các phân tử polysaccharide giúp cho vùng xúc tác trên enzym gần với cơ chất hơn, do đó quá trình thủy phân của enzyme thuận lợi hơn. Thành phần acid amine tham gia tạo thành chuổi polypeptid trong phân tử glucoamylase cũng khác nhau khi enzyme glucoamylase được thu nhận từ các nguồn khác nhau Số lượng acid amine tham gia vào chuổi polypeptid cấu tạo nên phân tử glucoamylase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus niger và Aspergillus awamori khoảng 650 – 700 acid amin. Các acid amin chính tham gia trong trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase bao gồm acid glutamic, tryptophan, tyrosin, asparagin, acid aspatic, lysin, serin. Trong đó acid glutamic ở vị trí thứ 179 và 400 đóng vai trò chính trong việc xúc tác thủy phân liên kết O – glucozit của cơ chất. 4 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase 1.2. Cấu trúc không gian enzym glucoamylase Trong không gian, phân tử glucoamylase được chia làm ba vùng với chức năng riêng biệt: - Vùng SBD (Starch binding domain: vùng gắn kết với tinh bột) có kích thước khoảng 30 A0. Giữ chức năng liên kết với phân tử cơ chất. - Vùng CD (Catalyse Domain: vùng xúc tác) có kích thước khoảng 60 A0, giữ chức năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết O – glucozit. - Vùng Linker có độ dài khoảng 100 A0 liên kết hai vùng trên lại với nhau. 5 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc không gian Enzyme Glucoamylase 1.3 Các tính chất của glucoamylase  Enzym glucoamylase có mã số EC: 3.2.1.3  Tên khoa học: glucan 1,4 – α – glucohydrolase Ngoài ra enzym glucoamylase còn có các tên gọi khác như: amyloglucosidase; γ – amylase; lysosomal α – glucosidase; acid maltase; exo – 1,4 – α – glucoside; glucose amylase; γ – 1.4 – glucan glucohydrolase. Đặc trưng phản ứng: enzyme glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết 1,4 – 1,6 o – glucoside và tách tuần tự từng gốc gluco từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Enzym glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột và tách tuần tự từng gốc glucose từ đầu không khử của chuổi polysaccharide. Gốc gluco từ đầu không khử được gọi là glycone, còn chuổi oligosaccharide sau khi gluco được tách ra thì được gọi là Alglycone. Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết o – glucozit là do hoạt động chủ yếu của một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với cơ chất, acid glutamic ở vị trí thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid, nó sẽ proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở vị trí liên kết o – glucozit). Acid glutamic ở vị trí thứ 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base, acid amin này sẽ thu hút và tạo liên kết với proton H+ của phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc OH- này sẽ tấn công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên kết o – glucozit của phân tử cỏ chất sẽ bị phá vỡ. 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme glucoamylase 1.4.1. Nhiệt độ 6 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym, khi tăng nhiệt độ lên 100C thì vận tốc phản ứng của enzyme tăng lên gấp đôi, nhưng khi tăng nhiệt độ lên quá cao vượt quá nhiệt độ tối ưu thì enzyme bắt đầu biến tính, do đó vận tốc phản ứng của enzyme cũng giảm xuống. Mỗi enzyme sẽ hoạt động trong khoảng nhiệt độ nhất định, enzyme glucoamylase hoạt động trong khoảng 200C – 750C. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym glucoamylase: 400C – 650C. 1.4.2 pH pH cũng là yếu tố có ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzym, là do pH thay đổi có ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa tham gia trong trung tâm hoạt động của enzym như nhóm α – COOH, ω – COOH, – NH2, – OH. Vòng imodazol… cũng như trạng thái ion hóa của cơ chất và của phức chất trung gian ES. Khoảng pH mà enzym glucoamylase hoạt động được là từ 2 – 8, pH tối ưu: 4 – 5.5 1.4.3 Các chất ức chế Enzyme glucoamylase sẽ bị ức chế bởi các ion kim loại như Al3+, Hg2+, Pb2+, Ni2+,Cu2+. Ngoài ra, khi cơ chất là tinh bột thì schardinger dextrin sẽ hoạt động như một chất ngăn cản khả năng taog phức hợp giữa enzyme glucoamylase và tinh bột. với cơ chất là maltose thì trong môi trường có sự hiện diện của gentitobiose, mantitol với nồng độ khoảng 20mM sẽ ức chế hoạt động của enzyme glucoamylase 1.4.4 Các chất hóa học Khi cho thêm vào môi trường phản ứng các dung môi như: chloroform, hexane, n – deoecane với nồng độ khoảng 50% sẽ làm tăng hoạt tính glucoamylase lên 2 lần so với môi trường chỉ có nước là chất dung môi duy nhất. Các chất 2,2’ – dipyridyl, iodoacetamyde sẽ làm tăng hoạt tính enzym glucoamylase. 1.5. Tính chất của glucoamylase Cơ chế tác động Enzym glucoamylase có khả năng thủy phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside của phân tử tinh bột. 7 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình 1.3: Sơ đồ phân giải của enzyme glucoamylase Khả năng thuỷ phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside glucoamylase để tạo thành glucose đã đưa enzyme này lên hàng đầu về hiệu lực xúc tác thuỷ phân tinh bột. Vì thế việc dùng chế phẩm glucoamylase từ các chủng vi sinh vật trong việc sản xuất bia, rượu, mật, glucose… có một ý nghĩa triển vọng rất lớn. Enzyme glucoamylase xúc tác tách tuần tự từng gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Gốc glucose từ đầu không khử được gọi là glycone, chuỗi oligosaccharide sau khi glucose được tách ra gọi là alglycone. Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết O – glucoside là do hoạt động chủ yếu của một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với cơ chất, acid glutamic ở vị trí thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid, nó sẽ proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở vị trí liên kết o – glucoside). Acid glutamic ở vị trí 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base, acid amin này sẽ thu hút và tạo liên kết với proton H+ của phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc OH- này sẽ tấn công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên kết o – glucoside của phân tử cơ chất sẽ bị phá vỡ. Glucoamylase phân thuỷ phân tinh bột thành những dextrin có phân tử thấp, liên tục tách gốc glucose và cuối cùng tạo sản phẩm là glucose. Glucoamylase thuỷ phân tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loạt ở các liên – 1,4 và – 1,6 glucoside. Nó có giá trị đặc biệt trong ngành sản xuất rượu, chuyển những dextrin có phân tử lượng cao không lên men thành những hợpchất lên men được và do đó nâng cao hiệu suất lên men rượu từ các nguyên liệu là tinh bột. Các chế phẩm enzyme glucoamylase tách chiết từ các tế bào vi sinh vật tuy có những điểm giống nhau, song chúng cũng có một vài điểm khác nhau. Ngay cả các chế phẩm được tách từ các chủng của nấm mốc Aspergillus cũng khác nhau, thậm chí ngay cả các chủng cùng loài cũng khác nhau về các đặc điểm về tính chất lý, hoá, phân tử lượng, thành phần acid amin, tính đặc hiệu với cơ chất và điều kiện hoạt động. Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân một số oligosaccharide và polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Backer và cộng sự thấy rằng sự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “đa mạch” chứ không phải theo cơ chế đơn mạch. Sơ đồ thủy phân tinh bột bởi glucoamylase: Tinh bột hay oligosaccharide Glucoseamylase kiểu Asp.niger khác nhau Glucose 8 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Phản ứng cho ra 80 – 85 % glucose 1.6. Ứng dụng của enzym glucoamylase Chế phẩm glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus, Rhizopus … được thay thế malt làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột. Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật thay malt đã tiết kiệm được hàng vạn tấn đại mạch loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản xuất. Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và đóng vai trò quyết định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường để lên men, do đó cần chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh nhiều enzym glucoamylase. Trong sản xuất rượu người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt của Aspergillus Usamii và Aspergillus Balatae. Nếu coi tổng lượng đường maltose, glucose, saccharose, fructose là 100% thì khi đường hóa bằng malt ta có 71% maltose, 24 – 28% glucose, còn khi đường hóa bằng amylase nấm mốc sẽ có 14 – 21% maltose, 80 – 85% glucose, sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân bởi amylase nấm mốc chủ yếu là glucose – đường dễ lên men, do vậy sự lên men rượu xảy ra nhanh hơn Glucose được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như y học, trong công nghiệp thực phẩm. ngày nay việc sản xuất glucose đa số được sử dụng công nghệ enzyme. Enzyme glucoamylase là enzyme chủ yếu cho quá trình đường phân tinh bột để tạo thành glucose. Tinh bột có chỉ số DE khoảng 4 – 8, sau khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase thì chỉ số DE tăng lên 96 – 98. Dung dịch sau thủy phân có thể trực tiếp được sử dụng để sản xuất siro giàu fructose hoặc là sản xuất glucose ở dạng tinh thể. Trong công nghiệp dược phẩm, enzyme glucoamylase còn được bổ sung vào một số loại thuốc giúp tăng khả năng tiêu hóa cho cơ thể. Ngày nay, enzyme glucoamylase còn được sử dụng kết hợp với các enzyme cellulase và protease dưới dạng canh trường nấm mốc bổ sung vào trong thức ăn gia súc, làm tăng quá trình đồng hóa giúp cho gia súc tăng trọng nhanh hơn. 2. Nấm mốc Aspergillus niger 2.1. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger Giống Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó có các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,…có giá trị sử dụng trong sản xuất enzyme, rượu, axit hữu cơ… Van Tieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc Aspergillus niger từ hạt chứa nhiều dầu như: hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cố, hạt bắp…; Aspergillus niger 9 GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Enzyme Glucoamylase cũng được phân lập từ các sản phảm lên men cổ truyền 2.2. Vị trí phân loại của Aspergillus niger Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu vào năm 1729. Năm 1901 Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này. Raper and Fennell (1965) chỉ dùng một tên Aspergillus cho tất cả các loài tạo thành bào tử trần. Như vậy Aspergillus niger có vị trí phân loại như sau: Bảng 1.1: Phân loại Aspergillus niger Giới Lớp Bộ Họ Loài Fungi Fungi imperfecti Moniliales Aspergillaceae Aspergillus niger Khuẩn ty phân nhánh có vách ngăn, bào tử đính không nằm tron bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọc lớn hình cầu 5 – 6 x 20 – 30µm, đôi khi 6 – 10 x 60 – 70µm màu nâu đen Hình 1.4: Nấm mốc Aspergillus Niger 2.3. Đặc điểm sinh hoc của Aspergillus niger Aspergillus niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6 – 80C và tối đa là 45 – 470C, tối ưu ở 28 – 350C, trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23%. Độ ẩm môi trường thích hợp để lên men bán rắn của Aspergillus niger là 60 – 65%, nó chỉ sinh trưởng và phát triển khi có mặt 10 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn O2 ở pH tối ưu là 4 – 6.5, cũng có những chủng Aspergillus niger sinh trưởng được ở pH 2. Sự thay đổi pH của môi trường nuôi cấy từ 3 đến 6.5 làm thay đổi đáng kể hình thái của Aspergillus niger. 2.4. Sinh trưởng của nấm mốc A.Niger Asp.niger có nhiều kiểu sinh sản khác nhau: Sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính bằng bào tử hoặc sinh sản hữu tính. 2.4.1. Điều kiện sinh trưởng  Nhiệt độ Nấm mốc có nhiệt độ phát triển tốt ưu là 28 – 320C, trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi sinh vật đồng hóa chất dinh dưỡng và thải ra một lượng nhiệt khá lớn. Do đó trong quá trình nuôi cấy cần phải có những trang thiết bị phù hợp để duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường. 11 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn UI (Hoạt độ enzyme) t0 Hình 1.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme glucoamylase  Độ ẩm Độ ẩm tối ưu trong quá trình nuôi cấy nấm mốc là 65 – 70%. Tuỳ theo điều kiện khí hậu và điều kiện vô trùng của mỗi phòng thí nghiệm của mỗi quốc gia mà lựa chọn độ ẩm cho thích hợp, độ ẩm thường khống chế ở 50 – 60%, thường sử dụng 58 – 60%. Độ ẩm mà tăng quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo Enzyme Glucoamylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường trong bình tam giác, trong tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực Glucoamylase cao nhất thu ở độ ẩm 65 – 68%). Cần nhớ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên các khay), thì độ ẩm môi trường không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (việc phòng ngừa và hạn chế sự hư hỏng của canh trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành Enzyme.  pH Khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn theo phương pháp bề mặt thì pH ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm mốc, thường người ta sử dụng pH tự nhiên vào khoảng 5.5 – 6. 12 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn UI (Hoạt độ enzyme) pH Hình 1.6:Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme glucoamylase  Cung cấp Oxy Trong quá trình phát triển và tích tụ enzyme nấm mốc rất cần oxy, khi nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp bề mặt nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với không khí qua hệ thống sợi tơ và micell vì thế đòi hỏi môi trường phải xốp giúp cho nấm mốc tạo nhiều hệ sợi và tích luỹ nhiều enzyme. Nếu môi trường dính bết, không đủ độ xốp, không khí sẽ ít tiếp xúc vi sinh vật xảy ra hô hấp yếm khí ảnh hưởng đến việc tích luỹ enzyme. Độ hoà tan của oxy vào môi trường nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều yếu tố: nhiệt độ, nồng độ chất và phương pháp thổi khí, nhiệt độ cao thì khả năng hoà tan oxy kém, nồng độ chất tỷ lệ nghịch với khả năng hoà tan của oxy, ngược lại cũng có một số yếu tố làm tăng khả năng hoà tan của oxy: ete, rượu, acid hữu cơ… 1.4.2. Nguồn cơ chất  Nguồn C Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit Đối với các hệ vi sinh vật sinh enzyme amylaza: Tinh bột, dextrin, maltoza vừa là chất cảm ứng vừa là nguồn cacbon tốt nhất để sinh tổng hợp amylaza. Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt nếu dùng cám thì không cần bổ sung tinh bột, ngoài cám có thể dùng bột ngô, bột mì, bo 13 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn bo. Cần chú ý trong đa số trường hợp, một số loại đường điển hình, nhất là glucose lại kìm hãm sinh tổng hợp các enzyme thủy phân nói chung (chẳng hạn theo cơ chế trấn áp phân giải do làm giàu lượng AMPV trong tế bào) Ngoài nguồn gluxit là chủ yếu còn phải kể đến các nguồn cacbon khác như: ‒ Các axit béo phân tử lượng lớn (Oleic, stearic, miniotic). Ví dụ: axit oleic có tác dụng kích thích tổng hợp glucoamylaza lên 2.5 – 3.5 lần so với nồng độ thích hợp 2 – 3%. ‒ Etanol và glyxerin trong nhiều trường hợp nuôi cấy được dùng làm cacbon bổ sung.  Nguồn Nitơ Ở nhiều loại nấm mốc, nguồn nitơ tốt nhất là NaNO3 và NH4NO3, nhưng khi nồng độ nitơ dưới 0.05% nấm mốc vẫn phát triển được nhưng sinh tổng hợp amylaza rất kém. Các muối amoni vô cơ, một số nguồn nitơ hữu cơ (gelatin, cazein, cao ngô) cho hiệu quả sinh tổng hợp amylaza thấp. Trong thực tế, người ta thường dùng nguồn nitơ là các axit amin có nguồn gốc từ dịch thủy phân protein (dịch tự phân nấm men, nước chấm, cao ngô, dịch chiết malt), đây vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon và chất cảm ứng sinh enzyme. Các axit amin có tác dụng tốt nhất trong những trường hợp này là asparagin, axit glutamic; D,L serin, histamin, alanin. Trong khi casein thậm chí là ức chế thì dịch thủy phân casein lại cảm ứng sinh tổng hợp amylaza lên gấp 2 lần so với ban đầu. Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt cho nuôi cấy vi sinh vật hơn cả. Các muối amon và nitrat khác đều làm giảm hoạt lực enzyme. Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt nhất đến quá trình sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật nói chung. Nhiều acid amin lại có tác dụng ức chế sinh tổng hợp enzyme như valin, axit glutamic, izolơxin, treonin.  Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động của vi sinh vật, đặc biệt là đối với các quá trình sinh tổng hợp các enzyme kim loại. Để sinh tổng hợp glucoamylaza, nồng độ MnSO4 thích hợp nhất là 0.05%. Nếu thiếu muối này và muối photphat kali thì vi sinh vật không thể sinh tổng hợp được dextrinaza. Hoạt lực glucoamylaza được nâng cao ở nồng độ KCl 0,05% Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao. Lưu huỳnh S với nguồn chủ yếu là các axit amin chứa S như metionin, cystein, sistin, và các muối sunphat (CuSO4). Các muối khoáng có Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Trong đa số trường hợp biotin (vitamin H) và một số vitamin cũng rất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp enzyme. 14 Enzyme Glucoamylase 2.5. GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Tiêu chí chọn giống Giống nấm mốc sử dụng phải đạt những chuẩn mực nhất định mới được phép sử dụng.Các yếu tố cơ bản đối với giống nấm mốc sử dụng lên men thu nhận chế phẩm glucoamylase gồm: - Giống nấm mốc phải có khả năng sinh tổng hợp enzyme glucoamylase mạnh, sản phẩm này phải có chất lượng và số lượng cao hơn hẳn các sản phẩm từ các giống nấm mốc khác. Hình 1.7: So sánh hoạt tính enzyme glucoamylase sinh ra từ các giống nấm mốc khác nhau - Giống phải có khả năng sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy hoạt động, các phụ phẩm của các nhà máy. - Chế phẩm enzyme cần thu nhận do giống đang áp dụng trong sản xuất phải dễ dàng tách ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối của nấm mốc giống. - Giống nấm mốc sử dụng phải là chủng thuần khiết, không nhiễm các sinh vật lạ. - Giống phải có tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp, trong đó có sự ổn định về nhiệt độ, pH, độ ẩm… 15 GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Enzyme Glucoamylase - Giống phải có tốc độ sinh sản và phát triển rất mạnh trong điều kiện môi trường công nghiệp. Tính chất này rất quan trọng vì khi nhiễm các vi sinh vật lạ thì giống dung trong sản xuất phải có khả năng lấn át sự phát triển của vi sinh vật lạ. - Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sản phẩm mong muốn, giúp ta tăng nhiều chu kỳ sản xuất. - Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản, ít bị thoái hóa 3. Môi trường lên men Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi vi sinh vật tạo Glucoamylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme khác là tính hoàn thiện. Hầu hết các vi sinh vật tạo glucoamylase đều hấp thụ carbon chủ yếu ở các dạng hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin…), hyđro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử. Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo Glucoamylase bằng phương pháp lên men bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Cám mì có 16 – 22% tinh bột, 10 – 12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như methionine (0,19%), cystine (0,3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3 – 4% chất béo, 10,3% celulose, các nguyên tố trơ (Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% , P – 0.94%) và các nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10 –15% chất béo, 10 – 14% protein, 8 – 16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37 – 59%). Bảng 1.2: Thành phần hóa học của cám mì Thành phần Độ ẩm Tinh bột Protein thô Béo thô Xơ thô Canxi Phospho tổng Natri K % Khối lượng 13 16 – 22 10 – 12 3–4 10 – 11 0.16 0.94 0.09 1 16 GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Enzyme Glucoamylase Bảng 1.3: Thành phần hóa học của cám gạo Thành phần Tinh bột Chất béo Protein Cellulose Cấu tử hòa tan không chứa Nito % Khối lượng 20 10 – 15 10 – 14 8 – 16 37 – 59 Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của enzyme. Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay vị đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%... Tuy là phế liệu của công nghiệp xay xát, nhưng cám cũng tương đối đắt tiền, hơn nữa trong quá trình nuôi vi sinh vật, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. Cấu tử này thường là mầm mạch (15 – 20%), trấu (2 – 5%), mùn cưa (5 – 10%)… Có thể dùng cặn bã canh trường rắn (sau khi cách ly Enzyme) là cấu tử chính của môi trường (Silova, Fenikxov) 1967, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử vi sinh vật khác nên cần phải tiệt trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa vi sinh vật ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 – 5atm trong vòng 4 – 6 giờ, có thể thanh trùng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường. Tiêu chuẩn chọn nguyên liệu: Tiêu chuẩn chất lượng cám mì, cám gạo theo qui định của Bộ Nông nghiệp – phát triển nông thôn.  Độ ẩm: < 12%  Không mùi chua mốc  Độc tố Aflatoxin: không quá 50 ppb Tỉ lệ cám mì/Cám gạo = 7/3 Bảng 1.4: Thành phần dinh dưỡng của hỗn hợp nguyên liệu cám gạo – cám mì Thành phần dinh dưỡng Độ ẩm Protein thô Xơ thô NDF (Hàm lượng chất xơ trung tính) % Khối lượng 11 16.5 9.75 42 17 GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Enzyme Glucoamylase ADF (Hàm lượng xơ acid dễ tiêu hóa) Hàm lượng tro và khoáng 16 4.75 Bảng 1.5: Chỉ tiêu nước sạch trong công nghiệp  Chỉ tiêu vật lí  Tiêu chuẩn - Mùi vị - Không mùi - Độ trong (ống Dienert) - 100 ml - Màu sắc (thang màu Coban) - 50  Chỉ tiêu hoá học - pH - 6 ÷ 8,5 - Độ cặn cố định (đốt ở 600C) - 75 ÷ 150 mg/lít - Độ cứng toàn phần (độ Đức) - Dưới 150 - Độ cứng vĩnh viễn - 70 - CaO - 50 ÷ 100 mg/lít - MgO - 50 mg/lít - Fe2O3 - 0.3 mg/lít - MnO - 0.2 mg/lít - BO4-3 - 2.5 mg/lít - SO4-2 - 0.5 mg/lít - NH4+ - 0.3 mg/lít - NO2- - Không có - NO3- - Không có 18 GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Enzyme Glucoamylase - Pb - 0.1 mg/lít - As - 0.05 mg/lít - Fe - 0.3 ÷ 0.5 mg/lít - Zn - 5.00 mg/lít  Chỉ tiêu vi sinh vật - Tổng số vi sinh vật hiếu khí - Dưới 100 cfu/ml - Chỉ số Coli - Dưới 20 cfu/ml - Vi sinh vật gây bệnh - Không có Các chất bổ sung môi trường lên men bán rắn:  K2HPO4, MgSO4, FeSO4.7H2O, NaNO3  Chất độn: Mùn cưa Bảng 1. 6: Hàm lượng các chất bổ sung trong nguyên liệu Chất bổ sung K2HPO4 MgSO4 NaNO3 FeSO4.7H2O Mùn cưa % (Khối lượng) 0.001 0.005 0.9 0.1 10 Bảng 1.7: Chỉ tiêu cho phép của MgSO4 Độ tinh khiết > 99.5 % 19 GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Enzyme Glucoamylase Asen Selen Chì < 3 ppm < 30ppm < 10 ppm Bảng 1.8: Chỉ tiêu cho phép của KH2PO4 Độ tinh khiết Asen Flo Clo Sulfate Sắt Chì > 98 % < 3 ppm < 10 ppm < 0.03% <0.1 % <0.003 % < 5 ppm Bảng 1.9: Chỉ tiêu cho phép của FeSO4.7H2O Độ tinh khiết Asen Thủy ngân Chì > 99.5 % < 3 ppm < 3 ppm < 10 ppm 4. Phương pháp nuôi cấy Ở đây, ta sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng (vì vậy còn gọi là phương pháp nổi). Các môi trường rắn trước khi nuôi cấy vi sinh vật cần được làm ẩm. Thường dùng cám, đôi khi dùng gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây, lõi ngô…hoặc hỗn hợp những nguyên liệu này. Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật mà trong đó vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay phát triển trên hạt, trên môi trường bán rắn. Nguyên liệu dùng để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này thường là môi trường cám trấu, cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê. Để làm tăng độ xốp của môi trường từ các nguyên liệu trên, người ta thường bổ sung vào các thành phần làm xốp như trấu, lõi ngô được làm nhỏ. Tuy nhiên, các thành phần trên là các thành phần chứa rất ít chất dinh dưỡng vì vậy cần phải bổ sung vào môi trường một lượng phụ liệu trong khoảng 15 – 20%. Mặc khác, để tăng cường quá trình sinh tổng hợp enzyme thì cần phải bổ sung vào môi trường nuôi vi sinh vật những chất cảm ứng để cảm ứng tổng hợp enzyme. 20