Tài liệu Chiết xuất và phân lập thành phần Saponin trong rễ thân cây sâm vũ diệp (Panax Bipinnatifidus seem.) thu hái ở Tây Bắc

VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ne an dP ĐẶNG THỊ THUỲ ha r ma c y, KHOA Y DƢỢC CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP ici (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) ho ol of M ed THU HÁI Ở TÂY BẮC Co p yri gh t@ Sc KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HÀ NỘI - 2018 VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ha r ne an dP ĐẶNG THỊ THUỲ ma c y, KHOA Y DƢỢC CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) ed ici THU HÁI Ở TÂY BẮC ho ol of M KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC Khoá: QH.2013.Y 1. TS. NGUYỄN HỮU TÙNG 2. ThS. NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH Co p yri gh t@ Sc Ngƣời hƣớng dẫn: HÀ NỘI - 2018 VN U LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện khoá luận tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ từ y, các thầy cô, bạn bè và gia đình. ma c Lời đầu tiên, với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên bộ môn Hoá dƣợc và Kiểm nghiệm ha r thuốc Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời thầy đã hết lòng chỉ bảo, hƣớng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. ne an dP Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn chân thành đến các thầy cô trong Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc gia Hà Nội, nhất là Ths. Nguyễn Thị Hoàng Anh, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm khoá luận. Và tôi cũng xin cảm ơn chị Thuỷ- Khoa Dƣợc trƣờng Đại học y dƣợc Thái Nguyên, chị Huệ và các bạn Phƣợng, Chuyên, Phƣơng- Khoa Y Dƣợc trƣờng Đại ed ici học Quốc gia Hà Nội đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua. Lời cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi giúp đỡ ho ol of M động viên tôi trong học tập và cuộc sống. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn. Co p yri gh t@ Sc Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Đặng Thị Thuỳ VN U MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT y, DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ma c ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................................................1 ha r Chƣơng 1 - Tổng quan ..............................................................................................2 1.1. Tổng quan chung về sâm vũ diệp ...............................................................2 1.1.3. Đặc điểm thực vật, bộ phận dùng ...........................................................2 Phân bố và sinh thái ................................................................................3 1.1.5. Tác dụng dƣợc lý ....................................................................................3 1.1.7. Thành phần hoá học ................................................................................4 ne an dP 1.1.4. 1.2. Tổng quan các phƣơng pháp sắc ký ..........................................................6 1.2.1. Sắc ký cột ................................................................................................6 1.2.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ..........................................................................7 1.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................................................8 ed ici 1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc...................................9 1.3.1. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ................................9 1.3.2. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS) .................................................10 ho ol of M Chƣơng 2 - Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu ............................................11 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................11 2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................................11 2.2.1. Dung môi, hoá chất ...............................................................................11 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................12 gh t@ Sc 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................12 2.3.1. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu ..........................................................12 2.3.2. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hoá học .....................12 2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất ..........................12 2.3.4. Phƣơng pháp phân tích định tính các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao ..............................................................................................................13 Co p yri Chƣơng 3- Kết quả thực nghiệm và bàn luận ......................................................13 3.1. Chiết xuất và tinh chế các hợp chất saponin từ thân rễ SVD ...............13 3.1.1. Chiết xuất và phân lập ..........................................................................13 3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết hai chất phân lập đƣợc bằng SKLM .................15 3.2. Xác định cấu trúc của 2 saponin phân lập đƣợc.....................................16 3.2.1. Hợp chất số 1 ........................................................................................16 3.2.2. Hợp chất số 2 ........................................................................................19 VN U 3.3. Phân tích định tính và dấu vân tay hoá học của các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao ..........................................................................................22 ma c y, Chƣơng 4 - Bàn luận ...............................................................................................23 4.1. Về xử lý chiết mẫu và phân lập chất tinh khiết ......................................23 4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất ................................................................24 4.3. Xây dựng dấu vân tay sắc ký dƣợc liệu SVD bằng HPLC ....................24 ha r Chƣơng 5 - Kết luận và kiến nghị ..........................................................................25 5.1. Kết luận ......................................................................................................25 5.2. Kiến nghị ....................................................................................................26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an dP PHỤ LỤC 13 C-NMR Carbon 13 nuclear magnetic resonance DEPT IR Infrared HPLC High performance liquid chromatography 1 Proton nuclear magnetic resonance ma c ha r H-NMR y, DEPT Mass spectrum NMR Nuclear magnetic resonance Rf Retardation factor RP18 Reversed Phase 18 SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Thin layer chromatography UV Ultra violet VIS Visible gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an dP MS yri Co p VN U DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT VN U DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1. Cấu trúc hoá học của 10 saponin tách đƣợc từ thân rễ 5 ma c SVD y, Tên hình Hình 2. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại ha r Sapa, Lào Cai 15/07/2016 11 14 Hình 5. Sắc ký đồ của chất số 1 và số 2 phân lập đƣợc sau khi 15 Hình 3. Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng ne an dP Hình 4. Sơ đồ phân lập sắc ký 2 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn BuOH 15 phun thuốc thử H2SO4 10% /EtOH 19 Hình 7. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 2 22 ici Hình 6. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 1 Hình 8. Sắc ký đồ HPLC của hai saponin phân lập đƣợc 1 Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed (A), 2 (B) và cao butanol của SVD 23 VN U DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ SVD số 1 yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an dP ha r Bảng 3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất số 2 Co p 16 ma c Bảng 2. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của hợp chất y, 5 19 VN U ĐẶT VẤN ĐỀ y, Việt Nam là vùng đất của nhiều các loài thảo dƣợc quý đặc biệt là các loài thuộc chi sâm. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một cây thuốc quý thuộc chi Sâm (Panax) đang đƣợc sử dụng trong các bài thuốc truyền thống và có ma c tiềm năng để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe nhƣ các loài khác cùng chi. Gần đây sâm vũ diệp đƣợc thuần hoá và bƣớc đầu đƣợc trồng thử nghiệm ở một ha r số địa phƣơng nhƣ Hà Giang và Lào Cai [1; 13]. Về mặt y học, thân rễ sâm vũ diệp đã đƣợc sử dụng làm thuốc bổ và có mặt trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc. ne an dP Ở Việt Nam và thế giới, tổng quan tài liệu thấy rằng không có nhiều các nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng sinh học của dƣợc liệu sâm vũ diệp. ici Vì vậy, việc nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hoá học và tác dụng sinh học để thu thập thêm bằng chứng khoa học và nâng cao hiệu quả sử dụng loại dƣợc liệu quý này hứa hẹn nhiều kết quả có giá trị khoa học và thực tiễn. Năm 2017 vừa qua, nhóm nghiên cứu của Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc Gia Hà Nội đã thực hiện nghiên cứu bƣớc đầu về thành phần hoá học của thân rễ cây sâm vũ diệp thu ho ol of M ed hái ở Sapa, Lào Cai với 3 hợp chất phân lập đƣợc từ phân đoạn ít phân cực ethyl acetat [7; 8]. Tiếp nối nghiên cứu trên chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng ở Tây Bắc”. Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hoá gh t@ Sc học, từ đó làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn nhƣ định tính định lƣợng cũng nhƣ nghiên cứu về tác dụng sinh học của loài sâm này. Mục tiêu của đề tài bao gồm: 1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất saponin chính ở phân đoạn n-butanol của thân rễ của sâm vũ diệp. 2. Xác định cấu trúc hoá học của các saponin phân lập đƣợc 3. Xây dựng dấu vân tay sắc ký sâm vũ diệp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Đề tài này là một phần trong đề tài cấp Nhà nƣớc thuộc Chƣơng trình Tây Bắc “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam Co p yri thất hoang (Panax stipuleanatus H. Tsai et K.M.)”, mã số: KHCN-TB.07C/13-18. 1 VN U Chƣơng 1 - Tổng quan y, 1.1. Tổng quan chung về sâm vũ diệp 1.1.1. Tên khoa học, tên đồng danh Sâm vũ diệp còn có tên khác là vũ diệp tam thất, hoa diệp tam thất, trúc tiết ma c nhân sâm, tam thất lá xẻ, sâm hai lần xẻ, phan xiết (Dao), hoàng liên thất, nữu tử thất, tam thất lá lông chim, hƣơng sơn tam thất (Trung Quốc) có tên khoa khoa học là Panax bipinnatifidus Seem. [1; 12]. ha r Một số tên đồng danh của SVD: Aralia bipinnatifida (Seem.) C. B. Clarke; Aralia quinquefolia (L.) Dec. et Plan.var.major Burk; Aralia quinquefolia (L.) Dec.et Plan.var.elegantior Burk; ne an dP Panax pseudoginseng Wall.var.bipinnatifidus (Seem.) Li; Panax pseudoginseng Wall. var. major (Burk.) Li; Panax major Ting ex Pei; Panax pseudoginseng Wall. spp. Himalaicus Hara; Panax pseudoginseng Wall.var.elegantior (Burk) Hoo et Tseng; Panax Japonicus Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng [12]. 1.1.2. Vị trí phân loại [2] ho ol of M ed ici Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), SVD thuộc chi Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Chi Nhân sâm (Panax L.) gh t@ Sc 1.1.3. Đặc điểm thực vật, bộ phận dùng Cây thân thảo sống nhiều năm. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại. Thân khí sinh mảnh, cao 20-30 cm, thƣờng đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thƣờng lụi tàn vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dƣơng lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2-3 cái mọc vòng. Lá chét 5-7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5-14 cm, rộng 1,5-4 cm, gốc tròn, đầu thuôn Co p yri thành mũi nhọn, xẻ thuỳ không đều, mép có răng cƣa, có lông. Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5-10 cm; cụm hoa có từ 2090 hoa; cuống hoa mảnh dài 1-1,5 cm. Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở ngọn thân, 5 cánh hoa, bầu 2-3 ô. Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, đƣờng kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ, có chấm đen to ở đầu, chứa 1-2 hạt. Hạt hình cầu hoặc gần 2 VN U cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [1; 5; 12; 13]. Bộ phận dùng: dƣợc liệu là thân rễ SVD [1]. 1.1.4. Phân bố và sinh thái Trong tự nhiên SVD phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nepan (vùng cận ma c y, Hymalaya) và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nƣớc ta. Sapa ở Việt Nam cũng là điểm phân bố cuối cùng của SVD ở phía nam. Năm 1973, cây đã đƣợc phát hiện ở núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sapa, ở độ cao 1600 m. Hiện nay vùng phân bố của Sâm vũ diệp đã bị thu hẹp dần, từ độ cao khoảng 1800 m trở lên, cây đƣợc coi là cực ne an dP nguy cơ tuyệt chủng cao ở Việt Nam [1; 13]. ha r hiếm. Gần đây SVD đã đƣợc thuần hoá và bƣớc đầu đƣợc trồng thử nghiệm ở một số địa phƣơng ở Hà Giang, Lào Cai. Đây là một loài quý hiếm và đang đứng trƣớc SVD là loài thân thảo ƣa bóng và đặc biệt ƣa ẩm, thƣờng mọc rải rác hay tập trung dƣới tán rừng ẩm, gần nhƣ quanh năm có sƣơng mù. Hàng năm vào cuối tháng 2 và đầu tháng 3 từ phần đầu mầm rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc một vài chồi thân (tuỳ thuộc vào số lƣợng đầu mầm ở rễ). Chồi ho ol of M ed ici này thƣờng sinh trƣởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt đƣợc chiều cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa. Quả xanh quan sát đƣợc vào cuối tháng 4-6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào thời kỳ có lƣợng mƣa lớn tháng 7-8 nên hạt giống thƣờng bị cuốn trôi, ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của SVD. Sau khi quả chín, từ tháng 9-10, toàn bộ phần thân trên mặt đất tàn lụi qua mùa đông, để lộ gh t@ Sc những vết sẹo thân rễ khá rõ. Đó là dấu hiệu giúp ta xác định tuổi của cây [1]. 1.1.5. Tác dụng dƣợc lý SVD có tác dụng gây động dục, hƣớng sinh dục, liều thấp có tác dụng làm giảm thời gian ngủ do phenobarbital, tăng sức dẻo dai cho cơ thể và tán huyết [1]. Năm 2016, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thƣ từ 57 cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc, Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một trong số những loài thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thƣ [24]. Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngƣng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân Co p yri đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn ethylacetat có tác dụng ở các mức liều: 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 5 mg/mL, phân đoạn ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL [15]. 1.1.6. Tính vị và công dụng 3 VN U Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dƣỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ. Theo đông y, SVD có tác dụng bổ, chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, nhất là đối với phụ nữ sau đẻ. SVD còn đƣợc dùng cầm máu, tán ứ, tiêu sƣng. Dùng ngoài, rễ ma c y, phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết thƣơng mau lành. Rễ cây SVD còn đƣợc ngâm rƣợu rồi chiết dƣới dạng tinh sâm dùng rất tốt, có tác dụng kích thích sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao, cao này pha với nƣớc hoặc rƣợu để uống cũng có tác dụng nhƣ rễ. Ở Trung Quốc, SVD là ha r thuốc chữa hƣ lao thổ huyết, chảy máu cam, đòn ngã tổn thƣơng [1; 5]. 1.1.7. Thành phần hoá học ne an dP Rễ SVD chứa saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất nhƣ: chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginseninosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1, và Rg2 [1]. Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố 13 saponin từ lá của loài sâm vũ diệp Panax japonicus var. bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng thu hái ở dãy núi ho ol of M ed ici Tần Lĩnh, Thiểm Tây, Trung Quốc. Trong đó có hai saponin mới là bipinnatifidusoside F1 và F2 và 11 saponin đã biết trƣớc đó gồm ginsenoside F1, F2, F3, Rg2, Re, Rd, Rb1, Rb3, 24S-pseudoginsenoside F11, panasenoside và majoroside F1. Cấu trúc của hai saponin mới đã đƣợc xác định là dammar-25(26)-ene-3-beta, 12 beta, 20(S), 24 zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)-beta-Dglucopyranoside (bipinnatifidusoside F1) và dammar-22(23)-ene-3-beta, 12 beta, 20 gh t@ Sc (S), 24-zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)beta-D-glucopyranoside (bipinnatifidusoside F2) [26]. Năm 2002, nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã chỉ ra rằng trong thân rễ của SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen, saponin cùng với acid béo, acid amin. Đồng thời bằng cách thuỷ phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu đƣợc acid oleanolic [9; 10]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc phân lập đƣợc 10 saponin khung oleanan từ dịch chiết MeOH của rễ cây SVD (hình 1), bao gồm 3 hợp chất mới bifinoside A-C (1-3) và 7 hợp chất đã biết bao gồm nacrissiflorine methyl este Co p yri (4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenoside RP1 methyl este (6), stipuleanoside R1 (7), pseudoginsenoside RT1 methyl este (8), mormordin IIe (9) và stipuleanoside R2 methyl este (10) [25]. 4 VN U y, ma c ha r ne an dP ici Hình 1. Cấu trúc hoá học của 10 saponin tách được từ rễ SVD Năm 2017, Đỗ Văn Hào và cộng sự đã phân lập đƣợc 3 hợp chất từ phân ho ol of M daucosterol [7]. ed đoạn ethylacetat của thân rễ SVD. Các hợp chất đó là β-sitosterol, oleanolic acid và Bảng 1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ SVD STT TLTK 1 Chikusetsusaponin IV [25] 2 Zingibrosid R1 [26] 3 Ginsenoside Ro [26] 4 Ginsenoside F1 [26] 5 Ginsenoside F2 [26] 6 Ginsenoside F3 [26] 7 Ginsenoside Rb1 [26] 8 Ginsenoside Rd [26] 9 Ginsenoside Rg1 [26] 10 Ginsenoside Rg2 [26] 11 Ginsenoside Rb3 [26] Sc gh t@ yri Co p Hợp chất 5 Ginsenoside Re [26] 13 24-S-pseudoginsenoside F11 [26] 14 Panasenoside [26] 15 Majoroside F1 [26] 16 Bipinnatifidusoside F1 17 Bipinnatifidusoside F2 18 Bifinoside A 19 Bifinoside B 20 Bifinoside C 21 Nacrissiflorine methyl este [25] 22 Pseudoginsenoside RP1 methyl este [25] 23 Pseudoginsenoside RT1 methyl este [25] 24 Stipuleanoside R1 [26] 25 Stipuleanoside R2 methyl este [26] 26 Mormordin IIe y, VN U 12 ma c [26] [26] [25] [25] [25] ed ici ne an dP ha r [25] ho ol of M Nhƣ vậy cho tới hiện tại đã có 26 hợp chất saponin đƣợc phân lập từ SVD Nhận xét chung: qua các nghiên cứu về thành phần hoá học của SVD chúng tôi thấy rằng saponin chiếm hàm lƣợng chủ yếu trong thân rễ SVD. Do đó chúng tôi lựa chọn nghiên cứu thành phần saponin, cụ thể là ở phân đoạn n-butanol (phân đoạn giàu saponin nhất). gh t@ Sc 1.2. Tổng quan các phƣơng pháp sắc ký 1.2.1. Sắc ký cột Pha tĩnh là những hạt có kích thƣớc tƣơng đối lớn (50-150 µm), đƣợc nạp trong cột thuỷ tinh. Mẫu chất cần phân tích đƣợc đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thuỷ tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đƣợc đặt trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dƣới cột đƣợc Co p yri hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Phƣơng pháp này thƣờng làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy sắc ký cột cũng có ƣu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ dễ kiếm, có thể triển khai với một lƣợng mẫu tƣơng đối lớn. Các bƣớc thực hiện sắc ký cột gồm: 6 VN U + Lựa chọn chất hấp phụ: pha tĩnh là silicagel loại thƣờng, hợp chất không phân cực đƣợc giải ly khỏi cột trƣớc, hợp chất phân cực đƣợc giải ly sau. Với 2 phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng lƣợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ laị trong cột nên di chuyển ra khỏi cột ha r ma c y, chậm hơn so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân cực. + Lựa chọn dung môi: Mẫu sắc ký đƣợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp với nồng độ 10 mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10 cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5 µl dung dịch (A). Mỗi bản mỏng đƣợc triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó ne an dP phát hiện bằng đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy đƣợc dung môi nào phù hợp. Từ kết quả đó, tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực và một dung môi kém phân cực. + Nạp chất hấp phụ dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho chất ho ol of M ed ici hấp thụ dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp phụ đạt đƣợc chiều cao khoảng 2 cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dƣới để cho dung môi chảy ra, hứng vào một bình trống để bên dƣới cột, dung môi này sẽ đƣợc rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp phụ vài lần đến khi chất hấp phụ trong cột đồng nhất. + Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu dạng gh t@ Sc rắn thì hoà tan chất vào trong một lƣợng nhỏ dung môi. Loại dung môi cho khởi đầu sắc ký. + Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa đƣợc hứng bằng ống thuỷ tinh. Dịch rửa giải trong các ống đƣợc gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng [4; 6; 16;18]. 1.2.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Nguyên tắc: Dựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha: pha động và pha tĩnh. Chất cần phân tích đƣợc hấp phụ (hoặc phân bố hoặc trao đổi ion) Co p yri trên pha tĩnh, pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích. Các thành phần sau khi đƣợc phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp đƣợc lƣu giữ trên pha tĩnh. Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thƣờng (nếu các chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bƣớc sóng 254 nm, 366 nm 7 VN U hoặc phun thuốc thử hiện màu hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị densitometer (một thiết bị đo cƣờng độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hặc khả kiến của chất cần phân tích). Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các phƣơng pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích. ha r chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động: ma c y, Các đại lƣợng đặc trƣng + Hệ số lƣu giữ Rf Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số lƣu giữ Rf. Trị số của nó đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách dịch chuyển của Trong đó: ne an dP (1) là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm) là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm) (đo trên cùng đƣờng đi của vết) có giá trị dao động giữa 0 và 1 : ici + Hệ số lƣu giữ tƣơng đối là đƣờng đi của chất phân tích (cm) ed Trong đó: (2) là đƣờng đi của chất chuẩn (cm) càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất) ho ol of M (giá trị [4; 6; 16; 17]. 1.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) a. Nguyên tắc của HPLC gh t@ Sc Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dƣới áp suất cao. Pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc Co p yri phân loại theo kích cỡ. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bằng detector. Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic. 8 VN U Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt đƣợc tách ra trên sắc ký đồ y, b. Ứng dụng của phƣơng pháp HPLC - Định tính: dựa vào thời gian lƣu, hình dạng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, ha r ma c hoặc chồng phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử - Xác định tạp chất: dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu thử, trên sắc ký đồ không có pic tại thời gian lƣu của tạp chất khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện - Định lƣợng: dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diên tích pic của nó [4; 14; 18]. ne an dP 1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc 1.3.1. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) a. Nguyên tắc Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính đƣợc đặt trong từ trƣờng, khi thay đổi từ trƣờng sẽ dẫn đến hấp thụ năng lƣợng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng hƣởng từ hạt nhân. ho ol of M ed ici Những hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng là số lẻ và những hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng là số chẵn nhƣng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và cho tín hiệu NMR. Các hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng và số thứ tự nguyên tử là những số chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR. Vị trí của tín hiệu cộng hƣởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó. b. Các đại lƣợng đặc trƣng - Độ chuyển dịch hoá học: sự khác nhau về vị trí hấp thụ giữa proton của mẫu phân tích và của chất chuẩn đƣợc gọi là độ chuyển dịch hoá học (δ). ) ( ) (3) Sc ( gh t@ Trong đó: νTMS: tần số của mẫu chuẩn tetramethylsilane νmay: tần số làm việc của máy - Hằng số tƣơng tác spin Co p yri δ: độ chuyển dịch hoá học νmau: tần số của mẫu phân tích 9 VN U Khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội đƣợc biểu hiện bằng Hz, đặc trƣng cho sự tƣơng tác gọi là hằng số tƣơng tác spin (J). Trị số J phụ thuộc vào tƣơng quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tƣơng tác. - Diện tích dƣới tín hiệu ma c y, Diện tích dƣới tín hiệu tỷ lệ với số lƣợng proton cho tín hiệu đó. Đƣờng cong tích phân diện tích dƣới tín hiệu cho biết số lƣợng tƣơng đối của proton cho tín hiệu. c. Ứng dụng của phổ NMR ha r Bằng cách xác định độ chuyển dịch hoá học δ, hằng số tƣơng tác J và diện tích dƣới tín hiệu ngƣời ta có thể biện giải phổ và kết hợp với các thông tin của các ne an dP loại phổ khác nhƣ IR, MS từ đó xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ [3; 4; 17]. 1.3.2. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS) a. Nguyên tắc Dùng chùm điện tử có năng lƣợng trung bình (50-100 eV) để bắn phá phân ho ol of M ed ici tử hữu cơ ở môi trƣờng chân không cao (10-3- 10-6mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hoá và bị phá vỡ thành các mảnh. Các ion đƣợc tạo thành trong buồng ion hoá, đƣợc gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trƣớc khi đến detector. Tín hiệu tƣơng ứng với các ion sẽ đƣợc thể hiện bằng một số vạch (pic) có cƣờng độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. b. Ứng dụng Sc - Xác định các đồng vị: Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân chỉ khác nhau về số neuron trong nhân đó nên khối lƣợng nguyên tử khác nhau. Có thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các nguyên tố trong mẫu. - Định tính: gh t@ + Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lƣợng các ion phân tử M+, (M+1)+, (M+2)+, đây là các đặc trƣng quan trọng của hợp chất hoá học. Bên cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cƣờng độ của chúng cùng với khối lƣợng của các mảnh ion có thể xác định công thức nguyên của chất phân tích. Co p yri + Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thƣ viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu với phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu. - Xác định công thức cấu tạo: để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần dùng kỹ thuật ion hoá thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều 10 VN U mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng. Việc biện giải phổ nên kết hợp với phổ NMR và phổ IR. - Định lƣợng: phân tích định lƣợng khối phổ tƣơng tự nhƣ các kỹ thuật khác dùng cách thiết lập đƣờng chuẩn hoặc thêm đƣờng chuẩn cùng với độ cƣờng độ ma c y, vạch phổ để xác định nồng độ [3; 4; 17]. Chƣơng 2 - Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu ha r 2.1. ne an dP Mẫu nghiên cứu là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) đƣợc thu hái ở Sa a, Lào Cai vào tháng 15-07-2016 và đƣợc giám định tên khoa học bởi TS. Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu. Mẫu dƣợc liệu (DL-150716) đƣợc lƣu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu- ho ol of M ed ici Viện Dƣợc liệu. Hình 2. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai 15/07/2016 gh t@ Sc 2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 2.2.1. Dung môi, hoá chất Dung môi dùng trong chiết xuất phân lập nhƣ ethanol (EtOH), methanol (MeOH), dicloromethan (CH2Cl2), chloroform (CHCl3), ethyl acetat (EtOAc), nbutanol (BuOH) đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và đƣợc cất lại trƣớc khi dùng. Co p yri Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel (0,040 – 0,063 mm, Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50 µm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản). Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thƣờng Kiesel 60 F254 và pha đảo TLC silica gel 60 RP-18 F254 S (Merk, Damstadt, Đức). 11 VN U Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất. y, Dung môi chạy sắc ký HPLC (methanol, acetonitrile, acid acetic) của Merk, Đức, nƣớc cất dùng cho phân tích. ha r ma c 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ - Máy Jasco DIP-360 digital polarimeter (Jasco, Nhật Bản): đo năng suất quay cực - Máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản): đo điểm nóng chảy - Máy AGILENT 1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ): đo phổ khối ion hoá phun mù điện tử (ESI-MS) ne an dP - Máy JEOL ECX 400 (Jeol, Nhật Bản): đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một và hai chiều, sử dụng dung môi CDCl3/CD3OD, chất nội chuẩn là tetramethylsilan (TMS) - Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu - Phƣơng pháp chiết mẫu: chiết hồi lƣu đơn giản với dung môi ethanol 70 %/nƣớc - Phƣơng pháp chiết phân đoạn: chiết lỏng lỏng Quy trình: Thân rễ sâm vũ diệp đƣợc chiết hồi lƣu 3 lần với ethanol 70 % ở ho ol of M ed ici 2.3. 2.3.1. gh t@ Sc 70ºC. Tiến hành lọc loại bỏ bã dƣợc liệu, gộp dịch lọc, sử dụng máy cô quay chân không dƣới áp suất giảm tại 50ºC thu đƣợc cao khô. Cao khô này đem phân tán trong nƣớc rồi lắc lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực khác nhau (ete, ethyl acetat và butanol), thu đƣợc các phân đoạn tƣơng ứng. 2.3.2. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hoá học Sử dụng các kỹ thuật sắc ký bao gồm: - Sắc ký cột: cột nhồi silica gel pha thƣờng và pha đảo - Sắc ký lớp mỏng: để theo dõi quá trình phân lập, kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc dựa trên các phƣơng pháp phổ bao gồm: phổ khối lƣợng (ESI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) kết hợp so sánh dữ liệu phổ thu đƣợc với các dữ liệu phổ đã đƣợc công bố trong các tài liệu tham khảo. Co p yri 2.3.3. 12