Tài liệu Cấu trúc mô của một số hệ cơ quan trên cá tra

PHẦN 1 GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là một trong những vùng kinh tế trọng điểm nằm ở cực Nam của đất nước. Bên cạnh lúa gạo, ĐBSCL còn là vùng nuôi trồng thủy sản lớn nhất nước. Với hệ thống sông ngòi chằn chịt, ĐBSCL là nơi rất thuận lợi cho ngành nuôi trồng thủy sản phát triển, sản lượng thủy sản của vùng đã đóng góp 1 phần đáng kể vào sản lượng thủy sản xuất khẩu của cả nước, góp phần tăng thu nhập cho người dân. Sản lượng thủy sản của ĐBSCL chiếm khoảng 50%, diện tích nuôi trồng khoảng 60% và giá trị xuất khẩu thủy sản chiếm đến 51% của cả nước (Dương Nhựt Long, 2003). Trung Chính vì thế phong trào nuôi trồng thủy sản đã và đang rất thu hút người dân, cùng với chính sách của nhà nước chuyển đổi cơ cấu ngành nghề loại bỏ đất nông nghiệp lạc hậu để chuyển sang nuôi thủy sản thì các mô hình nuôi: nuôi thâm canh, bán thâm canh, nuôi ao mươn vườn, nuôi kết hợp cá-lúa…đang phát triển rầm rộ. Bên cạnh con tôm Sú thì cá Tra cũng là mặt hàng xuất khẩu rất quan trọng của vùng, được nuôi phổ biến ở Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp…và được xuất khẩu sang các nước như: EU, Nga, ASEAN, Ucraina, tâmMỹ, Học liệu ĐH CầnsảnThơ Tàibasa liệu học và nghiên Trung Quốc…Tổng lượng@ cá tra, xuất khẩutập của Việt Nam năm cứu 2007 đạt 383.2 nghìn tấn với kim ngạch đạt 974.12 triệu USD, tăng 31% về lượng và 26.07% so với năm 2006 (http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=26125735&News_ID=263852 08). Tuy nhiên trong nuôi cá tra thâm canh thường nuôi với mật độ dày và sử dụng thức ăn nhiều nên lâu ngày dẫn đến nguồn nước bị ô nhiễm, mầm bệnh dễ có cơ hội tấn công và tình trạng dịch bệnh xuất hiện ngày càng nhiều và khó điều trị. Để điều trị có hiệu quả cao thì phải chuẩn đoán đúng được bệnh, phương pháp mô học có vai trò quan trọng trong khâu này. Nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thương bên ngoài mà không có các dữ kiện khác có liên quan đến cá tôm bệnh thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình thái tổn thương của vài bệnh có thể giống nhau và gây nhầm lẫn trong chẩn đoán (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). Hiện nay có nhiều nghiên cứu về mô bệnh học trên cá tra như: Bước đầu nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra của Nguyễn Quốc Thịnh (2002); nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng hồng cầu trên cá tra bị bệnh vàng da của Phan Thị Hừng (2004); khảo sát mô học cá tra bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm của Trần Thị Ngọc Hân 1 (2006)…nhưng chưa có nghiên cứu nào nghiên cứu hoàn thiện cấu trúc mô của cá tra khỏe làm cơ sở cho nghiên cứu mô bệnh học. Do đó đề tài: “Cấu trúc mô của một số hệ cơ quan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện nhằm: Mục tiêu: Xác định đặc điểm, cấu trúc mô của các hệ cơ quan trên cá tra khỏe từ đó làm thành bộ sưu tập hình ảnh mô học làm cơ sở cho việc chẩn đoán, phát hiện tác nhân gây bệnh thông qua việc so sánh mô cá tra bệnh với các mô cá tra khỏe. Nội dung: Dùng phương pháp mô học để xác định đặc điểm, cấu trúc của các hệ cơ quan như: da, cơ, dạ dày, ruột, gan, mang, bóng hơi, tim, thận, tỳ tạng. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2 PHẦN 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra Trung Cá tra có tên khoa học là Pangasianodon hypophthalmus trước đây còn có tên gọi là Pangasius micronemus, cá tra phân bố ở lưu vực sông Mêkông, có mặt ở cả 4 nước Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan. Trước đây khi chưa có sinh sản nhân tạo, cá bột và cá tra giống được vớt trên sông Tiền, sông Hậu và cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp trong điều kiện tự nhiên địa phận Việt Nam, do đó cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê-kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Về đặc điểm hình thái cá tra thuộc dạng cá da trơn, nhẵn, không có vẩy. Cá tra có đầu lớn, thân thon và hẹp dần về phía đuôi, vây lưng cao có 1 gai cứng và có răng cưa, vây ngực có ngạnh và có độc tố, cá tra thường có màu xám đen trên lưng và phần bụng màu trắng bạc. Cá tra là loài sống đáy, ăn tạp. Trong tự nhiên, cá ăn được mùn bã hữu cơ, rễ cây thủy sinh, rau quả, tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá ... Cá tra không đẻ trong ao nuôi cũng không có bãi đẻ tự nhiên ở Việt Nam, cá tra đẻ ở Cam-pu-chia, cá bột theo dòng nước về Việt Nam. Cá tra còn có cơ quan hô hấp phụ là ruột cá có thể sống được trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, tâmnênHọc liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu oxy hoà tan thấp và có thể nuôi với mật độ rất cao. Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, sau 6 tháng nuôi cá đạt trọng lượng 1-1,2 kg/con. Cá nuôi trong ao có thể đạt trọng lượng 25 kg ở cá 10 năm tuổi (Dương Nhựt Long, 2003) 2.2 Lịch sử mô học Chúng ta đã biết, bệnh trên cá xuất hiện ngày càng nhiều và càng khó điều trị. Vì cá sống trong môi trường nước nên tốc độ lây lan rất nhanh làm cho cá chết hàng loạt gây thiệt hại rất nghiêm trọng về kinh tế cho người dân. Dó đó công tác chữa trị kịp thời là điều rất cần thiết. Để điều trị với chi phí thấp nhất nhưng hiệu quả cao nhất thì việc quan trọng đầu tiên là phải chẩn đoán đúng bệnh. Phương pháp mô học là một phương pháp có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong khâu này. Người được xem là cha đẻ của ngành tế bào học và mô học là nhà phân loại học đồng thời cũng là nhà giải phẩu học người pháp Xanvier Bichat. Ông đã xác định mô là đơn vị cơ bản của sự sống và có 21 loại mô trong cơ thể (Trần Thị Ngọc Hân, 2006). Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) mô bệnh học là phương pháp xác định các tổn thương ở các mô tế bào dựa trên các thủ thuật nhuộm tế bào và quan sát 3 bằng kính hiển vi. Phương pháp này cho phép người phân tích kết luận tính chất của các vùng bị tổn thương. Theo Roberts (1995) phân tích mô bệnh học là nghiên cứu những thay đổi hiển vi diễn ra trong mô của cơ thể trong suốt quá trình bệnh. Những thay đổi này thường là những đặc điểm đặc trưng của bệnh và nó cho phép chẩn đoán chính xác bệnh. Việc nghiên cứu tế bào học và mô học được tiến hành từ rất sớm từ cuối thế kỷ XII nhưng mãi đến thế kỷ XIX thì tế bào học và mô học mới được xem là một môn khoa học. Sau khi học thuyết tế bào ra đời năm 1839, đặc biệt là lĩnh vực mô học mô tả ra đời thì những thành phần cấu tạo khác nhau của cơ quan và các mô được nghiên cứu cẩn thận, tỉ mỉ hơn. Thành tựu lớn nhất của giai đoạn này là chế tạo ra máy cắt lát mỏng (microtome) cho phép nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc vi thể của tế bào và mô (Nguyễn Quốc Thịnh, 2002). Trung Ngoài ra theo Phạm Trần Nguyên Thảo (2003) lịch sử mô học bắt đầu từ khi chiếc kính hiển vi đầu tiên được chế tạo bởi Antoni Van Leuwenhoek (16321723) người Hà Lan và đến cuối thế kỷ XVIII nhà khoa học người Anh Robert Hooke (1635-1703) đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật. Vào cuối thế kỷ XIX, Rudolf Virchow (1821-1902) nhà giải phẩu học người Đức khẳngliệu định: ĐH “ Bệnh tật làThơ do tổn@ thương loạnhọc tế bào”. Trên sở đó mà cứu tâmđãHọc Cần Tàirốiliệu tập vàcơnghiên người ta đã hiểu được rằng bệnh tật không chỉ là do tổn thương, rối loạn ở các cơ quan, nội tạng mà còn ở mức độ mô và tế bào. Mô học có thể định nghĩa như một hệ thống các tế bào và chất gian bào có cùng nguồn gốc, cấu tạo và chức năng, chúng được hình thành trong quá trình tiến hoá sinh học và xuất hiện ở một cơ thể đa bào do quá trình biệt hoá (Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003). Ở nước ta hiện nay mô học đã trở thành một môn khoa học quan trọng và từ lâu đã được đưa vào giảng dạy trong các trường Đại học trên cả nước. Và mô học cũng đã được nghiên cứu nhiều trên người, gia súc, gia cầm, thủy sản … 2.3 Ứng dụng mô bệnh học trong chẩn đoán bệnh thủy sản Young (1959), Johnson (1980) đã ứng dụng giải phẩu học và mô học trong việc hệ thống các bệnh thường gặp trên tôm nuôi ở Châu Mỹ, Châu á (Lightner và ctv, 1992); năm 1997 Wang, Tang và Chen chứng minh sự hiện diện của vi rút đốm trắng trên tôm Giant tiger shrimp, Penaeus monodon, Kuruma shrimp, Penaeus japonicus bằng việc quan sát tiêu bản mô học dưới kính hiển vi quang học và điện tử (trích dẫn bởi Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003). 4 Trong quyển “Histopathology of walking catfish” của Chinabut và Limsuwan (1983) tác giả đã nghiên cứu mô học của cá trê trắng (Clarias batrachus) bị nhiểm khuẩn Aeromonas hydrophyla. Kết quả thấy được khi cá bị nhiểm khuẩn Aeromonas hydrophyla thì gan, thận bị thoái hoá và hoại tử; tỳ tạng bị sung huyết… Trung Nash và ctv (1986) trong nghiên cứu “bệnh vi khuẩn có liên quan đến dịch bệnh ở cá chẽm (Lates calcarifer) và cá bống mú (Epinephalus tauvina)”. Nghiên cứu cho thấy khi bị vi khuẩn tấn công thì có những thay đổi như: lớp biểu bì ở da bị thoái hóa, vẩy bị mất, lớp bì và trung tâm các bó cơ xuất huyết và hoại tử dữ dội, các tế bào bị viêm, sưng, chứa đầy các khuẩn lạc lớn gram âm. Trên thận và tỳ tạng xuất hiện những vùng mô tạo máu bị hoại tử mất hết các tế bào máu trưởng thành, viêm cầu thận và có sự xâm nhập của lympho bào. Gan, tuyến tụy xuất hiện dịch viêm, hoại tử rãi rác và các trung tâm hoại tử. Ở gan, thận tỳ tạng và tuyến tụy đều có sự gia tăng của các trung tâm đại thực bào sắc tố. Tắt nghẽn mạch máu ở tim và xuất hiện dịch viêm ở vách bóng hơi. Rukyani (1990a) nghiên cứu thay đổi mô bệnh học trên mang cá chép (Cyprius carpio) bị nhiểm thích bào tử trùng (Myxobolus). Nghiên cứu mô cho thấy mang cá bị túi thích bào tử trùng ký sinh nhiều thì các phiến mang sẽ bị dính lại, sưng viêm, xung huyết và hoại tử (trích dẫn bởi Bùi Châu tâmTrúc Học ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Đan,liệu 2003). Angka (1990) đã nghiên cứu bệnh trên cá trê trắng (Clarias batrachus) bị nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophyla. Tác giả đã nghiên cứu mô tả về đặc điểm bệnh lý, LD50 và mô bệnh học. Kết quả cho thấy khi cá bị nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophyla thấy xuất hiện những vùng xuất huyết, hoại tử trên gan, thận, tỳ tạng và cơ quan sinh dục. Tác giả còn cho rằng nguyên nhân có thể là do chất Cytoxin do vi khuẩn tiết ra. Sisi Hla Bu và Leong Tak Seng (1997) nghiên cứu mô bệnh học trên cá bống mú bị bệnh “Sleepy Gouper Desease” mỗi điểm cá bệnh lấy 3 mẫu cá khoẻ và 6 mẫu cá bệnh và khảo sát trên 9 cơ quan: mang, tim, thận, tỳ tạng, não, da, dạ dày và ruột. các cơ quan này được cố định, xữ lý nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi quang học kết quả có 5 cơ quan có sự thay đổi cấu trúc hiển vi khi so sánh giữa cá khoẻ và cá bệnh là gan, mang, tim, thận và tỳ tạng (trích dẫn bởi Nguyễn Quốc Thịnh, 2002). Nguyễn Quốc Thịnh (2002) đã nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tác giả đã khảo sát mô bệnh học trên các cơ quan: gan, thận, tim, tỳ tạng, da và cơ của cá khỏe lẫn cá bệnh và kết quả cho thấy khi cá bị bệnh trắng gan thì các cơ quan bị huỷ hoại nhiều 5 nhất là gan, thận và tỳ tạng và kế đến là mang và cuối cùng bị ảnh hưởng nhẹ nhất là tim và cơ. Nguyên nhân làm cho cá chết có thể là do gan, thận, tỳ tạng, mang bị hư hại dẫn đến mất chức năng của các cơ quan này. Bùi Châu Trúc Đan (2003) đã nghiên cứu đặc điểm mô học bệnh phù mắt trên cá tra. Tác giả đã nghiên cứu trên 10 cơ quan gồm: gan, thận, tỳ tạng, tim, mang, ruột, dạ dày, bóng hơi, mắt, da và cơ. Kết quả về đại thể đặc điểm đặc trưng của bệnh là: một hoặc hai mắt phù to, ổ mắt chứa đầy chất dịch màu trắng đục, xuất huyết trong và ngoài cơ thể, về vi thể tổn thương chủ yếu là sung huyết, xuất huyết. Nguyên nhân làm cá chết là do những thay đổi cấu trúc mô của gan, thận, tỳ tạng với các vùng hoại tử và cấu trúc thay đổi và do tổn thương ở mắt dẫn đến rối loạn các hoạt động sinh lý, sinh hóa trong cơ thể. Các cơ quan khác thì bình thường. Trần Hồng Ửng (2003) bước đầu xác định sự thay đổi của tế bào bạch cầu và mô tỳ tạng trên cá tra bị bệnh trắng gan. Kết quả cho thấy khi cá tra bị bệnh trắng gan thì thành phần bạch cầu thay đổi, tế bào lymphocyte thấp hơn so với cá khỏe, neutrophil và monocyte tăng cao hơn. Cấu trúc tỳ tạng biến đổi và thành phần tủy trắng nhiều hơn tủy đỏ. Trung “Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng hồng cầu trên cá tra bị vàng da” ĐH của Phan ThịThơ Hừng @ (2004), giả đã khảotập sát cấu mô của cứu tâmbệnh Học liệu Cần Tàitácliệu học vàtrúc nghiên 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Kết quả khi cá bị bệnh vàng da thì cấu trúc mô của 3 cơ quan này không thay đổi so với cá khỏe và số lượng tế bào hồng cầu giảm đi hơn 50% so với cá khỏe. Nguyễn Quốc Thanh (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của Aflatoxin lên tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống trên cá tra và cá basa. Kết quả cho thấy khi cá bị nhiểm độc tố Aflatoxin thì cấu trúc gan, thận bị sung huyết, xuất huyết, nhân tế bào bị hoại tử… Phạm Thị Như Sang (2006) đã khảo sát mô học trên một số cơ quan của cá tra nuôi ao và bè thâm canh. Tác giả đã phân tích mô học trên 3 cơ quan: gan, thận và tỳ tạng. Kết quả cho thấy cả 3 cơ quan trên đều có trùng bào tử sợi ký sinh. Ngoài ra còn phát hiện giun tròn ở mô gan cá. Cùng thời gian này, Trần Thị Ngọc Hân (2006) cũng đã khảo sát mô học cá tra bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm. Kết quả phân tích mô bệnh học trên 9 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng, dạ dày, bóng hơi, cơ, mang, tim, ruột cho thấy khi cá bị bệnh mũ gan thì thận và tỳ tạng là cơ quan biến đổi đầu tiên, gan biến đổi chậm hơn thận và tỳ tạng. Các cơ quan tim và dạ dày, bóng hơi, ruột ít biến đổi. Tung et al. (1999) nghiên cứu mô học và quan sát bằng kính hiển vi điện tử trên tôm càng xanh bị bệnh vi rút trên cơ Macrobrachium muscle virus 6 (MMV) ở Đài Loan. Dấu hiệu bệnh lý tôm có màu trắng đục ở phần bụng, ăn yếu, bơi lờ đờ. Mô bệnh học tương tự bệnh hoại tử cơ (IMP) và tác giả đã tìm thấy thể vùi trong cơ bị hoại tử ; Bhavan and Geraldine (2002) nghiên cứu mô bệnh học trên gan tuỵ và mang tôm Macrobrachium malcolmsonii khi tiếp xúc với endosulfan. Kết quả có nhiều biến đổi về mô học trên gan tụy và mang tôm. Những biến đổi bao gồm: sự tích tụ của các tế bào hồng cầu trong khe của các xoang, ống gan tụy bị hoại tử, tấm mang không bình thường và phát triển quá mức, bị hoại tử; Andersen et al. (2000) nghiên cứu bệnh mới trên vỏ cua (Sylla serrata) ở Queensland (Australia). Dấu hiệu mô bệnh học của những ống bị hư bên trong thấy có sự lây nhiễm ký sinh trùng và cho rằng đây là nguyên nhân gây ra đốm nâu trên vỏ cua (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Cương, 2006). Theo Trần Thị Ngọc Hân (2006), Hibiya (1982) đã mô tả quá trình biến đổi mô bệnh học trên tất cả các cơ quan trên cơ thể cá bệnh như cá chình, cá chép, cá hồi. Trung Nghiên cứu về mô bệnh học trên cá thơm (Plecoglossus altivelis) bị bệnh xuất huyết do vi khuẩn. Nghiên cứu mô học đã phát hiện những tổn thương ở tỳ tạng, thận, gan, ruột , tim và mang. Những tổn thương ở tỳ tạng và mô tạo máu thì dễ nhận biết do bị tấn công bởi vi khuẩn trên. Những vết hoại tử đi kèm với tâmxuất Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu huyết, đông máu và trương phòng xuất hiện ở phần tủy của tỳ tạng, biểu bì mô và trong thận. Trên gan cũng có hiện tượng hoại tử và sự hình thành vùng áp-xe. Tuy nhiên ruột, tim và mang chỉ bị vi khuẩn P. altivelis tấn công ở mức không đáng kể. Tuy nhiên không có sự tổn thương và vi khuẩn không xuất hiện ở não (http://www.mekongfish.net.vn/modules/news/article.php?storyid=102). Ngoài ra còn có các nghiên cứu mô học chỉ nghiên cứu trên cá khỏe như: Chinabut và ctv (1991) đã nghiên cứu về mô học trên cá trê trắng. Tác giả chỉ khảo sát ở mô khỏe trên các cơ quan thuộc hệ tiêu hoá, hệ tuần hoàn, hệ sinh dục…mục đích chủ yếu là làm cơ sở để so sánh trong nghiên cứu mô học. Grizzle et al. (1976) giải phẩu và nghiên cứu mô học trên cá nheo. Tác giả đã mô tả đặc điểm về mô trên nhiều cơ quan của cá nheo như hệ thần kinh, hệ cơ, hệ tiêu hoá... Groman (1982) đã nghiên cứu mô học trên cá chẽm. Ông đã quan sát cấu trúc mô khỏe của hệ hô hấp, hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ tiêu hoá, hệ sinh dục, hệ bài tiết… ở nhiều giai đoạn của cá từ cá giống đến cá 3 năm tuổi. Nghiên cứu tiếp theo trên cá khỏe là nghiên cứu của Herrera (1996) trên cá rô phi (Oreochromis niloticus). Ông đã dùng phương pháp mô học để tiến hành 7 nghiên cứu trên các cơ quan như da, cơ, xương, hệ tiêu hóa, hệ hô hấp, hệ tuần hoàn, hệ bài tiết, hệ sinh dục, hệ thần kinh… Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 8 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Cá tra khoẻ ở giai đoạn cá thịt, thu khoảng 30 con, mỗi con khoảng 500 gram. 3.2 Địa điểm và thời gian thực hiện Địa điểm thu mẫu: Cần Thơ Địa điểm phân tích mẫu: phòng mô học, khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 2/2008 đến tháng 6/2008 3.3 Vật liệu nghiên cứu 3.3.1 Dụng cụ: gồm có bộ đồ tiểu phẩu, khay nhựa, kính hiển vi, lame, lamell, keo nhựa, cốc thủy tinh (lớn, nhỏ), máy cắt lát mỏng (Microtome), khuôn đúc mẫu, cassette, máy nhuộm mẫu tự động, máy Slide warmer, máy đúc khối, tủ lạnh, tủ hút, viết chì, máy ảnh và một số vật dụng khác. Trung 3.3.2 Hóa chất: gồm có nước cất, cồn tuyệt đối, formol thương mại, Bouin. Xylem, paraffin, sáp ong, dung dịch nhuộm Haematocyline và Eosin, keo dán tâmEnterlan Học liệu ĐHsốCần Thơ cùng một hóa chất khác.@ Tài liệu học tập và nghiên cứu 3.4 Phương pháp nghiên cứu. 3.4.1 Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu mô. Thu mẫu: cá tra khỏe. Về đặc điểm bên ngoài: Cá khỏe là cá bơi lội linh hoạt, nhanh nhẹn, bắt mồi nhanh, phản ứng nhanh với các tiếng động. Màu sắc cá bình thường, lưng có màu xám đen, bụng có màu trắng bạc. Hình dạng bên ngoài bình thường, các vây không bị rách hay bị xuất huyết, không có những vết lỡ loét, xuất huyết trên da cũng như ở các gốc vây Không có dấu hiệu như bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước (hình 3.1). 9 Hình 3.1: Đặc điểm bên ngoài của cá tra khỏe. Về đặc điểm bên trong: Khi mổ cá ra thì bên trong cơ thể không có chất dịch lạ, các cơ quan nội tạng phải có màu sắc bình thường, đồng nhất trên từng cơ quan, các cơ quan không bị sưng hay bị nhũn. Trung Lấy mẫu mô Mẫu mô được lấy ở các cơ quan: da, cơ, hệ tiêu hoá (dạ dày, ruột), mang, bóng hơi, tim gan, thận, tỳ tạng.  Gan, thận, bóng hơi: dùng dao, kéo cắt nguyên cơ quan, sau đó cắt nhỏ ra làm 2 phần và bỏ vào dung dịch cố định.  Da, cơ: dùng lưỡi dao bén cắt dứt khoát, lưỡi dao thẳng góc với bề mặt tâm Họccơliệu Tài liệukhoảng học 1cm. tập và nghiên cứu quan.ĐH Mẫu Cần cắt dàyThơ khoảng@ 2cm, bề dày  Tỳ tạng, tim: dùng kéo cắt nguyên cơ quan.  Mang: dùng kéo cắt đứt 2 gốc xương cung mang và lấy toàn bộ cung mang.  Dạ dày, ruột: dùng kéo cắt lấy nguyên cơ quan, sau đó cắt ra làm 2 đoạn. Đối với các cơ quan có kích thướt lớn khi lấy mẫu mô nên cắt ra làm nhiều phần nhỏ để dung dịch cố định có thể ngấm tốt vào mẫu. 3.4.2 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô  Cố định mẫu Mẫu được cố định bằng Formol 10% hoặc Bouin. Mẫu sau khi được lấy cho vào keo nhựa có chứa dung dịch Bouin để cố định (tỉ lệ 1:10). Riêng mẫu da, cơ và bóng hơi cố định trong Formol 10% cho mẫu mềm hơn. Thời gian cố định 24-48 giờ. 10  Rửa nước Sau khi mẫu được cố định 24 giờ ta tiến hành rửa Bouin bằng nước và cồn 500. Để mẫu dưới vòi nước chảy liên tục 1-2 giờ, rửa mẫu cho đến khi hết dung dịch màu vàng sau đó chuyển mẫu ngâm trong 24 giờ trong cồn 600 .  Cắt tỉa định hướng Sau khi mẫu được ngâm trong cồn 600, lấy mẫu ra và cắt tỉa định hướng mẫu với kích thướt rộng khoảng 0,5-1cm và chiều dày từ 0,3-0,5cm, sau đó cho mẫu vào cassete và ngâm trong cồn 700 1 ngày trước khi tiến hành xử lý mẫu.  Xử lý mẫu Loại nước Sau khi mẫu được rửa sạch Bouin bằng nước máy, loại bỏ nước bằng cách ngâm mẫu trong dung dịch cồn với các nồng độ tăng dần từ 800, 95 0, 1000 để loại sạch hoàn toàn nước trong mẫu. Tẩm dung môi trung gian Paraffin là chất nền giúp cho tế bào vẫn giữ nguyên hình dạng sau khi cắt, nhưng vì paraffin và ethanol không hòa tan vào nhau được nên phải dùng dung môi trung gian là xylen có khả năng hòa tan được cả paraffin và ethanol. Trung tâmTẩm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu paraffin: Paraffin phải được tẩm hoàn toàn vào mẫu, khi tẩm paraffin phải ở trạng thái nóng chảy (khoảng 65 0C) 11 Quy trình xữ lý mẫu (máy xử lý: Sproceeding tissue (MICROM, STP 1202)) STT Hóa chất sử dụng Thời gian 1 Cồn 80% 1h 2 Cồn 90% 1h 3 Cồn 95% 1h 4 Cồn 100% 1h 5 Cồn 100% 1h 6 Cồn 100% 1h 7 Xylen 2h 8 Xylen 2h 9 ĐH Cần Thơ @Xylen 2h Trung tâm Học liệu Tài liệu học tập và nghiên cứu 10 Parafin + sáp ong + xylen (3:2:5) 2h 11 Parafin + sáp ong (3:7) 2h 12 Parafin + sáp ong (5:5) 2h  Đúc khối: (máy đúc khối: MICROM EC 350-1) Chuyển cassette chứa mẫu đã được xử lý vào khoang chứa paraffin nóng chảy trên máy đúc khối, để cassette trong paraffin khoảng 30 phút, tiến hành đúc khối. Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở 650C. Đổ một ít paraffin vào khuôn inox, gắp mẫu bỏ vào khuôn sau đó đặt mẫu ngay ngắn và ấn sát mẫu vào đáy khuôn và đặt khuôn inox lên chổ làm lạnh trên máy đúc khối để cố định sơ bộ mẫu trên khuôn Đặt cassette có ký hiệu mẫu lên trên, tiếp tục đỗ paraffin vào đầy khuôn inox. Tiếp theo đặt khuôn inox qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn và chuẩn bị cắt mẫu. 12  Cắt mẫu (máy cắt mẫu:Yamato-PR-50) Trước khi mẫu đưa vào máy cắt, dùng lưỡi dao cắt tỉa khối paraffin sao cho khối paraffin có hình tháp (hình 3.3). Mục đích của cách làm này là để dễ cắt mẫu và khi cắt ra, mẫu sẽ đẹp. a b Hình 3.2: Khối paraffin trước khi cắt: (a) Khối paraffin có chứa mẫu mô (b) Cassette dùng để giữ khối paraffin Chuẩn bị máy cắt: Đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt. Độ lệch của lưỡi dao so với mặt cắt của khối mẫu tạo thành một góc khoảng 15-300. Khối mẫu sẽ được cắt thành các lát cắt khi tay quay của máy xoay tròn, sau mỗi vòng xoay sẽ có một lắt cắt được hình thành. hànhliệu cắt mẫu: Trung tâmTiến Học ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Gắn mẫu vào máy cắt mỏng (Microtome) theo chiều ngang của cassette sao cho khối mẫu ngang và thẳng đứng sau đó điều chỉnh độ dày của lát cắt. Bắt đầu bằng những lát cắt 12-16  m. Sau khi đã cắt bằng mặt khối mẫu và đạt đến vị trí mẫu mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt về vạch 1-2  m và tiến hành cắt mẫu.  Dán mẫu Mẫu được cắt ra thành những băng dài, sau đó dùng dao thái hoặc kim mũi giáo trải mẫu lên một cốc thủy tinh lớn đựng nước ấm để cho mẫu được căng ra. Sau khi đã chọn được đoạn mẫu đạt yêu cầu, dùng lame để vớt mẫu lên. Cầm 1 đầu của lame, đầu kia cho vào cốc nước thuỷ tinh phía dưới mẫu, sau đó từ từ nâng lên và điều chỉnh cho mẫu ngay ngắn trên lame. Để lame khô tự nhiên khoảng 15 phút sau đó chuyển lame lên máy Slide warmer ủ ở nhiệt độ 450 sau 4 giờ để cố định mẫu lên lame. Sau khi dán mẫu và cố định mẫu trên lame xong ta tiến hành nhuộm mẫu. 13  Nhuộm mẫu Mẫu được nhuộm bằng tay, nhuộm mẫu bằng tay có thể tự điều chỉnh thời gian lại ở bất cứ giai đoạn nào trong khi nhuộm nếu nhuộm không được tốt. Nhuộm mẫu bằng dung dịch Haematoxylin và Eosin (H&E) theo qui trình của Harris (1900) (có điều chỉnh) như sau: Xylen 10 phút Xylen 10 phút Xylen 10 phút Cồn 65 1 phút Haematoxylin 10 phút Cồn 95 1 phút Nước máy 1 phút Cồn 1000 1 phút Cồn 1000 1 phút Cồn 90 1 phút Cồn 1000 1 phút 1% acid acohol Nhúng 3 lần Nước máy 1 phút Cồn 65 1 phút Nước máy 1 phút Cồn 95 1 phút Cồn 90 1 phút Cồn 1000 1 phút Cồn 1000 1 phút Xylen 5 phút Xylen 5 phút Xylen 5 phút Cồn 1000 1 phút Eosin 3 phút 2% potassium acetate 5 phút Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu  Dán lamelle vào lame Để bảo quản mẫu được lâu và tăng tính chiết quang cần dùng keo dán Enterlan để dán tiêu bản vĩnh viễn. Nhỏ một giọt keo lên vùng có miếng mô, đặt lamelle nghiêng 450 và tiếp xúc với giọt keo, dùng kim mũi giáo hạ lamelle xuống từ từ để tránh tạo bọt khí. Để lame khô 24 giờ sau đó đọc kết quả. Thao tác này cần làm nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào miếng mô. 14  Đọc kết quả (kính hiển vi: Carl Zeiss) Sau khi có được tiêu bản hoàn chỉnh ta tiến hành đọc kết quả, tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi lần lượt ở các độ phóng đại 10X, 40X, 100X. Lựa chọn ra các tiêu bản mô đẹp, đạt yêu cầu và chụp ảnh lại các tiêu bản đó. Bằng phương pháp nhuộm H&E có thể quan sát rõ được cấu trúc mô của các cơ quan trên cá tra. Tiêu bản đẹp phải có nhân bắt màu tím xanh của Haematoxylin, phần còn lại bắt màu hồng của Eosin. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 15 PHẦN 4 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 4.1. Da và cơ  Da: Da là cơ quan bao phủ toàn bộ bề mặt cơ thể cá do đó nó tiếp xúc trực tiếp với các điều kiên môi trường bên ngoài cũng như với các loại mầm bệnh. Ngoài chức năng là hàng rào vật lý chống lại mầm bệnh, da còn tham gia quá trình hô hấp và bài tiết, tham gia điều hòa áp suất thẩm thấu và tạo ra tuyến đơn bào, tuyến đa bào, tuyến độc và tạo vẩy ở cá có vẩy (Nguyễn Bạch Loan, 2004). Khi quan sát dưới kính hiển vi, từ ngoài vào trong cấu tạo của da gồm 2 lớp: lớp ngoài cùng là lớp biểu bì, lớp kế tiếp là lớp hạ bì (hay lớp da dưới biểu bì) (hình 4.1). Lớp biểu bì được cấu tạo chủ yếu là các tế bào hình vẩy, theo Roberts (1989) các tế bào này phân tầng với số lượng tế bào thay đổi theo loài, lứa tuổi, vị trí trên cơ thể cá và các giai đoạn của chu kì sinh sản. Trung Lớp giữa của biểu bì là các tế bào chùy có kích thướt lớn, các tế bào này có hình tròn hoặc oval và có 1 nhân hoặc 2 nhân bên trong (hình 4.2). Lớp hạ bì tâmnằm Học ĐHbiểu Cần @ tạo Tàibởiliệu học bên liệu dưới lớp bì vàThơ được cấu các mô liêntập kết, và bên nghiên trong biểu cứu bì phân bố nhiều mạch máu và dây thần kinh (hình 4.3). Ngoài ra trên da cá tra còn có các tế bào sắc tố (melamin), các tế bào này tạo nên màu sắc của da cá và thường phân bố ở nơi tiếp giáp giữa biểu bì và lớp hạ bì và một phần nằm ở bên dưới lớp hạ bì. Theo Chinabut và ctv (1991) lớp biểu bì của cá tra có thể chia làm 2 lớp, lớp mặt là các tế bào hình thoi có thể sắp xếp 2-3 tầng ở bề mặt vùng lưng và 5-6 tầng ở vùng bụng của cơ thể, đây là tầng biểu mô hình vẩy. Ở giữa các tế bào này còn tìm thấy các tế bào tiết dịch nhờn hình tròn hoặc oval. Lớp giữa của biểu bì là các tế bào chùy (Club cells) được bao quanh bởi các tế bào biểu bì khác. Theo Harris và ctv (1973) khi phân tích thành phần hóa học của nhớt cá cho thấy chúng được cấu tạo từ protein và carbohydrate (trích dẫn bởi Chinabut và ctv, 1991). Tác dụng của nhớt cá như là rào cản vật lý bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn, làm giảm tính độc của các vết thương, giảm bớt ma sát của cá khi chúng di chuyển… (Harder, 1975 trích dẫn bởi Groman, 1982). Ngoài ra theo Nguyễn Bạch Loan (2004) các tuyến dịch nhờn có tác dụng tiết dịch nhờn làm trơn bề mặt cơ thể, lắp đầy các chỗ lõm trên cơ thể để giảm ma sát khi di chuyển. Ngoài ra tuyến dịch nhờn còn có tác dụng điều hòa áp suất 16 thẩm thấu và bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh bên ngoài môi trường. B A C D Hình 4.1: Mặt cắt dọc da cá tra (H&E, 10X). A: lớp cơ; B: lớp hạ bì; C: lớp biểu bì; D: các tế bào sắc tố (melanin) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu C B A Hình 4.2: Mặt cắt dọc lớp biểu bì da cá tra (H&E, 100X). A: tế bào biểu mô; B: tế bào chùy; C: các tế bào sắc tố (melanin) 17 B A Hình 4.3: Mặt cắt dọc lớp hạ bì (H&E, 100X). A: mô liên kết; B các dây thần kinh  Cơ Trung Cơ thường nằm dọc 2 bên thân cá và ở vách của các nội tạng. Đơn vị của cơ là các tế bào cơ. Cơ cá có chức năng phối hợp với các xương trong sự vận động, tâmsựHọc liệucủa ĐH Tài họctạng tập vànhư nghiên di chuyển cácCần khớp Thơ xương,@ sự co thắtliệu của nội cũng sự bơm cứu máu (ở cơ tim). Có 3 loại cơ: cơ trơn, cơ vân và cơ tim. Cơ trơn được tìm thấy chủ yếu ở vách nội tạng, các tuyến, các ống dẫn, các mạch máu,... cơ trơn có dạng hình thoi, ngắn, thô và chịu sự điều khiển của hệ thần kinh giao cảm nên phản ứng chậm chạp (cơ trơn sẽ được mô tả chi tiết ở phần các cơ quan nội tạng). Cơ vân thường liên kết với xương, giúp xương cử động nhịp nhàng. Cơ vân chịu sự điều khiển của hệ thần kinh trung ương thuộc não và tủy sống nên phản ứng nhanh nhẹn. Cơ vân có dạng hình thoi, thon dài và thường phân bố ở 2 vách thân, thực quản ... nên nó chiếm tỉ lệ cao trong cơ thể cá (Chinabut và ctv,1991) Cơ tim phân bố ở tim cá, nó có đặc tính trung gian giữa cơ vân và cơ trơn. Tế bào cơ tim rộng, ngắn, thô như cơ trơn, mỗi tế bào chỉ có 1 nhân. Cơ tim chịu sự chi phối của hệ thần kinh giao cảm nhưng cơ tim co giãn nhanh hơn cơ trơn nhưng chậm hơn cơ vân ( Nguyễn Bạch Loan, 2004) (cơ tim sẽ được mô tả chi tiết ở phần tim) Đơn vị nhỏ nhất của cơ là các sợi cơ (tế bào cơ), trong sợi cơ có hàng trăm dây tơ prôtêin nhỏ được tách ra thành 2 sợi: sợi actin (mõng) và mioxin (dày). Khi 18 cơ cá cử động hay co rút là kết của của sự đan xen giữa 2 sợi này vào nhau (Chinabut và ctv, 1991). Cơ cá tra được quan sát ở đây là cơ vân dọc 2 bên thân cá, cơ nằm dưới lớp hạ bì của da. Khi quan sát mặt cắt dọc của lớp da cơ từ ngoài vào trong ta thấy đầu tiên là lớp biểu bì của da kế đến là lớp hạ bì và trong cùng là lớp cơ (hình 4.1). Ở mặt cắt dọc ta thấy các sợi cơ chạy dọc và bên trong có 1 nhân (hình 4.4) B A Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hình 4.4: Mặt cắt dọc cơ vân cá tra (H&E, 100X). A: tế bào cơ; B: nhân Ở mặt cắt ngang ra thấy các bó cơ có hình đa giác hoặc hình tròn nhưng không nhìn thấy nhân, giữa các bó cơ này là các mô liên kết (hình 4.5). A 19 Hình 4.5: Mặt cắt ngang cơ vân cá tra (H&E, 40X). A: các bó cơ 4.2. Dạ dày và ruột  Dạ dày Dạ dày nằm nối tiếp sau thực quản và kết thúc ở cơ co thắt môn vị ở phần ruột trước. Chức năng chính của dạ dày là chứa thức ăn và tiết ra các men tiêu hóa thức ăn. Dạ dày có cấu trúc giống như thực quản nhưng lớp cơ bên ngoài của thực quản là lớp cơ vân còn ở dạ dày là cơ trơn. Dạ dày cá tra có hình chử J bao gồm 2 phần: phần thân vị và phần môn vị. Khi quan sát ở mặt cắt ngang của phần thân vị ta thấy từ ngoài vào là lớp thanh mạc được cấu tạo bởi mô liên kết sợi, kế đến là lớp cơ trơn bao gồm lớp cơ dọc bao bên ngoài và lớp cơ vòng bao bên trong, đây là lớp cơ có chức năng co bóp giúp chon quá trình tiêu hóa thức ăn, tiếp theo là lớp dưới niêm mạc được cấu tạo bởi các mô liên kết và có nhiều mạch máu phân bố và trong cùng là lớp niêm mạc dạ dày được cấu tạo bởi các tế bào biểu mô trụ đơn với các tuyến thuộc dạ dày (hình 4.6). Theo chinabut và ctv, 1991 lớp dưới niêm mạc cấu tạo bởi lớp mô liên kết có chứa các lympho bào nhỏ và các tế bào hạt ưa eosin. mônliệu vị cũng nhưThơ phần thân vị nhưng tuyếnvà dạ nghiên dày và lớp cứu Trung tâmPhần Học ĐHgiống Cần @ Tài liệukhông họccótập cơ trơn bên ngoài thì dày hơn (Grizzle & Rogers , 1976). F B C D A E Hình 4.6: Mặt cắt ngang của dạ dày (H&E, 10X). A: lớp thanh mạc; B: lớp cơ dọc; C: lớp cơ vòng; D: lớp dưới niêm mạc; E: mạch máu; F: tuyến thuộc dạ dày. 20