Tài liệu Cấu trúc mô của các cơ quan trên cá lóc cấu trúc mô của các cơ quan trên cá lóc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ NGỌC HƯỜNG C CẤ ẤU UT TR RÚ ÚC CM MÔ ÔC CỦ ỦA AC CÁ ÁC CC CƠ ƠQ QU UA AN NT TR RÊ ÊN NC CÁ ÁL LÓ ÓC C ((C Chhaannnnaa SSttrriiaattaa B Blloocchh,, 11779933)) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ NGỌC HƯỜNG C CẤ ẤU UT TR RÚ ÚC CM MÔ ÔC CỦ ỦA AC CÁ ÁC CC CƠ ƠQ QU UA AN NT TR RÊ ÊN NC CÁ ÁL LÓ ÓC C ((C Chhaannnnaa SSttrriiaattaa B Blloocchh,, 11779933)) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PHẠM THANH LIÊM ĐẶNG THỤY MAI THY 2008 Chương I GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng hạ lưu châu thổ sông Mê-Kông, được xem là vùng trù phú nhất không chỉ của Việt Nam mà còn của cả khu vực Đông Nam Á. Nơi đây có đặc trưng của một châu thổ thuộc miền nhiệt đới ẩm điển hình. Với hệ thống sông ngòi chằng chịt, ĐBSCL còn là vùng nuôi thủy sản lớn nhất của cả nước, sản lượng nuôi trồng thủy sản chiếm khoảng 65%, diện tích nuôi trồng khoảng 60% và giá trị xuất khẩu thủy sản chiếm đến 51% của cả nước (Dương Nhựt Long, 2003). Nhiều mặt hàng thủy sản của vùng không chỉ đáp ứng nhu cầu trong nước mà còn có giá trị xuất khẩu cao. Trong đó, cá lóc (Channa striata Bloch, 1973) là loài cá quen thuộc của người dân, được nuôi phổ biến khắp các tỉnh ĐBSCL, không chỉ bởi đặc điểm dễ nuôi, chất lượng thịt ngon mà còn do chúng có giá trị dinh dưỡng cao và phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng. Thời gian qua hiệu quả lợi nhuận thu được từ hoạt động nuôi đối tượng này đã góp phần cải thiện và nâng cao điều kiện sống của nhiều bà con nông thôn ĐBSCL. Trung Trong những năm gần đây, nghề thủy sản ngày càng phát triển và người dân không ngừng đưa mô hình nuôi thâm canh vào trong nuôi trông thủy sản để tâmtăng Học @đếnTài học nghiên năngliệu suất.ĐH Vấn Cần đề nàyThơ đã dẫn sự liệu gia tăng khảtập năngvà ô nhiễm môi cứu trường, cũng như những hiện tượng bệnh trên các đối tượng nuôi…Trước tình hình đó, việc nghiên cứu cấu trúc vi thể và chức năng hoạt động của các cơ quan trên cá khỏe cũng như những thay đổi cấu trúc của cá khi nhiễm bệnh là hết sức cần thiết. Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp đã được áp dụng để hỗ trợ cho việc nghiên cứu cá cũng như các đối tượng thủy sản khác, và mô học được xem là một trong những phương pháp hiệu quả. Phương pháp mô học đã và đang được các nhà khoa học vận dụng vào nghiên cứu của họ trên nhiều động vật khác nhau. Nó được xem như là khoa học nghiên cứu sự phát triển, cấu tạo và hoạt động của các mô, cơ quan của cơ thể. Bằng phương pháp này, ta có thể quan sát được cấu trúc vi thể của các cơ quan trong cơ thể của cá nói riêng ở từng giai đoạn phát triển của chúng, cũng như chẩn đoán và phòng bệnh trên các động vật thủy sản. Vì những lý do trên, đề tài “Cấu trúc mô của các cơ quan trên cá lóc (Channa striata Bloch, 1973)” được thực hiện nhằm mục đích: thành lập một bộ sưu tập cấu trúc vi thể của các cơ quan trên cá lóc khỏe tạo tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo. 1 Nội dung đề tài Dùng phương pháp mô học để quan sát cấu trúc 9 cơ quan trên cá lóc khỏe gồm: da, cơ, mang, tim, gan, thận, tỳ tạng, dạ dày và ruột. Phân tích và mô tả cấu trúc vi thể của các cơ quan đã quan sát. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2 Chương II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về nghiên cứu mô học Việc nghiên cứu tế bào và mô học bắt đầu từ thế kỷ XVII nhưng mãi đến gần cuối thế kỷ XIX, tế bào học và mô học mới thực sự được coi là ngành khoa học. Trung Malpighi (1624-1694), một trong số những nhà khoa học Châu Âu đã có hàng loạt phát hiện có giá trị trong việc nghiên cứu tế bào và mô. Vào khoảng những năm 1675-1680, ông đã mô tả cấu tạo của da, thận, lách và một số cơ quan khác của cơ thể, do đó một số cấu trúc đã được mang tên ông. Năm 1677, người thợ kính Hà Lan Anatolie Leeuwenhoek đã chế tạo được chiếc kính hiển vi có độ phóng đại đối tượng quan sát tới 300 lần. Từ đó, ông đã có khả năng mô tả hồng cầu và sự vận chuyển chúng trong các mao mạch máu, phát hiện những tinh bào, nhìn thấy những vạch sáng, tối của sợi cơ vân, cấu tạo sợi thần kinh, sợi gân. Tuy vậy, việc nghiên cứu cấu tạo vi thể của cơ thể động vật được tiến hành muộn hơn so với việc nghiên cứu thực vật. Vào năm 1825-1827, Purkinje mô tả nhân của noãn trong trứng gà và sau đó chính ông đã mô tả bào tương của tế bào. Ít năm sau, Brown (1831) cũng mô tả nhân tâmtrong Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu tế bào thực vật. Những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học kể trên cũng như những công trình nghiên cứu của Dutrochet, Valentin, Schleiden đã giúp cho Schwann xây dựng và công bố học thuyết tế bào vào năm 1839 (trích dẫn bởi Phạm Phan Địch, 2004). Xanvier Bichat (1771 -1802), giảng viên dạy giải phẩu học và phẩu thuật tại trường đại học của Pari, đã đưa ra khái niệm chung đầu tiên về mô học trên động vật, và từ đó mô học trở thành một phần của môn giải phẩu học dạy cho sinh viên y khoa. Tiếp theo đó, các nhà động vật học đã vận dụng công cụ mới này vào nghiên cứu của họ trên nhiều động vật khác nhau. Trước sự tiến bộ của nghiên cứu mô học, các nhà sinh vật học đã nhận ra rằng đây là ngành khoa học không chỉ hữu ích để nghiên cứu cơ quan bình thường mà còn là cơ sở cho việc nghiên cứu những thay đổi bệnh lý của mô, cơ quan bệnh (trích dẫn bởi Hibiya, 1982). Thêm vào đó, sự có mặt của parrafin cũng góp phần không nhỏ đối với nghiên cứu mô học. Năm 1830, Carl Reichenbach đã phát hiện ra sáp parrafin, chất dùng cho việc cố định mẫu mô vào khung để cắt mẫu dễ dàng hơn. Nó là một chất sáp màu trắng, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy khoảng 470C640C. Parrafin không tan trong nước nhưng có thể tan trong ete, benzen, và tan 3 ít trong este. Vì nhiệt độ nóng chảy của parrafin tương đối thấp và có thể đông nhanh nên quá trình đúc khối mẫu mô được thực hiện một cách dễ dàng (http://en.wikipedia.org/wiki/Paraffin). Những thành công tiếp theo trong kỹ thuật mô học nữa thế kỷ XIX như việc chế tạo máy cắt lát mỏng (microtome), cho phép người ta nghiên cứu tỉ mỉ cấu trúc vi thể của các tế bào và mô. Máy microtome có khả năng cắt mẫu mô thành những lát rất mỏng (vài micromet) để quan sát cấu trúc vi thể các mô, cơ quan dưới kính hiển vi. Đến cuối thế kỷ XIX, sau khi học thuyết tế bào ra đời thì ngành mô học mô tả bắt đầu phát triển mạnh. Những thành phần khác nhau của các cơ quan và các mô đã được nghiên cứu cẩn thận. Từ các kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu cấu tạo vi thể tế bào đã cho phép người ta tách việc nghiên cứu tế bào thành một phần riêng biệt trong mô học gọi là Tế bào học. Học thuyết tế bào không chỉ là cơ sở của việc nghiên cứu cấu trúc mô bình thường mà còn là cơ sở của việc nghiên cứu những thay đổi bệnh lý của mô, cơ quan và đồng thời nó cũng là cơ sở của việc nghiên cứu những hoạt động sinh lý (Phạm Thanh Liêm, 2004). Trung Rudolph Virchow (1821 -1902), một nhà nghiên cứu bệnh người Đức đã đề ý tưởng: có thểThơ được đặc bởi những cấp độ tế cứu tâmxuất Học liệu “bệnh ĐH Cần @ trưng Tài liệu học biến tậpđổi vàở nghiên bào”. Ý tưởng này của ông đã đóng góp to lớn cho học thuyết tế bào và cho sự phát triển của mô bệnh học. Từ đó, mô học không chỉ được ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc mô bình thường mà còn được áp dụng trong nghiên cứu những biến đổi cấu trúc của các cơ quan khi bị nhiễm bệnh. Những tiến bộ về mặt kỹ thuật mô đã thúc đẩy ngành mô học ngày càng phát triển mạnh mẽ và chuyên sâu hơn trên nhiều đối tượng khác nhau. Và đến khi thủy sản trở thành ngành mũi nhọn ở nhiều quốc gia thì mô học cũng trở thành một công cụ không thể thiếu để nghiên cứu trên các đối tượng thủy sản. 2.2 Nghiên cứu mô học trên cá Trên cá, nghiên cứu mô học và mô bệnh học đã được tiến hành khá nhiều trên thế giới từ nữa cuối thế kỷ XX như: Vào năm 1982, Hibiya đã dùng mô học để mô tả cấu trúc bình thường của tất cả các cơ quan trên một số loài cá, đồng thời ông cũng phân tích những biến đổi của các cơ quan ấy khi cá bị tác nhân gây bệnh xâm nhập. Tác giả đã nghiên cứu trên các loài cá quan trọng như cá chép, cá hồi, cá chình (Anguilla anguilla, Anguilla japonicus). 4 Cũng trong năm 1982, Groman đã dùng mô học để nghiên cứu cấu trúc mô bình thường trên cá chẽm. Nghiên cứu này được tiến hành có ý nghĩa như một tiền đề cho những nghiên cứu kế tiếp. Ông đã quan sát cấu trúc vi thể bình thường của hệ hô hấp, hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ tiêu hoá, hệ sinh dục, hệ bài tiết,…ở nhiều giai đoạn của cá từ cá giống đến cá 3 năm tuổi. Nash ctv. (1986) cũng đã dùng phương pháp mô học để xác định những thay đổi vi thể trên các cơ quan cá khi bị vi khuẩn tấn công (trong nghiên cứu bệnh vi khuẩn có liên quan đến dịch bệnh ở cá chẽm (Lates calcarifer) và cá bống mú (Epinephalus tauvina). Nghiên cứu cho thấy nhiều thay đổi như: lớp biểu bì ở da bị thoái hóa, vẩy bị mất, lớp bì và trung tâm các bó cơ xuất huyết và hoại tử dữ dội, các tế bào bị viêm, sưng, chứa đầy các khuẩn lạc lớn gram âm. Trên thận và tỳ tạng xuất hiện những vùng mô tạo máu bị hoại tử mất hết các tế bào máu trưởng thành, viêm cầu thận và có sự xâm nhập của lympho bào. Gan, tuyến tụy xuất hiện dịch viêm, hoại tử rãi rác và các trung tâm hoại tử… (trích dẫn bởi Bùi Châu Trúc Đan, 2003). Trung Cũng vào năm 1986, Miyazaki ctv. mô tả những biến đổi mô bệnh học của cá nheo Mỹ khi bị Ictalurus punctatus tấn công cùng với Ichthyobodo necator, Ambiphyrya ameiuri, Apiosoma micropteri, và Heteropolaria colisarum. Sau khi đã quan sát biểu hiện ngoài và kiểm tra ký sinh trùng, họ tiến hành làm tâmmẫu Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu mô của da, mang và các cơ quan nội tạng. Kết quả cho thấy những sợi mang bị nhiễm I. necator nặng sẽ có sự phát triển quá mức của tế bào biểu mô mang, thay đổi này làm rối loạn hoạt động hô hấp của mang và ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của cơ thể. Còn khi A. ameiuri bám vào bề mặt cơ thể gây ra sự thói hóa da, A. micropteri bám chặt vào mang làm thói hóa biểu mô hô hấp, H. colisarum xâm nhập vào da thì hình thành những vết loét trên bề mặt cơ thể kể cả các vi. Nối tiếp những nghiên cứu về bệnh cá, Shariff (1989) tiến hành nghiên cứu mô bệnh học trên mắt cá chép đầu lớn (Anristichthys nobilis) bị nhiễm trùng mỏ neo (Lernaea piscinae). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy sự thay đổi mô bệnh học trên mắt cá khi trùng mỏ neo xâm nhập và phát triển trong nhiều tế bào mô của mắt. Rukyani (1990) nghiên cứu thay đổi mô bệnh học trên mang cá chép (Cyprinus carpio) bị nhiễm thích bào tử trùng (Myxobolus). Kết quả cho thấy: các phiến mang bị dính lại, sưng viêm, xung huyết và hoại tử khi mang cá bị túi thích bào tử trùng ký sinh nhiều (trích dẫn bởi Phạm Thị Như Sang, 2006). Chinabut ctv. (1991) đã nghiên cứu và mô tả cấu trúc vi thể của tất cả các cơ quan trên cá trê trắng Clarias batrachus. Họ tiến hành nghiên cứu trên cá trê 5 trắng khỏe và đã mô tả cấu trúc bình thường của các hệ cơ quan như: hệ cơ, bộ xương, hệ tiêu hóa, hệ tuần hoàn, hệ bài tiết, hệ hô hấp, hệ sinh dục… Kết quả của nghiên cứu này sẽ là cơ sở so sánh khi cá bệnh. Nghiên cứu tiếp theo trên các đối tượng cá khỏe là nghiên cứu của Herrera (1996) trên cá rô phi (Oreochromis niloticus). Ông cũng dùng mô học để nghiên cứu và đã tiến hành mô tả cấu trúc vi thể các cơ quan như hệ da, hệ cơ, hệ xương, hệ tiêu hóa, hệ hô hấp, hệ bài tiết, hệ sinh dục, hệ thần kinh, các cơ quan cảm giác, hệ tuần hoàn,… Đối tượng thí nghiệm của ông trong nghiên cứu này là cá rô phi ở giai đoạn từ một tuần tuổi (dài từ 1.0-1.3cm) đến cá trưởng thành (dài từ 15-20cm). Tiếp theo đó, phương pháp mô học cũng đã được Chinabut và Robert áp dụng khi họ nghiên cứu về bệnh bệnh lở loét (Epizootic Ulcerative Syndrome- EUS) trên cá vào năm 1999. Họ đã mô tả những biến đổi cấu trúc của các cơ quan như da, cơ, thận, ống mật,… trên các loài: cá lóc, cá chép Ấn Độ, cá rô phi, cá hồi,... Ở nước ta nói chung và ở Đại học Cần Thơ nói riêng cũng đã có những nghiên cứu mô học trên các đối tượng thủy sản, đặc biệt là trên cá tra như: Trung Nguyễn Quốc Thịnh (2002) với đề tài “Nghiên cứu mô bệnh đốm trắng trong tâmnộiHọc Cần hypophthalmus)” Thơ @ Tài liệu vàcứu nghiên tạng liệu cá tra ĐH (Pangasius đã tiếnhọc hànhtập nghiên mô học cứu trên cá tra nuôi ao, bè ở các cơ quan như: gan, thận, tỳ tạng, tim, mang, cơ của cá khỏe và cá bệnh. Tác giả đã so sánh và đưa ra kết quả về những biến đổi cấu trúc của mô cá bệnh so với cá khỏe như hiện tượng xung huyết, xuất huyết và hoại tử. Bùi Châu Trúc Đan (2003) cũng dùng phương pháp mô học nghiên cứu cấu trúc vi thể của cá tra khỏe và cá tra bệnh phù mắt trên các cơ quan: da, cơ, mang, tim, gan, thận, dạ dày, mắt… Dựa trên đặc điểm phân tích được từ cá bệnh, tác giả kết kuận cá tra bị bệnh phù mắt có các tổn thương chủ yếu là xung huyết, xuất huyết. Các cơ quan bị tổn thương nặng nhất là gan, tỳ tạng và mắt với những vùng hoại tử và mất cấu trúc. Cũng vào năm 2003, Trần Hồng Ửng đã tiến hành nghiên cứu sự thay đổi mô tỳ tạng và số lượng tế bào bạch cầu trên cá tra có dấu hiệu trắng gan. Tác giả tiến hành quan sát cấu trúc vi thể của tỳ tạng cá tra bình thường sau đó so sánh với tỳ tạng của cá khi chúng có dấu hiệu trắng gan, đồng thời tác giả cũng so sánh thành phần phần trăm các loại tế bào bạch cầu giữa cá bệnh và cá khỏe. Kết quả cho thấy tỳ tạng ở cá bệnh có phần tủy trắng chiếm nhiều hơn so với cá khỏe, khi cá bị bệnh nặng thì xuất hiện nhiều vùng hoại tử, tỳ tạng mất chức năng sản sinh ra các tế bào hồng cầu, bạch cầu… 6 Đến năm 2004, Phan Thị Hừng dùng mô học nghiên cứu cá tra bị bệnh vàng da trên các cơ quan như: gan, thận và tỳ tạng, đồng thời chị cũng nghiên cứu về sự biến động số lượng tế bào hồng cầu của chúng khi bị bệnh. Sau khi so sánh với cấu trúc mô của các cơ quan này ở cá bệnh với cá khỏe, tác giả cho biết cá tra bị bệnh vàng da có cấu trúc mô gan, thận, tỳ tạng không thay đổi nhiều so với cá khỏe. Tuy nhiên, do số lượng hồng cầu trong máu cá bệnh giảm 50% so với ở cá khỏe nên lượng hồng cầu trong các mao mạch của gan, thận, tỳ tạng cá bệnh rất ít so với cá khỏe... Trần Thị Ngọc Hân (2006) đã tiến hành “Khảo sát mô học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm”. Với đề tài này, tác giả cũng mô tả sự biến đổi cấu trúc mô ở 9 cơ quan của cá tra giống khi gây cảm nhiễm vi khuẩn Edwarsiella ictaluri, và tiến hành so sánh sự biến đổi cấu trúc mô của cá ở 2 phương pháp gây cảm nhiễm: ngâm và tiêm. Kết quả cho thấy thận và tỳ tạng là 2 cơ quan biến đổi đầu tiên khi cá bị vi khuẩn gây bệnh xâm nhập. Trong cùng mật độ vi khuẩn, cấu trúc mô của mẫu thu ở phương pháp tiêm có sự biến đổi nhanh hơn mẫu thu ở phương pháp ngâm… Trung Phạm Thị Như Sang (2006) nghiên cứu đặc điểm mô học của cá tra nuôi ao và bè thâm canh trên 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Kết quả phân tích cho thấy: cá nuôi ao hay nuôi bè đều có biến đổi vi thể tương đối giống nhau trong cùng tâmbiểu Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu hiện bệnh. Trên cả 3 cơ quan khảo sát đều có sự xuất hiện của trùng bào tử sợi Myxozoa ký sinh làm cho các cơ quan này bị hoại tử và mất chức năng. 2.4 Vài nét về cá lóc 2.4.1 Đặc điểm sinh học của cá lóc Theo Phạm Văn Khánh, 2000 thì cá lóc được phân loại như sau: Bộ cá vược Perciformes Họ cá Lóc Channidae Giống cá Lóc Channa Loài cá Lóc Channa striata Bloch, 1793 Cá lóc sống phổ biến ở đồng ruộng, kênh rạch, ao, hồ, sông… thích nghi được cả với môi trường nước đục, nước tù, nước lợ và có thể chịu đựng nhiệt độ trên 30oC (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hồ, 2001). Do có khả năng hô hấp phụ nên chúng có thể sống rất lâu trên cạn chỉ cần ẩm ướt toàn thân. Cá sống chủ yếu ở nước ngọt nhưng cũng gặp ở môi trường nước lợ 5 -7 o/oo (Phạm Văn Khánh, 2000). 7 Cá lóc là loài cá dữ cơ thể có hình dạng tròn dài, thực quản ngắn và vách dày, bên trong thực quản có nhiều nếp nhăn. Dạ dày dạng túi, to, hình chữ Y. Quan sát trong ống tiêu hóa của cá có chứa cá chiếm 63,01%, tép 35,94%, ếch nhái 1,03% và 0,02% là bọ gạo, côn trùng và mùn bã hữu cơ. Đặc điểm này chứng tỏ đây là loài cá ăn động vật điển hình (Dương Nhựt Long, 2003). Cá lóc có thể sinh sản quanh năm nhưng thường tập trung từ tháng 5-7 dương lịch hàng năm và đẻ rộ sau những cơn mưa lớn. Sức sinh sản của cá phụ thuộc vào trọng lượng cá cái: cá có trọng lượng từ 1-1,5kg sức sinh sản từ 15000020000 trứng/ tổ cá và từ 5000-10000 trứng/ tổ đẻ (Kiểm ctv., 2004). Cá thường đẻ vào sáng sớm sau mỗi trận mưa rào một hai ngày ở nơi yên tĩnh và có nhiều động vật thủy sinh. Trước lúc đẻ, cá dùng miệng thu rong, cỏ nước làm tổ hình tròn, đường kính khoảng 40-50cm. Sau khi đẻ, cá bố mẹ nằm dưới bảo vệ tổ đẻ. Ở nhiệt độ 20-35 oC sau 3 ngày trứng nở thành cá bột. Trong môi trường tự nhiên, sau 3 ngày cá tiêu hết noãn hoàng, cá con cỡ 4-5cm bắt đầu tách khỏi đàn sống độc lập (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hồ, 2001). 2.4.2 Tình hình nuôi cá lóc ở ĐBSCL Trung Cá lóc là loài cá rất quen thuộc với bà con vùng ĐBSCL không chỉ vì đây là loài cá có chất lượng thịt ngon, dễ nuôi mà còn vì nó đã góp phần giúp bà con tâmnông Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu dân thoát nghèo và ngày càng nâng cao cuộc sống vật chất của họ. Có thể nói An Giang và Đồng Tháp là hai tỉnh nuôi cá lóc nhiều nhất ở ĐBSCL với các mô hình nuôi như nuôi cá lóc đăng quần, nuôi mùng trong mùa lũ. Các hình thức nuôi này khá hiệu quả, vừa dễ tiến hành, người dân lại không cần có diện tích đất nuôi nên được nuôi phổ biến. Theo kết quả điều tra ở thời điểm tháng 4/2005, sản lượng cá lóc nuôi trong toàn tỉnh An Giang là 6.911 tấn, tập trung nhiều ở các huyện như: Phú Tân 2.593 tấn, Chợ Mới 812 tấn, Châu Đốc 742 tấn, An Phú 687 tấn, Thoại Sơn 616 tấn, Long Xuyên 529 tấn, Châu Phú 494 tấn,… Các hình thức nuôi chủ yếu là nuôi ao và nuôi vèo, cụ thể như sau: Nuôi ao có diện tích: 64,7 ha, sản lượng là 2.543 tấn, chiếm 36,8 %, Nuôi vèo có diện tích: 9,758 ha, sản lượng là 2.721 tấn chiếm 39,4 % Các hình thức nuôi khác như: Nuôi bè, nuôi chân ruộng 23,8 % (Trần Phùng Hoàng Tuấn, 2005). Ngoài những mô hình nuôi mùa lũ đã nêu thì cá lóc còn được nhiều hộ dân ở Bến Tre nuôi trong vèo lưới với qui mô công nghiệp cũng có hiệu quả. 8 Vèo nuôi cá thương phẩm với mật độ là 50 con/m 2. Vèo được xây dựng hình vuông hoặc hình chữ nhật, đáy vèo đặt cách đáy ao khoảng 0,5m, độ sâu nước trong vèo phải đạt từ 2,5m trở lên. Nuôi cá lóc trong vèo có nhiều ưu điểm như nuôi ở mật độ cao để có sản lượng lớn, thức ăn được tập trung, cá không bị cọ sát đáy ao hoặc không chui được xuống bùn nên ít bị xây xát, cá tập trung ăn và ngủ rồi lại ăn nên cá tăng trọng nhanh và kích cỡ đồng đều. Giá trị thương phẩm cao hơn cá chỉ trong nuôi ao. Đồng thời, bên ngoài vèo lưới thả thêm các loại cá ăn tạp nhằm cải tạo ao, tận dụng thức ăn thừa, đây cũng là nguồn thu không nhỏ (Trần Quốc, 2007). Do cá lóc là loài thích nghi tốt với điều kiện môi trường nên chúng được nuôi ngày càng phổ biến trong nhiều mô hình. Ngoài các mô hình nuôi cá lóc thoát nghèo trong mùa lũ thì còn có vài mô hình nuôi cá lóc như sau: Mô hình nuôi cá lóc trong ao Trung Diện tích nuôi từ 100-1000m2, sâu từ 1,5-2m. Mật độ trung bình 20-30con/m2 tùy vào kích cỡ giống thả nuôi (cá 7-10cm mật độ từ 10- 20con/m2, 5-7cm nuôi 20-50con/m2). Thức ăn có thể sử dụng để cho cá ăn là thức ăn tươi sống như: cá tạp, ếch nhái, tép, thức ăn công nghiệp hoặc thức ăn tự chế biến… Khẩu phần ăn mỗi ngày từ 5-7% trọng lượng cá. Sau khi nuôi 6-7 tháng, nếu sócliệu và quản tốt thì Thơ cá có thể trọng lượng từ tập 0,8-1kg/con (Dương cứu tâmchăm Học ĐHlýCần @đạt Tài liệu học và nghiên Nhựt Long, 2003). Mô hình nuôi cá lóc trong giai đặt trong ao đất Cỡ giống được chọn từ 20-30g/con, mật độ thả trung bình từ 60- 90con/m 3. Thức ăn cho cá cũng tương tự khi nuôi cá trong ao. Khẩu phần ăn tùy thuộc vào sức khỏe và giai đoạn phát triển của cá, ví dụ: cỡ cá 20-30g/con mỗi ngày cho ăn 5-8% trọng lượng cơ thể sau đó tăng lên 5% khi cá có trọng lượng >100g/con. Sau 7-8 tháng nuôi cá có thể đạt trọng lượng 1,2-1,5kg/con (Dương Nhựt Long, 2003). 2.4.3 Những nghiên cứu trên cá lóc Trong nghiên cứu về lĩnh vực sinh sản nhân tạo, cá lóc đã được bộ môn Kỹ Thuật Nuôi Cá Nước Ngọt Khoa Nông Nghiệp cho sinh sản thành công từ năm 1997-1998. Tiếp theo đó, Phan Phương Loan (2000) tiến hành thử nghiệm ương nuôi cá lóc đen (Ophiocephalus striatus) bằng một số loại thức ăn khác nhau. Thí nghiệm tiến hành trên 3 loại thức ăn là trùn chỉ, cá nục và thức ăn chế biến. Kết quả cho thấy, cá ăn trùn chỉ và cá nục có tốc độ tăng trưởng nhanh hơn cá ăn thức ăn chế biến. 9 Năm 2001, Ngô Thị Hạnh nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh học, biện pháp kích thích sinh sản nhân tạo và ương nuôi cá lóc (Channa striatus Bloch, 1797). Cá lóc nuôi vỗ trong thí nghiệm được cho ăn bằng cá tạp, cá biển xắt nhỏ. Kết quả thu được là sau khi nuôi vỗ 33 ngày cá có thể tái thành thục và tiến hành kích thích sinh sản. Các chỉ tiêu sinh học được khảo sát trong quá trình ương cá lóc giống bao gồm: ngưỡng oxy, ngưỡng nhiệt độ, ngưỡng độ mặn, ngưỡng pH,… Tiếp theo những nghiên cứu trong việc ương nuôi cá lóc giống, vào năm 2002, Đặng Thụy Mai Thy tiến hành thử nghiệm ương cá lóc đen và cá lóc môi trề bằng thức ăn có hàm lượng đạm khác nhau. Hai loại thức ăn được dùng để ương cá trong thí nghiệm là thức ăn tổng hợp có hàm lượng đạm là 25% và 30%. Sau 30 ngày ương, ta thấy hàm lượng đạm trong thức ăn có ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ tăng trưởng của cá lóc, thể hiện qua kết quả: cá ăn thức ăn có hàm lượng đạm 30% tăng trưởng nhanh hơn cá ăn thức ăn có hàm lượng đạm 25%. Trung Những nghiên cứu nói trên có vai trò không nhỏ trong việc duy trì và phát triển nguồn cá lóc giống nói riêng và nghề nuôi thủy sản nói chung. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu về cá lóc được biết đến đều là những nghiên cứu trên lĩnh vực sản xuất giống. Vì thế trước tình hình nuôi cá lóc ngày càng phổ biến ở các tỉnh ĐBSCL hiện nay, việc nghiên cứu cấu trúc vi thể của các cơ tâmquan Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu bình thường trên cá lóc khỏe sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu những biến đổi bệnh lý trong các cơ quan khi cá bệnh cũng như tìm ra các biện pháp phòng trị bệnh cá càng hoàn thiện hơn. 10 Chương III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian Từ tháng 2/2008 đến tháng 5/2008 3.2 Địa điểm Thu mẫu: mẫu được thu tại Cần Thơ Phân tích mẫu: mẫu được phân tích tại phòng thí nghiệm Khoa Thuỷ Sản trường Đại học Cần Thơ 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu Dụng cụ Dụng cụ giải phẩu, khay nhựa, thớt, dao, khuôn đúc, casset có nắp, casset không nắp, khay nhuộm, bút chì, sổ ghi chép,... và các dụng cụ cần thiết để làm tiêu bản mẫu mô. Hóa chất hóa liệu chất cốĐH địnhCần mẫu, hóa chất@ xử Tài lý mẫu, nhuộm acid cứu Trung tâmCác Học Thơ liệu họcmẫu tậpnhư: vàformol, nghiên acetic, Na2SO4, NaHSO4, cồn tuyệt đối, xylen, paraffin,... 3.3.2 Phương pháp Phương pháp thu và lấy mẫu Thu mẫu: cá lóc được mua từ chợ Tân An, quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ. Khi mua, cá được chọn có trọng lượng từ 100g-200g, hoạt động bơi lội nhanh nhẹn và linh hoạt. Cơ thể cá cân đối, da sáng bóng và trơn láng, màu sắc bình thường, các vi không bị tưa rách, trên thân không có các dấu hiệu khác thường như: vết loét, xuất huyết hay mất màu. Mang cá đỏ tươi, đồng nhất không bị rách hay tưa. Mắt cá sáng và linh hoạt… Quan sát bên trong xoang cơ thể cá sau khi giải phẩu không thấy có chất dịch hay dấu hiệu xuất huyết. Các cơ quan nội tạng có màu sắc bình thường và đồng nhất trên từng cơ quan, không có đốm trắng hay dấu hiệu bất thường khác… Lấy mẫu: các cơ quan được lấy bao gồm da, cơ, mang, tim, gan, thận, tỳ tạng, dạ dày và ruột (Hình 3). 11 Cách lấy mẫu Da-cơ: dùng dao bén cắt một phần gồm da, cơ và vẩy dài khoảng 2cm, dày khoảng 1cm. Mang: dùng kéo cắt hai đầu cung mang để lấy được nguyên phần mang. Tim, gan, thận, tỳ tạng: lấy nguyên cơ quan. Ống tiêu hoá: dùng dao bén cắt nguyên phần dạ dày và phần ruột cho vào dung dịch cố định. d e a g c f b tập và nghiên cứu Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học Hình 3. Các cơ quan của cá lóc khỏe a. Dạ dày; b. Ruột; c. Gan; d. Mang; e. Tim; f. Tỳ tạng; g. Thận Cố định mẫu Việc cố định mẫu phải được tiến hành ngay sau khi các cơ quan được tách khỏi cơ thể. Dung dịch dùng cố định mẫu là dung dịch formol trung tính 10% (đối với mẫu da-cơ) và dung dịch Bouin’s (đối với các cơ quan còn lại). Thời gian cố định mẫu cho cả hai dung dịch trên là từ 18h-24h. Thể tích của dung dịch cố định thường gấp nhiều lần kích thước mẫu mô. Rửa mẫu Mẫu được rửa dưới vòi nước trong khoảng 2 giờ sau khi cố định bằng formol trung tính 10%. Đối với mẫu được cố định bằng Bouin’s, mẫu được rửa đến khi dung dịch nhạt màu. Sau đó, tiếp tục chuyển mẫu sang cồn 60% trong 12 khoảng 12h-24h để loại nước dần và cuối cùng cho mẫu qua lọ chứa cồn 70% để loại nước và bảo quản trong thời gian chờ xử lý. Phương pháp làm tiêu bản mô Cắt tỉa định hướng Mẫu mô đã cố định cần được cắt tỉa trước khi xử lý mẫu. Kích cỡ các mẫu sau khi cắt tỉa từ 0,5-1mm, dày từ 0,3-0,5 mm và phải có tính đại diện cho mẫu (Ví dụ: da-cơ được cắt thành một mẫu cắt dọc và một mẫu cắt ngang, dạ dày thì lấy một đoạn ở giữa và một đoạn ở gần đáy dạ dày, mẫu thận được cắt gồm một đoạn thận trước, đoạn cắt dọc và cắt ngang của thận sau,…). Mẫu mô đã cắt tỉa được cho vào các casset để chuẩn bị xử lý mẫu. Xử lý mẫu Sau khi cắt tỉa định hướng, mẫu được xử lý trong máy Sproceeding tissue (MICROM, STP 120-2) theo các bước sau: Khử nước Trung Mục đích của khử nước là loại nước hoàn toàn trong mô mà không làm mô và tế bào bị teo hoặc vị trí của các thành phần cấu tạo trong mô bị thay đổi. Vì thế, mẫu sẽ được chuyển qua các lọ cồn có nồng độ tăng dần từ 80%, 90%, tâm95% Học liệu để ĐH Thơ @không Tàixảy liệu học tập và nghiên cứu và 100% quáCần trình khử nước ra quá nhanh. Làm trong mẫu Vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin nên sau khi khử nước thì cồn cũng được loại ra khỏi mẫu. Nếu không loại bỏ hết cồn, phần mô đó sẽ bị co rút lại, khối mẫu đúc trong paraffin sẽ không đồng nhất, tạo nên những lổ hỗng trên lát cắt. Do đó, mẫu mô sẽ được ngấm một dung môi trung gian (xylen) có thể hòa tan được cồn và paraffin. Để đạt được mục đích này, mẫu được ngâm qua 3 lọ xylen, mỗi lọ được ngâm khoảng 2 giờ. Ngấm paraffin Paraffin là chất nền để bảo đảm cho tế bào giữ nguyên được hình dạng khi cắt. Vì thế sau khi làm trong, mẫu mô sẽ được ngấm paraffin nóng chảy (57-600C) bằng cách chuyển mẫu qua nhiều lọ paraffin, mỗi lọ ngâm khoảng 2 giờ. 13 Qui trình xử lý mô được cài đặt trong máy xử lý mô tự động theo các bước sau (Coolidge & Howard, 1997, có điều chỉnh): Cồn 80% 1 giờ Cồn 90% 1 giờ Cồn 95% 1 giờ Cồn 100% 1 giờ Xylen 2 giờ Xylen 2 giờ Cồn 100% 1 giờ Cồn 100% 1 giờ Xylen 2 giờ Paraffin+Xylen 2 giờ Paraffin+sáp ong 2 giờ Paraffin+sáp ong 2 giờ Cho các casset vào sọt chứa mẫu đặt lên vị trí lọ 1 của máy xử lý mô tự động và tiến hành qui trình xử lý. Đúc khối Trung Sau khi hoàn thành quá trình xử lý, mẫu được lấy ra khỏi máy xử lý và tiến hành đúc khối bằng máy MICROM EC350-1. Mẫu mô được định hướng đặt vào giữa khuôn inox, cho một ít paraffin nóng chảy ở 60 0C vào. Để đảm bảo tâmmẫu Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu được giữ đúng vị trí, cho khuôn đúc qua máy làm lạnh nhanh (MICROM, EC350-2) để cố định vị trí của mẫu trong khuôn. Tiếp tục cho paraffin đầy khuôn và đặt casset có ký hiệu mẫu lên trên. Sau đó đặt khuôn mẫu qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại và tách khối paraffin ra khỏi khuôn. Cắt mẫu Sử dụng máy microtome (Yamato PR-50) để cắt mẫu, lát cắt có độ dày là 2µm. Mẫu được cắt thành băng dài và cho vào chậu nước nóng 45-500C để paraffin căng ra, dùng kim mũi giáo nhẹ nhàng tách riêng từng đoạn mẫu đạt yêu cầu. Dán mẫu lên lame Dùng lame sạch cho vào chậu nước gần lát cắt đạt yêu cầu và nâng từ từ lên, dùng kim mũi giáo chỉnh mẫu ngay ngắn trên lame. Mẫu dán xong sẽ được sấy khô bằng bàn sấy ở nhiệt độ 45-60 0C để lát cắt dính vào lame. 14 Nhuộm mẫu Mẫu được nhuộm bằng Haematoxyline & Eosin (H&E) theo qui trình của Harris (1900) (có điều chỉnh) như sau: Xylen 10 phút Xylen 10 phút Xylen 10 phút Cồn100% 1 phút Cồn 65% 1 phút Cồn 90% 1 phút Cồn 95% 1 phút Nước máy 1 phút Hematoxylin 10 phút Nước máy 1 phút Nước máy 1 phút Eosin 3 phút Cồn 65% 1 phút Cồn 90% 1 phút 2% Potassium acetate 5phút Cồn 95% 1 phút Cồn 100% 1 phút Cồn100% 1 phút Cồn 100% 1 phút 1%acidalcohol Nhúng 3 lần Nước máy 1 phút Cồn100% 1 phút Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Xylen 5 phút Xylen 5 phút Xylen 5 phút Cồn100% 1 phút Dán lamella vào lame Sử dụng keo Enterlant để dán tiêu bản. Nhỏ một giọt keo lên lame, dán lamella lên trên ngay vùng có miếng mô, thao tác phải cẩn thận tránh để bọt khí vào trong tiêu bản. Quan sát tiêu bản và đọc kết quả Sử dụng kính hiển vi quang học (Carl Zeiss) để quan sát. Đầu tiên, mẫu được quan sát ở độ phóng đại 5X để nhìn tổng quan tiêu bản. Sau đó chuyển qua độ phóng đại lớn hơn và chụp hình các tiêu bản đặc trưng bằng máy chụp ảnh Canon PC-1145. 15 Chương IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN Sau khi tiến hành làm tiêu bản mô học, kết quả phân tích cấu trúc vi thể của các cơ quan trên cá lóc như sau: 4. 1 Da Da cá là một hệ thống bao phủ toàn bộ bề mặt cơ thể cá. Mặt cắt ngang của phần da ở mặt bên cơ thể cá lóc cho thấy da của nó được tạo thành từ 3 lớp: lớp biểu bì, lớp bì và hạ bì (Hình 4.1). Trung Lớp bì là lớp ngoài cùng của da cá lóc, được tạo thành từ các tế bào biểu mô hình vẩy xen kẽ với tế bào tiết chất nhày. Các tế bào tiết chất nhày có mặt ở khắp bề mặt của da, thường có dạng cốc và có dụng tiết ra chất nhày phủ lên lớp biểu mô (Hình 4.2). Theo Harris ctv. (1973), kết quả phân tích thành phần sinh hóa của nhớt cá cho thấy chúng có cấu tạo từ protein và carbohydrate (trích dẫn bởi Chinabut ctv., 1991). Tác dụng của nhớt cá giống như là rào cản đầu tiên giữa cá với môi trường, bảo vệ biểu bì, làm giảm tính nguy hiểm của các vết thương, ngăn chặn nước xuyên qua bằng sự thẩm thấu và giảm bớt ma sát của cá khi chúng di chuyển (theo Harder, 1975 trích dẫn bởi Groman, khiCần nghiênThơ cứu trên da của mộthọc số loài cá và xương, Hibiya cứu tâm1982). HọcNgoài liệu ra, ĐH @ Tài liệu tập nghiên (1982) đã quan sát được các khoảng trống lympho nằm ở giữa gốc của các tế bào biểu mô, những khoảng trống này thường có dạng tròn hoặc oval chứa từ 1 đến 2 lympho bào. Tuy nhiên cấu trúc của lớp biểu bì quan sát được trên da cá lóc không thể hiện rõ sự có mặt của các tế bào này. Lớp kế tiếp của da và nằm dưới biểu bì là lớp bì. Ở cá lóc, lớp bì cũng được chia ra làm hai lớp phụ đó là lớp đặc và lớp xốp (Hình 4.3). Lớp đặc nằm sâu bên trong và rộng hơn lớp xốp, có chứa các sợi collagen thô sắp xếp song song với bề mặt da. Theo Chinabut ctv. (1991), trong lớp đặc còn chứa các nhánh thần kinh và nhiều mao mạch máu, tuy nhiên đặc điểm này không thể hiện rõ trong các mẫu da cá lóc quan sát được. Lớp xốp là lớp tương đối mỏng, gồm một mạng lưới thưa của các sợi collagen và một lớp tế bào sắc tố. Khi quan sát mẫu da cá lóc trong thí nghiệm này, các sợi dây thần kinh, các mao mạch máu cũng như khoang chứa vẩy nằm ở lớp xốp không được thể hiện rõ ràng. Điều này có thể là do hạn chế trong các thao tác cắt tỉa định hướng hoặc do quá trình xử lý mẫu. Bên dưới lớp bì là phần hạ bì. Nó là phần mỏng nhất của da cá, nằm giữa lớp đặc và các bó cơ, gồm một mạng lưới của mô liên kết thưa và có chứa nhiều tế bào tế bào sắc tố. Ngoài ra, khi tiến hành nghiên cứu trên da cá trê trắng, 16 Chinabut ctv. (1991) đã mô tả sự có mặt của các tế bào lipid trong lớp hạ bì của da cá, nhưng các mẫu phân tích trong thí nghiệm này chỉ thấy được phần mô liên kết và các tế bào sắc tố, không thấy rõ sự hiện diện của các tế bào lipid (Hình 4.4). a b c Hình 4.1 Cấu cá lóc (H&E, Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơtrúc @daTài liệu học40X) tập và nghiên cứu a. Lớp biểu bì; b. Lớp bì; c. Lớp hạ bì c a b Hình 4.2 Cấu trúc lớp biểu bì (H&E, 40X) a. Tế bào biểu mô vẩy; b. Tế bào tiết chất nhày; c. Tế bào sắc tố 17 c d b a e Hình 4.3 Cấu trúc lớp bì của da cá lóc (H&E, 40X) a. Lớp đặc; b. Lớp xốp; c. Lớp tế bào sắc tố; d. Sợi collagen; e. Tế bào sắc tố của lớp hạ bì Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu a c b Hình 4.4 Cấu trúc hạ bì của da cá lóc (H&E, 100X) a. Mô liên kết; b. Lớp đặc; c. Bó cơ 18