Tài liệu Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC THANH THẢO Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN NGUYỄN NGỌC THANH THẢO BSTY. HOÀNG THANH HẢI BSTY. LÊ HỒNG PHONG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM ƠN  Với tất cả lòng kính trọng và yêu thƣơng, con xin cảm ơn Ba Mẹ, Ngƣời đã cho con có ngày hôm nay.  Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, quý thầy cô các Khoa, Bộ môn đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt 4 năm học qua.  Xin chân thành cảm ơn ThS. Trần Thị Bích Liên đã tận tình dạy bảo, động viên, giúp đỡ em trong thời gian học tập cũng nhƣ trong việc thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  Em xin chân thành cảm ơn BSTY Hoàng Thanh Hải, ngƣời đã luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận.  Xin chân thành cảm ơn BSTY Lê Hồng Phong đã hỗ trợ, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận.  Xin chân thành cảm ơn cô Lê Thị Hà đã tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt khóa luận.  Xin cảm ơn các bạn, những ngƣời đã chia sẽ mọi buồn vui với Thảo trong suốt 4 năm qua.  Em cảm ơn Anh…! Tp Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 9 năm 2007 Nguyễn Ngọc Thanh Thảo iii TÓM TẮT Đề tài: “CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ”, đƣợc thực hiện tại Bộ môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007. Nội dung: Thực hiện 2 quy trình trypsin để tách tế bào từ phôi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi và xác định tuổi phôi, quy trình tách tế bào thích hợp nhất. Nuôi cấy, cấy chuyển và theo dõi sự phát triển của tế bào sơ cấp, tế bào thứ cấp. Thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà trong Nitơ lỏng. Hồi phục và khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản. Các kết quả thu đƣợc: Số lƣợng tế bào tách đƣợc từ phôi 9 và 10 ngày tuổi tƣơng đƣơng nhau và cao hơn số tế bào tách đƣợc từ phôi 8 ngày tuổi. Số tế bào tách đƣợc bằng quy trình trypsin lạnh (49,73 x 106) cao hơn số tế bào tách đƣợc bằng quy trình trypsin ấm (25,51 x 106). Độ tuổi phôi và quy trình tách tế bào không ảnh hƣởng đến sự phát triển của tế bào in vitro. Tế bào xơ phôi gà thứ cấp có khả năng phát triển trong điều kiện in vitro cao hơn tế bào sơ cấp. Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi bảo quản trong Nitơ lỏng 5 ngày có khả năng bám và phát triển trên bề mặt bình nuôi cấy. iv SUMMARY Graduating thesis topic: “IMPROVE THE PROCEDURE OF HARVESTING AND FREEZING CEF CELLS”. The thesis was carried out at Microbiology and Infectious Diseases Dept. of Faculty of Animal Science and Veterinary, Nong Lam university Ho Chi Minh city from 4/2007 to 8/2007. Contents of research: Trying 2 trypsin process for the culture of primary cells from embryonated eggs at 8th, 9th, 10th day then define a trypsin process and an age of embryo for primary culture. Culture, subculture and observe the growth of the primary cells, the secondary cells. Harvesting and freezing CEF cells in liquid nitrogen. Reviving and surveying the survival of cells after cryoprotected. Result: The number of CEF cells were removed from 9th day embryo tantamount to those from 10th day embryo and more than those from 8th day embryo . The number of CEF cells were removed by cool trypsin process (49,73x106) more than those by warm trypsin process (25,51 x 106). The age of embryo and the trypsin process don’t affect the growth of in vitro cells. The secondary CEF cells can grow better than the primary CEF cells in in vitro. 5th day after cryoprotection, the secondary CEF cells can attach to the substrate and grow. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa 1 ........................................................................................................... i Trang bìa 2 .......................................................................................................... ii Lời cảm ơn .........................................................................................................iii Tóm tắt tiếng Việt .............................................................................................. iv Tóm tắt tiếng Anh ............................................................................................... v Mục lục ............................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................. ix Danh sách các hình.............................................................................................. x Danh sách các bảng ............................................................................................ xi Danh sách các biểu đồ ........................................................................................ xi Danh sách các sơ đồ ........................................................................................... xi 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................... 1 1.2. Mục đích ................................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 2.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật ....... 3 2.2. Đặc điểm tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào ...... 5 2.2.1. Sự điều hòa trao đổi chất................................................................ 6 2.2.2. Tính chất cơ học yếu ...................................................................... 7 2.2.3. Khả năng phân chia và tốc độ tăng trƣởng rất chậm ..................... 7 2.2.4. Cần giá đỡ trong quá trình phát triển và nhân đôi ......................... 8 2.2.5. Chịu ảnh hƣởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng ............................................................................................. 8 2.2.6. Khả năng tiếp nhận gene lạ ............................................................ 8 2.2.7. Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo ................................. 8 2.3. Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật ................................................... 9 vi 2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp .............................................................................. 9 2.3.2. Sự cấy chuyển ................................................................................ 9 2.3.3. Hệ thống nuôi cấy tế bào.............................................................. 10 2.3.3.1. Nuôi cấy lớp đơn ................................................................. 10 2.3.3.2. Nuôi cấy huyền phù ............................................................ 10 2.3.4. Các loại tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật ............................ 11 2.3.5. Những đặc điểm chức năng của tế bào nuôi cấy.......................... 12 2.3.6. Điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật ....................... 13 2.3.7. Vấn đề cần lƣu ý khi nuôi cấy tế bào động vật ............................ 19 2.3.8. Các pha của sự nuôi cấy tế bào động vật ..................................... 19 2.3.8.1. Pha ức chế ........................................................................... 19 2.3.8.2. Pha phát triển....................................................................... 19 2.3.8.3. Pha ổn định .......................................................................... 20 2.3.8.4. Pha suy giảm ....................................................................... 20 2.4. Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy ............................................................... 20 2.4.1. Những ƣu điểm của việc đông lạnh tế bào nuôi cấy .................... 20 2.4.2. Tiến trình bảo quản lạnh tế bào .................................................... 21 2.4.3. Một số vấn đề có thể ảnh hƣởng đến kết quả bảo quản ............... 22 2.5. Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật ................................................ 22 2.5.1. Thiết lập hệ thống mô hình .......................................................... 23 2.5.2. Xét nghiệm độc tế bào ................................................................. 23 2.5.3. Nghiên cứu ung thƣ ...................................................................... 23 2.5.4. Virus học ...................................................................................... 23 2.5.5. Sản xuất các chất thứ cấp từ tế bào .............................................. 23 2.5.6. Chẩn đoán di truyền ..................................................................... 24 2.5.7. Kỹ thuật di truyền ........................................................................ 24 2.5.8. Liệu pháp gene ............................................................................. 25 2.5.9. Phát triển và chọn lọc thuốc ......................................................... 25 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 26 vii 3.1. Thời gian và địa điểm ............................................................................ 26 3.1.1. Thời gian ...................................................................................... 26 3.1.2. Địa điểm ....................................................................................... 26 3.2. Vật liệu và hóa chất ............................................................................... 26 3.2.1. Đối tƣợng ..................................................................................... 26 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .................................................... 26 3.2.3. Các hóa chất và môi trƣờng ......................................................... 27 3.3. Nội dung nghiên cứu.............................................................................. 27 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 28 3.4.1. Kỹ thuật lấy phôi và tách mô ở phôi gà ....................................... 28 3.4.2. Phƣơng pháp tạo tế bào sơ cấp..................................................... 28 3.4.3. Phƣơng pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer ................. 29 3.4.4. Phƣơng pháp cấy chuyền tế bào................................................... 30 3.4.5. Phƣơng pháp bảo quản tế bào ...................................................... 31 3.4.6. Phƣơng pháp hồi phục tế bào ....................................................... 31 3.5. Chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................... 31 3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................... 31 3.7. Quy trình tiến hành thí nghiệm .............................................................. 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 33 4.1. Xác định tuổi phôi và phƣơng pháp tách tế bào thích hợp ................... 33 4.2.Thời gian tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp ..................................... 35 4.3. Cấy chuyển, thu hoạch, bảo quản tế bào và khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản.......................................................................... 37 4.3.1. Thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp ................... 37 4.3.2.Xác định khả năng sống của tế bào sau bảo quản ......................... 39 4.4. Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà trong điều kiện Việt Nam .......... 41 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 43 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 44 7. PHỤ LỤC ...................................................................................................... 46 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CEF: Chicken Embryo Fibroblast. DMSO: dimethyl sulfoxide. EMEM: Eagle’s minimum essential medium. FBS: Fetal bovine serum. HEPES: N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulphonic acid. MEM: Minimum essential medium. PBSA: Phosphate bufferd saline solution A. ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Mô hình một tế bào động vật điển hình .............................................. 5 Hình 2.2: Các dụng cụ nuôi cấy tế bào lớp đơn ................................................ 10 Hình 2.3: Các dụng cụ nuôi cấy huyền phù tế bào ........................................... 11 Hình 2.4: Ống bảo quản tế bào.......................................................................... 21 Hình 2.5: Bình Nitơ lỏng bảo quản tế bào ........................................................ 22 Hình 3.1: Buồng đếm Neubauer........................................................................ 29 Hình 3.2: Tế bào CEF trong buồng đếm ........................................................... 30 Hình 4.1: Tế bào sơ cấp sau 15 giờ nuôi cấy .................................................... 36 Hình 4.2: Tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp ................................................ 36 Hình 4.3: Tế bào thứ cấp phát triển đầy một lớp .............................................. 38 Hình 4.4: Tế bào xơ phôi gà sơ cấp sau khi hồi phục ....................................... 40 Hình 4.5: Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi hồi phục ..................................... 40 x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1: Số tế bào sống trung bình thu đƣợc từ các tuổi phôi và các phƣơng pháp tách tế bào ................................................................... 34 Bảng 4.2: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào sơ cấp (giờ) .................................................................................................. 35 Bảng 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp (giờ) .................................................................................................. 37 Bảng 4.4: Tỷ lệ tế bào sống sau khi phục hồi ................................................... 37 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1: Số lƣợng tế bào thu đƣợc từ các độ tuổi phôi và các phƣơng pháp tách tế bào ............................................................. 33 Biểu đồ 4.2: Thời gian trung bình làm đầy một lớp của tế bào sơ cấp ............. 35 Biểu đồ 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp ......................................................................................... 38 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3: Quy trình thực hiện thí nghiệm ........................................................... 32 Sơ đồ 4: Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà .................................................. 42 xi 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Động vật cũng nhƣ nhiều loại sinh vật đa bào khác đƣợc cấu tạo từ các loại mô khác nhau. Các mô đƣợc cấu tạo từ những tế bào cùng loại. Nhƣ vậy, tế bào là đơn vị cấu trúc nhỏ nhất của một cơ thể, là đơn vị chức năng cơ bản của sự sống. Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan đã mở ra khả năng nuôi cấy tế bào ở thực vật và động vật. Từ đó, nhiều nhà khoa học đã có những nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc với mục đích cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu sinh học, y học nhƣ: nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa, con đƣờng trao đổi chất, kiểm tra ảnh hƣởng của các chất lên từng tế bào riêng biệt, nghiên cứu sản xuất mô nhân tạo, tổng hợp các chất sinh học nhƣ vaccine, hormone… Trên thế giới, công nghệ nuôi cấy tế bào động vật đã trải qua một giai đoạn rất dài tìm hƣớng đi về kỹ thuật, tìm môi trƣờng tƣơng ứng và đang bƣớc vào giai đoạn sản xuất theo quy mô công nghiệp ở giai đoạn vừa và nhỏ. Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật vẫn chƣa phát triển, đa số tế bào nuôi cấy đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài. Tế bào phôi gà là loại tế bào có khả năng phát triển và sinh sản rất cao, dễ dàng bám vào bề mặt bình nuôi cấy và môi trƣờng nuôi không cần nồng độ huyết thanh cao nhƣ các dòng tế bào khác (ví dụ các tế bào tách từ phôi chuột, các dòng tế bào ung thƣ…) (Phan Kim Ngọc, 2002). Do đó, việc sản xuất tế bào xơ phôi gà trong điều kiện ở Việt Nam là hoàn toàn có khả năng thực hiện đƣợc nhằm phục vụ cho chẩn đoán, sản xuất vaccine gia cầm trong tình hình hiện nay, cũng nhƣ làm nền tảng cho những nghiên cứu sau này. 2 Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, đƣợc sự phân công của bộ môn Vi sinhTruyền nhiễm, khoa Chăn nuôi - Thú y, dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Trần Thị Bích Liên, BSTY Hoàng Thanh Hải, BSTY Lê Hồng Phong, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà”. 1.2. Mục đích Xây dựng quy trình nuôi cấy tế bào xơ phôi gà phù hợp với điều kiện tại Việt Nam, từ đó mở rộng khả năng ứng dụng tế bào xơ phôi gà trong nghiên cứu, chẩn đoán bệnh, sản xuất vaccine cho gia cầm. 1.3. Yêu cầu - Tiến hành tách tế bào từ phôi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi bằng cách sử dụng hai quy trình trypsin ấm và trypsin lạnh. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần. - Khảo sát số lƣợng tế bào thu đƣợc, thời gian tạo một lớp tế bào và khả năng sống của tế bào sau thời gian bảo quản tronng Nitơ lỏng. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan (1838) là nền tảng cho nhiều nhà khoa học về thực vật và động vật bắt đầu nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc (tế bào mầm). Mặt khác, thực tế cuộc sống đòi hỏi vấn đề nuôi tế bào động vật ngày càng trở nên cấp bách. Trƣớc đây, ngƣời ta nuôi cấy virus trong cơ thể một sinh vật chủ. Từ đó, ngƣời ta thu nhận virus và dùng nó để sản xuất vaccine. Việc sản xuất vaccine theo phƣơng pháp này đã có những kết quả rất tốt và đóng vai trò rất quan trọng trong phòng và chữa bệnh hàng chục năm qua. Hiện nay, ngƣời ta vẫn áp dụng có hiệu quả phƣơng pháp này để sản xuất vaccine cho ngƣời và gia súc. Tuy nhiên, việc sản xuất vaccine theo phƣơng pháp này vẫn có những hạn chế cần khắc phục. Trong đó, khó khăn nhất là phải sử dụng một số lƣợng lớn động vật cho quá trình nuôi virus. Điều đó không chỉ khó khăn về mặt kỹ thuật mà còn khó khăn về tài chính. Việc nuôi cấy tế bào động vật đặt ra cho các nhà khoa học những thách thức không nhỏ. Bởi lẽ, nuôi cấy tế bào động vật khó hơn nhiều so với nuôi cấy vi sinh vật và nuôi cấy tế bào thực vật. Kiến thức tổng quát cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đƣợc đƣa ra từ thế kỷ 19. Năm 1855, Roux chứng minh đƣợc khả năng giữ toàn vẹn đặc tính sinh học của tế bào phôi gà trong dung dịch nƣớc muối sinh lý. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong nhận thức về sự sống của tế bào ngoài cơ thể, nó mở ra khả năng phát triển sự sống bên ngoài cơ thể đa bào. 4 Đến năm 1907, Ross Harrison đã tách thành công tế bào thần kinh ếch để làm thí nghiệm thử nuôi chúng ngoài cơ thể. Nhƣng cho đến đầu những năm 1950, chỉ có vài công trình nhằm tăng cƣờng khả năng nuôi cấy tế bào đƣợc nghiên cứu. Đầu tiên là sự phát triển của thuốc kháng sinh để tránh các tác nhân gây nhiễm trong giai đoạn đầu nuôi cấy tế bào. Thứ hai là sự phát triển các kỹ thuật, nhƣ dùng trypsin để tách tế bào từ bình nuôi cấy. Kỹ thuật này rất quan trọng khi cần thu hoạch các dòng tế bào đang phát triển liên tục. Thứ ba là thông qua việc nuôi cấy tế bào với các loại môi trƣờng khác nhau để tìm ra thành phần môi trƣờng thích hợp nhất cho dòng tế bào đó. Một đột phá có tính chất làm nền tảng cho công nghệ nuôi cấy tế bào động vật thuộc về những nghiên cứu của Carrel (1913). Ông đã làm rất nhiều thí nghiệm và cuối cùng ông đã đƣa ra một kết luận có tính chất mở đƣờng cho những thí nghiệm tiếp theo của rất nhiều tác giả đƣơng thời: tế bào động vật hoàn toàn có thể sống trong một khoảng thời gian dài trong điều kiện in vitro nếu ta thƣờng xuyên cung cấp các chất dinh dƣỡng vô trùng cần thiết. Đến năm 1948, bằng những kỹ thuật mới, Earle đã tiến hành phân lập các tế bào và nuôi chúng trong những điều kiện môi trƣờng đặc biệt, tác giả đã thu nhận đƣợc những dòng tế bào biệt lập. Kỹ thuật này mở ra khả năng tách tế bào của từng loại mô và phát triển chúng trong những môi trƣờng nhân tạo. Năm 1952, Gey đã tách tế bào ung thƣ ở ngƣời và nuôi chúng thành công. Sau đó hai năm (1954), Levi – Moutalcini đã đi xa hơn trong nghiên cứu bằng cách tìm hiểu ảnh hƣởng của những chất điều hòa sinh trƣởng lên sự phát triển của tế bào trong nuôi cấy in vitro. Ông dùng yếu tố tăng trƣởng thần kinh (NGE – Nerve Growth Factor) để kích thích sự tăng trƣởng của tế bào thần kinh khi nuôi chúng in vitro. Những nghiên cứu sau này của Eagle (1955), Puck (1956), Temin và Rubin (1958), Hayflick (1961), Littlefield (1964), Ham (1965), Kohler (1975), Sato (1976), Wigler (1977) rất thành công trong những lĩnh vực cơ bản sau: 5 - Tìm ra đƣợc nhiều loại môi trƣờng thích hợp cho sự phát triển in vitro của nhiều loại mô khác nhau của ngƣời và động vật. - Hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô động vật. - Tạo ra đƣợc một số đột biến có ích. Những nghiên cứu liên tục từ năm 1950 đến nay đã có ý nghĩa thực tế rất lớn trong kỹ thuật sản xuất vaccine cho ngƣời và gia súc. Nhƣ vậy, công nghệ nuôi cấy tế bào động vật đã trải qua một giai đoạn rất dài tìm hƣớng đi về kỹ thuật, tìm môi trƣờng tƣơng ứng và đang bƣớc vào giai đoạn sản xuất theo quy mô công nghiệp ở dạng vừa và nhỏ. Tƣơng lai, hƣớng nghiên cứu này sẽ đem lại những thành tựu khoa học cũng nhƣ lợi ích kinh tế rất lớn. Trƣớc mắt, kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật sẽ phục vụ cho hai ngành: ngành y và ngành chăn nuôi. Hai ngành này đang cần những kỹ thuật hiện đại để phát triển. 2.2. Đặc điểm của tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào Hình 2.1. Mô hình một tế bào động vật điển hình Các bào quan gồm: (1)hạch nhân, (2) nhân, (3) ribosome, 4) túi tiết,(5) mạng lƣới nội chất (ER) hạt, (6) bộ máy Golgi, (7) khung xƣơng tế bào, (8) ER trơn, (9) ty thể, (10) không bào, (11) tế bào chất, (12) lysosome, (13) trung thể. (Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%BF_b%C3%A0o) 2.2.1. Sự điều hòa trao đổi chất Quá trình trao đổi chất của cơ thể đƣợc tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào. Sự chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại của cơ thể sống. 6 Ở vi sinh vật, quá trình trao đổi chất là quá trình xảy ra giữa tế bào và môi trƣờng sống. Do đó, ngoài các yếu tố ảnh hƣởng từ bên ngoài (nhiệt độ, pH, nồng độ các chất dinh dƣỡng, các chất độc…), tế bào còn phụ thuộc rất nhiều vào các hoạt động của enzyme. Ở tế bào thực vật, ngoài tác động của enzyme, quá trình trao đổi chất còn chịu tác động rất mạnh bởi hệ dịch bao quanh tế bào. Ở tế bào động vật, ngoài tác động của enzyme, hệ dịch quanh tế bào nhƣ ở thực vật, chúng còn bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình trao đổi chất ở tế bào. Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh. Do đó, việc điều khiển trao đổi chất của tế bào động vật trong cơ thể sống trở nên hết sức phức tạp. Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dƣỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác quá trình dinh dƣỡng tế bào trong cơ thể. Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập, không tuân theo quy luật của mô và của cơ thể đa bào. Việc nuôi cấy tế bào động vật đƣợc thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt động của enzyme, đây cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những sản phẩm trao đổi chất của tế bào, cũng nhƣ khả năng phân chia tế bào. Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hƣởng quyết định đến kết quả: - Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào. - Những yếu tố môi trƣờng quyết định đặc trƣng riêng biệt của tế bào. Sự hiểu biết nguồn gốc của tế bào giúp ta định hƣớng sản phẩm cuối, còn sự hiểu biết về đặc trƣng riêng biệt giúp ta điều chỉnh (hay điều khiển) để tính trạng đó đƣợc biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy. Trong nuôi cấy tế bào in vitro có những yếu tố hoàn toàn khác với sự phát triển của chính tế bào đó trong cơ thể. Mọi yếu tố tác động lên tế bào nuôi cấy in 7 vitro là những tác động trực tiếp. Còn khi phát triển trong cơ thể, các tế bào này không chỉ chịu tác động trực tiếp mà còn chịu những tác động gián tiếp. Do đó, mọi tác động của môi trƣờng đến tế bào nuôi in vitro xảy ra rất nhanh và mãnh liệt, cần tạo ra sự hài hòa trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào đƣợc nuôi cấy. 2.2.2. Tính chất cơ học yếu Ở tế bào vi sinh vật, tế bào đƣợc bao bọc bởi thành tế bào – đƣợc cấu tạo từ những hợp chất hữu cơ khá bền, khó bị phân hủy khi tế bào còn đang phát triển. Ở tế bào thực vật, thành tế bào còn đƣợc cấu tạo bởi hợp chất lignocellulose hay pectinocellulose, các hợp chất này tạo ra tính chất cơ học, hóa học, vật lý khó bị phân hủy hơn rất nhiều so với cấu trúc thành tế bào của vi sinh vật. Tế bào động vật hoàn toàn không có thành tế bào, mà chúng chỉ đƣợc bao bọc bởi một màng tế bào – thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với các tế bào khác trong mô. Mặt khác, kích thƣớc tế bào động vật thƣờng rất lớn, trung bình khoảng 10 μm, lại không có vách nên tế bào động vật có tính chất cơ học yếu. Do đó, khi nuôi cấy cần nhẹ nhàng, tránh sự phá vỡ tế bào, trong trƣờng hợp việc nuôi cấy tế bào cần khuấy hay quay thì tốc độ không đƣợc quá 100rpm (vòng/phút) (Phan Kim Ngọc, 2002). 2.2.3. Khả năng phân chia và tốc độ tăng trƣởng rất chậm Do đặc điểm di truyền, các tế bào vi khuẩn thƣờng phân chia với tốc độ rất nhanh, khoảng 20-50 phút. Ở động vật và thực vật, một chu kỳ tế bào thƣờng kéo dài 20-70 giờ (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Nếu trong một điều kiện nào đó, một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng số lƣợng một cách bất thƣờng, cơ thể sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý. 2.2.4. Cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi. Tuy vậy, một số dòng tế bào nhƣ tế bào ung thƣ hoặc dòng tế bào kiên tục từ mô bình 8 thƣờng (sau khi đƣợc thuần hóa) có thể sinh trƣởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng, không cần bám vào giá đỡ (Phan Kim Ngọc, 2002). 2.2.5. Chịu ảnh hƣởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng Đây là cơ chế kiềm hãm ngƣợc bởi sản phẩm cuối (negative feed – back). Bất kỳ tế bào sinh vật nào cũng biểu hiện cơ chế này, điểm khác biệt của tế bào động vật là ở chỗ quá trình tổng hợp sản phẩm thừa ít xảy ra và thƣờng thì các sản phẩm trao đổi chất thoát ra khỏi tế bào rất chậm. 2.2.6. Khả năng tiếp nhận gene lạ Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật đƣợc xem nhƣ một loại tế bào trần tự nhiên. Chúng đƣợc bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do đó, trong trƣờng hợp chúng tồn tại ở trạng thái tự do, chúng có khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ (từ virus…) hoặc khi cho những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau ở gần nhau, sẽ xảy ra hiện tƣợng trao đổi vật chất di truyền tạo ra các tế bào lai. 2.2.7. Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo Khác với tế bào vi sinh vật và tế bào thực vật, tế bào động vật cần phải đƣợc bảo quản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới có thể giữ đƣợc những đặc tính riêng của nó. Bằng cách sử dụng Nitrogen lỏng (-1960C), tế bào động vật vẫn duy trì đƣợc đặc tính của chúng trong thời gian rất dài. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng nhiều ở các ngân hàng giống động vật trên thế giới. Khi sử dụng, tế bào động vật đƣợc tiến hành giải đông và đƣợc hoạt hóa để phục hồi khả năng tăng trƣởng và phân chia nhƣ trƣớc khi đem bảo quản. Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi trƣờng, rất nhạy cảm với kim loại. Trong quá trình phát triển trong môi trƣờng nhân tạo, chúng rất cần huyết thanh, hormone. 2.3. Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật 2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp Định nghĩa: nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào vừa đƣợc tách ra từ mô hay cơ quan (Phan Kim Ngọc, 2002). 9 Việc nuôi cấy đƣợc bắt đầu tiến hành khi các tế bào đƣợc tách ra từ mô bằng phƣơng pháp cơ học hay bằng phƣơng pháp xử lý enzyme, và có thể tăng trƣởng trong môi trƣờng thích hợp. Có nhiều loại enzyme để tách tế bào nhƣ collagenase, elastase, hyaluronidase, pronase… nhƣng trypsin đƣợc dùng nhiều nhất vì hiệu quả tách tế bào cao và giá thành rẻ. Trypsin (và pronase) có thể tách hoàn toàn tế bào từ mô bằng cách thủy phân các protein liên kết các tế bào với nhau (Phan Kim Ngọc, 2002). Dù tế bào đƣợc tách ra bằng bất kỳ phƣơng pháp nào thì đây vẫn là giai đoạn chọn lọc đầu tiên của quá trình nuôi cấy để cuối cùng có thể thu các dòng tế bào tƣơng đối đồng dạng. Trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp, sự chọn lọc dựa vào đặc tính của tế bào nhƣ dễ tách rời nhau, sống và bám vào cơ chất thành một lớp mỏng hoặc tồn tại đƣợc trong dịch huyền phù. Những tế bào đó là đối tƣợng cơ bản của quá trình nuôi cấy sơ cấp. Các tế bào nuôi cấy sơ cấp không đồng nhất với nhau do chúng là các thế hệ con của nhiều loại tế bào ban đầu khác nhau. Ở giai đoạn này, tế bào nuôi cấy có hình thái gần với mô cha mẹ nhất. 2.3.2. Sự cấy chuyển Khi những tế bào trong bình nuôi cấy sơ khởi phát triển và làm đầy bề mặt bình nuôi cấy, chúng cần đƣợc cấy chuyền để có bề mặt cho sự phát triển. Qua mỗi lần cấy chuyền, những tế bào có khả năng tăng sinh cao nhất sẽ dần dần chiếm ƣu thế và những tế bào không tăng sinh hoặc tăng sinh chậm sẽ chết dƣới tác động của trypsin và thao tác cấy chuyền. Mặc dù vẫn có sự chọn lọc và tiến triển về hình thái, nhƣng từ lần cấy chuyển thứ ba, tế bào trở nên ổn định hơn, có khả năng tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ. Tiến hành cấy chuyền bằng cách tách rời các tế bào từ bình nuôi cấy bằng enzyme (tƣơng tự enzyme đã dung khi tách tế bào để nuôi cấy sơ khởi), enzyme này phá hủy cấu trúc protein gắn kết tế bào với bề mặt cơ chất. Ngay sau khi tế bào đƣợc tách rời, enzyme đƣợc bất hoạt nhờ môi trƣờng nuôi cấy (có chứa huyết thanh), huyền phù tế bào đƣợc chia nhỏ ra và cho vào bình nuôi cấy mới.