Tài liệu Các phương pháp xác định tính và định lượng saponin bằng quang phổ uv vis

SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ Mục Lục PHẦN I : SAPONIN-TÍNH CHẤT VÀ PHÂN LOẠI4 I. SAPONIN-NGUỒN GỐC VÀ TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG4 1.Định nghĩa4 2.Sự phân bố trong thực vật4 3.Tính chất vật lí của Saponin4 4.Một số tính chất riêng biệt5 II. PHÂN LOẠI SAPONIN5 1. Saponin Triterpeeoid6 1.1 Saponin Triterpennoid pentacyclic 6 1.1.a Nhóm Olean6 1.1.b Nhóm Ursan 6 1.1.c Nhóm Lupan: 7 1.1.d Nhóm Hopan: 7 1.2 Saponin Triterpenoid Tetracyclic.8 1.2.a Nhóm Dammaran6 1.2.b Nhóm Lanostan 6 1.2.c Nhóm Cucurbitan 7 2. Saponin Steroid9 2.1 Nhóm Spirostan9 2.2 Nhóm Furostan10 2.3 Nhóm Aminofurostan11 2.4 Nhóm Spirosolan12 2.5 Nhóm Solanidan12 NHÓM 2-LỚP DHTP9B 1 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ III. MỘT SỐ LOẠI SAPONIN QUAN TRONG VÀ CÔNG DỤNG12 1.Một số loại Saponin quan trọng12 2.Công dụng trong y học13 PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ- PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ4 I . TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ4 1.Cách xử lí mẫu14 2.Hóa chất14 3.Nguyên tắc thực hiện14 II. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ ĐO TỔNG SỐ SAPONIN14 1.Phương pháp UV/VIS14 1.1 Hóa chất sử dụng14 1.2 Nguyên tắc thực hiện15 1.3 Cách tiến hành15 1.4 Lưu ý15 1.5.Phương pháp UV/VIS với một số mẫu thực vật15 1.6.Xác định tổng số Sapogenin17 1.6.1 Nguyên tắc thực hiện17 1.6.2 Cách tiến hành17 2.Phương pháp quang phổ tán huyết17 2.1 Nguyên tắc17 2.2 Hoá chất và cách tiến hành18 2.3 Ví dụ về kết quả đo được18 NHÓM 2-LỚP DHTP9B 2 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ 3.Phương pháp đo quang18 3.1 Các xác định mẫu18 3.2 Hóa chất và pha chế thuốc thử18 3.3 Tiến hành18 3.4 Kết quả19 3.5 Một vài ví dụ khác về hóa chất và cách tiến hành19 Phụ lục20 1. Xác định Saponin tồng số trong cỏ càri bằng phương pháp quang phổ UV/VIS 2.Phân biệt sapogenin triterpenoid và saponin steroid bằng quang phổ 20 3.Sơ đồ phân loại Saponin 23 Tài liệu tham khảo24 NHÓM 2-LỚP DHTP9B 3 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ Saponin và phương pháp xác định Saponin tổng số Phần I : Saponin- Tính chất, Cấu tạo và Phân loại I) Saponin-Nguồn gốc và tính chất đặc trưng 1) Định nghĩa : Saponin còn gọi là Saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao. Saponin gồm các chất vô định hình thường là cao phân tử .Tiền tố latinh sapo có nghĩa là xà phòng và thực tế thường gặp từ "saponification" có nghĩa là sự xà phòng hóa trong cả tiếng Anh và tiếng Pháp. Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axít loãng, Saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm genin gọi là Sapogenin (aglycone ) và phần đường (glycone) gồm một hoặc nhiều phân tử đường. Các đường phổ biến là D-glucoza, D-galactoza, Larabinoza, axít galactunoic, axít D-glucuronic... Phần genin có thể có cấu trúc cholan như sapogeninsteroi hoặc Sapogenintritecpen dạng β-amirin (axít olenoic), dạng α-amirin (axít asiatic), dạng lupol (axit buletinie) hoặc tritecpen bốn vòng. 2) Sự phân bố trong thực vật: Saponin Steroid thường gặp trong những cây một lá mầm. Các họ hay gặp là: Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Liliaceae, Smilacaceae. Ðáng chú ý nhất là một số loài thuộc chi Dioscorea L.; Agave L.; Yucca L. Saponin Triterpenoid thường gặp trong những cây 2 lá mầm thuộc các họ như: Acanthaceae, Amaranthaceae, Araliaceae, Campanulaceae, Caryophyll-aceae, Fabaceae, Polygalaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sapotaceae. Trong cây saponin thường tích lũy ở những bộ phận khác nhau: tích lũy ở quả như bồ kết, bồ hòn; rễ như cam thảo, viễn chí, cát cánh; lá như dứa Mỹ... 3)Tính chất vậy lý của Saponin: Saponin là Glucosid với các đặc tính tạo bọt bởi sự kết hợp của Sapogenin (phần kị nước tan trong chất béo ) và phần đường tan trong nước . Saponin đa số có vị đắng ngoại trừ một số như Glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, Abrusosid trong cam thảo dây, Oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt.Saponin tan trong nước, Alcol, rất ít tan trong Aceton, Ether, hexan do đó người ta dùng ba dung môi này để tủa saponin. Saponin có thể bị tủa bởi chì Acetat, Bari Hydroxyd, Ammoni Sulfat. Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế Saponin trong quá trình chiết xuất. Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất Acetyl Sapogenin thường dễ kết tinh hơn Saponin. NHÓM 2-LỚP DHTP9B 4 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ Saponin gồm các chất vô định hình thường có cao phân tử . Độ tan của saponin cũng bị ảnh hưởng bởi các tính chất của dung môi (như bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, thành phần, và pH), trong đó nước và cồn (methanol, ethanol) là dung môi trích Saponin phổ biến nhất.) Các saponin đềều là các chấất hoạt quang. Thường các Steroit saponin thì tả truyềền còn Triterpenoit Saponin thì hữu truyềền. Điểm nóng chảy của các Sapogenin th ường rấất cao. 4.Một số tính chất đặc biệt của Saponin: - Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi hòa tan vào nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch. - Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng. - Ðộc với động vật máu lạnh đặc biệt là vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên. - Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt,có tác dụng lomg đờm, lợi tiểu, liều cao gây nôn mửa, đi lỏng. _Có thể tạo phứa với Cholesterol hoặc các chá 3--hydroxysteroid khác _Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin.Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol II) Phân loại Saponin: Các saponin có thể được phân loại như steroid, triterpenoidal hoặc ancaloit tùy thuộc vào bản chất của các aglycone. Dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia ra:  Saponin Triterpenoid : Gồm loại trung tính và loại acid  Saponin Steroid : Gồm loại trung tính và loại kiềm ( có Nito hay còn gọi là Ankaloid Saponin ) NHÓM 2-LỚP DHTP9B 5 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ Cấu trúc hóa học: 1) Saponin Triterpenoid: Phần genin của loại này có 30 Carbon cấu tạo bởi 6 nhóm Hemiterpen, được chia làm 2 loại là   Saponin triterpenoid pentacyclic Saponin triterpenoid tetracyclic 1.1) Saponin Triterpennoid pentacyclic : Gồm các nhóm Olean, Ursan, Lupan, Hopan. 1.1.a) Nhóm Olean: Phần lớn các Saponin Triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này. Phần aglycon có 5 vòng và thường là dẫn chất của 3- hydroxy olean 12 - ene, tức là  amyrin (A) Vd: Một vài aglycon - Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = - CH 3, R3 = -COOH. - Hederagenin: R2 = R4 = R5 = -CH 3, R1 = - CH 2 OH , R3 = -COOH . - Gypsogenin: R2 = R4 = R5 =- CH 3, R1 = -CHO , R3 = -COOH Mạch đường có thể nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch đường nối vào C-28 theo dây nối ester. Gần đây người ta phân lập được các saponin có đến 10-11 đơn vị đường nếu kể cả 2 mạch, riêng một mạch có thể đến 6 đơn vị đường 1.1.b) Nhóm Ursan : Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm olean chỉ khác là nhóm methyl ở C-30 không đính vào vị trí C-20 mà lại đính ở vị trí C-19. Các sapogenin nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3- hydroxy ursan 12-ene, tức là α-amyrin. Những Saponin của nhóm này ít gặp hơn nhóm olean. Cinchona glycosid A, Cinchona glycosid B có trong cây canh-ki-na, Asiaticosid có trong rau má là những Saponin của nhóm này. NHÓM 2-LỚP DHTP9B 6 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ 1.1.c) Nhóm Lupan: Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng và thường có nối đôi ở vị trí 20-29. Lấy một ví dụ là saponin có trong rễ cây Ô rô Acanthus iliciformis. Một số saponin có trong cây ngũ gia bì chân chim cũng thuộc nhóm này. 1.1.d) Nhóm Hopan: Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-22 ở ngoài vòng và nhóm methyl góc đính ở C-18 thay vì ở C-17. Saponin đầu tiên được biết là chất mollugocin A có trong cỏ thảm Mollugo hirta L. NHÓM 2-LỚP DHTP9B 7 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ 1.2) Saponin Triterpenoid Tetracyclic: Gồm 3 nhóm chính là Dammaran, Lanostan, Cucurbitan. 1.2.a) Nhóm Dammaran : Ðại diện là các saponin của nhân sâm. Phần aglycon gồm bốn vòng và một mạch nhánh. Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran. Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta đã thu được các genin thật. Hai genin chính là: protopanaxadiol và protopanaxatriol. Phần đường nối vào OH ở cabon số 3 hoặc có khi thêm 1 mạch nữa nối vào OH ở mạch nhánh. Saponin triterpenoid tetracyclic nhóm damaran còn gặp trong hạt táo (Ziziphus jujuba Mill.), rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst. 1.2.b) Nhóm Lanostan: Holothurin A, một trong những saponin có trong các loài hải sâm - Holothuria spp. là một ví dụ của nhóm này. Một nhóm phụ của nhóm Lanostan là nhóm Cycloartan có cấu trúc 9,19 cyclo (9) lanostan. Các Saponin Abrusosid A, B, C, D có trong cam thảo dây Abrus precatorius là những saponin thuộc nhóm này. NHÓM 2-LỚP DHTP9B 8 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ 1.2.c) Nhóm Cucurbitan : Phần lớn các saponin nhóm Cucurbitan gặp tronghọ Cucurbitaceae. Ở đây nhóm CH 3 ở C19 không đính vào C10 mà thay vào đó lại đính ở C9. 2. Saponin Steroid: Gồm một số nhóm như Spirostan, Furostan, Aminofurostan, Spirosolan, Solanidan 2.1) Nhóm Spirostan: Ta xét 3 chất Sapogenin làm ví dụ:    Sarsasapogenin Smilagenin Tigogenin. _Đặc điểm chung : Những chất này có 27 carbon như cholesterol nhưng mạch nhánh từ C20 tới C27 tạo thành 2 vòng có oxy (16,22 và 22,26 diepoxy ), một vòng là hydrosfuran (vòng E) và một vòng là hydropyran (vòng F). Hai vòng này nối với nhau bởi 1 carbon chung ở C-22. Mạch nhánh này được gọi là mạch nhánh Spiroacetal. Ba chất trên là 3 đồng phân.  Sarsasapogenin và Smilagenin thì khác nhau do cấu hình ở C-25. Sarsasapogenin có nhóm methyl ở C-25 hướng axial có cấu hình tuyệt đối 25S, Smilagenin thì nhóm methyl ở C-25 hướng equatorial có cấu hình tuyệt đối 25R. Các Saponin nhóm này có nối vòng C và D trans (khác với glycosid tim). Còn vòng A và B có thể là cis như ở chất Sarsasapogenin và Smilagenin hoặc có thể là trans như ở chất Tigogenin. NHÓM 2-LỚP DHTP9B 9 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ  Smilagenin và Tigogenin khác nhau do cấu hình ở C-5. Công thức lập thể của 3 chất Sarsasapogenin, Smilagenin và Tigogenin: Nhóm OH ở C3 thường hướng , một số hướng α ví dụ các saponin của tỳ giải. Ở dạng glycosid phần đường được nối vào OH ở C-3, một số ít trường hợp ở C1. Mạch đường thường phân nhánh và phức tạp. Ví dụ: Digitonin là một Saponosid có trong cây digital, có mạch đường gồm 5 đơn vị đường và phân nhánh: Xyl - 1 → 3glc-1 → 4gal →digitogenin 2 |1 glc-1 → 3gal Nhóm Spirostan hiện nay được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid. Hai saponin quan trọng nhất là diosgenin (có chủ yếu trong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu trong các loài Agave). 2.2) Nhóm Furostan : Đặc điểm chung : Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm Spirostan chỉ khác là vòng F bị biến đổi.Có hai trường hợp :_Trường hợp thứ nhất: vòng F mở và nhóm alcol bậc một ở C-26 được nối với đường glucose. Nếu glucose ở C-26 bị cắt (bởi enzym hoặc bởi acid) thì xảy ra sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm Spirostan. NHÓM 2-LỚP DHTP9B 10 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ Ví dụ Sarsaparillosid dưới tác dụng của enzym thủy phân cắt mạch glucose ở C-26 sẽ chuyển thành Parillin. Trường hợp thứ hai: vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25 epoxy ví dụ Avenacosid có trong yến mạch (Avena L. Họ Lúa - Poaceae) Avenacosid A cũng có 2 mạch đường . Khi thủy phân cắt đường glucose ở C-26 thì cũng chuyển thành dẫn chất nhóm Spirostan. Sarsaparilosid và Avenacosid A đều có 2 mạch đường. Người ta gọi đây là các bidesmosid (desmos = mạch). 2.3) Nhóm Aminofurostan: Ở đây vòng F mở như trường hợp sarsaparillosid nói ở trên nhưng ở vị trí C-3 đính nhóm NH2. Ví dụ jurubin, là saponin có trong Solanum paniculatum. NHÓM 2-LỚP DHTP9B 11 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ 2.4) Nhóm Spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F được thay bằng NH. Một điểm cần chú ý là ở đây có Isomer ở C-22 (khác với nhóm spirostan). Ví dụ Solasonin có trong cây cà Úc (cà lá xẻ ) Solanum laciniatum có cấu trúc (25R) 22α còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22. 2.5) Nhóm Solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này. Ở đây 2 vòng E và F cùng chung 1C và 1N. Những chất thuộc 3 nhóm Aminofurostan, Spirosolan và Solanidan đều có chứa N vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên được gọi là những chất Glycoalcaloid. 2.6) Ngoài những nhóm Saponin Steroid kể trên người ta còn gặp một số saponin steroid có cấu trúc mạch nhánh khác : Ví dụ Polypodosaponin và Oslandin được Jizba phân lập (1971) từ thân rễ cây Polypodium vulgare L. Oslandin là một bidesmosid có vị ngọt. αSpinasterol glycosid có trong cây chè Camelia sinensis (L.) O. K.tze (Thea sinensis L.). III) Một số loại saponin quan trọng và tác dụng : 1) Một số loại Saponin quan trọng: Saponin Ro: Có khả năng phân giải rượu, chống viêm gan, phục hồi hư tổn gan Saponin Rb1: Kiềm chế hệ thống thần kinh trung ương, làm dịu cơn đau, bảo vệ tế bào gan. Saponin Rb2: Chống bệnh tiểu đường, chống xơ cứng gan, đẩy nhanh khả năng hấp thụ của tế bào gan. Saponin Rc: Giúp làm dịu cơn đau, làm tăng tốc độ tổng hợp protein. Saponin Rd: Đẩy nhanh hoạt động của vỏ tuyến thượng thận. Saponin Re: Bảo vệ gan, làm tăng tốc độ tổng hợp của các tế bào tủy. Saponin Rf: Giúp làm dịu cơn đau trong các tế bào não. Saponin Rg1: Giúp tập trung, chống mệt mỏi. Saponin Rg2: Hạn chế sự gắn kết các tiểu cầu máu, phụ hồi trí nhớ. Saponin Rg3: Hạn chế quá trình chuyển giao ung thư, bảo vệ gan. NHÓM 2-LỚP DHTP9B 12 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ Saponin Rh1: Bảo vệ gan, chống khối u, hạn chế gắn kết tiểu cầu máu Saponin Rh2: Hạn chế ung thư phát triển, hạn chế khối u phát triển. 2) Tác dụng, công dụng của một số Saponin - Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho, là hoạt chất chính trong các dược liệu chữa ho như viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, mạch môn... - Một số dược liệu chứa Saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn,... - Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ như nhân sâm, tam thất và một số cây thuộc họ nhân sâm khác. - Saponin làm tăng sự thấm của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu, ví dụ trường hợp digitonin trong lá Digital. - Một số Saponin có tác dụng chống viêm. Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus. - Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm. - Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể). - Sapogenin Steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid. - Digitonin dùng để định lượng cholesterol. - Một số nguyên liệu chứa saponin dùng để pha nước gội đầu, giặt len dạ, tơ lụa Một số saponin tăng cường khả năng hấp thụ thức ăn của động vật không nhi lại thì số khác rất có hại. Ví dụ: Saponin tìm thấy trong yến mạch và rau bina tăng và thúc đẩy khả năng của cơ thể để hấp thụ canxi và silicon, do đó hỗ trợ tiêu hóa. Một số cỏ dại cỏ chứa một lượng đáng kể các saponin nguy hiểm và kết quả trong cuộc sống đe dọa độc tính đối với các loài động vật nào đó NHÓM 2-LỚP DHTP9B 13 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ Phần II : Phương pháp xác định Saponin tồng số_ Phương pháp quang phổ Có nhiều phương pháp xác định Saponin song phần trình bày của nhóm chỉ đề cập đến phương pháp quang phổ. I) Tổng quan về phương pháp quang phổ Phương pháp quang phổ đã trở thành một phương pháp phổ biến trong việc định lượng Saponin từ nguyên liệu thực vật và có thể cả động vật bởi vì nó đơn giản, nhanh chóng và không tốn kém để thực hiện. 1) Cách xử lí mẫu phân tích: Để đánh giá saponin tổng số có thể thực hiện bằng một thao tác đơn giản để kiểm tra sự có mặt của Saponin. Điều này có thể được thực hiện bằng cách đặt các nguyên liệu thực, động vật vào một ống nghiệm chứa đầy nước cất và lắc mạnh trong 2 phút( Ncube et al, 2011). Sự xuất hiện của bọt ổn định và liên tục trên bề mặt chất lỏng trong 15 phút chỉ ra sự có mặt của các Saponin. Định lượng Saponin thường được thực hiện bởi phương pháp quang phổ và phương pháp sắc ký. Sự khác biệt giữa hai phương pháp này là phương pháp quang phổ cho biết tổng giá trị Saponin trong khi phương pháp sắc ký định lượng hợp chất Saponin cụ thể. 2) Hóa chất : Phương pháp khảo nghiệm xác định saponin tổng số,Vanillin-acid Sulfuric là lựa chọn phổ biến nhất trong phương pháp định lượng Saponin trong máy quang phổ. Tuy nhiên có vài yếu tố, chẳng hạn như lựa chọn các tiêu chuẩn, bước sóng và những yếu tố khác cần được xem xét trước khi sử dụng phương pháp này 3) Nguyên tắc thực hiện: Các nhuyên tắc cơ bản của phương pháp này là các phản ứng oxy hóa giữa Saponin Triterpene với vanillin( Li et al, 2010). Axit sunfuric được sử dụng như là chất oxy hóa và màu sắc đặc trưng của phản ứng là màu tím ( Hiai, Oura, & Hakajima, 1976) và đôi khi axit Pecloric được sử dụng( Chen, Xie et al, 2007; Li, Zu et al, 2010; Wu et al, 2001). Do sự khác biệt trong việc lựa chọn thuốc thử, điều kiện để cho thuốc thử phát triển đầy đủ màu sắc, tiêu chuẩn và các bước sóng từ các nghiên cứu trước đó như đã, thật khó để so sánh các kết quả trong mỗi lần kiểm định.Tuy nhiên nó cung cấp tài liệu tham khảo tốt cho thiết kế thử nghiệm trong tương lai. II) Một số phương pháp quang phổ trong xác định Saponin tổng số 1) Phương pháp UV-Quang phổ : Đây là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất. Quang phổ UV / VIS Ultraviolet : Phân tích Saponin trong vùng ánh sáng khả kiến 1.1) Hoá chất sử dụng : Trong phương pháp hóa chất được dùng là một hỗn hợp củaVanillin và Acid Acetic được sử dụng có thể dùng acid H 2 SO 4 thay thế. Vanillindễ dàng bị oxy hóa và tạo thành màu tím khi bị oxy hóa bởi Acid Percloric. NHÓM 2-LỚP DHTP9B 14 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ 1.2)Nguyên tắc thực hiện: Hai công trình (Patel et al., 2012a và Ncube et al., 2011) đã được tìm thấy bằng cách sử dụng các điều kiện 60°C và 10 phút để cho hỗn hợp có sự phát triển đầy đủ màu sắc theo một thủ tục trong Hiai et al. (1976). Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu khác sử dụng 70 ° C trong 15 phút (Chen et al., 2007b) và 20 phút (Li et al., 2010b) cho phép phát triển đầy đủ màu sắc. Sự khác biệt này cần được chuẩn hóa, vì thời gian phản ứng có thể gán trực tiếp với giá trị độ hấp thụ thực mà sau đó chuyển vào số lượng. 1.3) Cách tiến hành: Phương pháp tổng Saponin là để định lượng tổng số saponin từ phản ứng của Triterpene oxy hóa Saponin với Vanillin (Li et al., 2010b), nhưng không tránh khỏi đặt câu hỏi liệu việc lựa chọn tiêu chuẩn để được sử dụng trong máy quang phổ là điều cần thiết để thể hiện các nhóm saponin chính xác từ các nguồn thực vật. Thật không may, các thông tin có liên quan về việc lựa chọn các tiêu chuẩn là hiếm được tìm thấy. Không giải thích được ghi trong tác phẩm trước đây về việc lựa chọn bước sóng, nhưng hầu hết các nghiên cứu lựa chọn bước sóng 544 nm được quan sát. Tuy nhiên, các bước sóng được chọn nằm trong khoảng 480-610 nm, trừ 473 nm (Mostafa et al., 2013) và 283 nm (Liu et al., 2012b), có lẽ là do sự hấp thụ tối đa của màu tím nằm trong phạm vi này (Bruice, 2007). 1.4) Lưu ý : Để đảm bảo rằng các điều kiện thích hợp, điều quan trọng là dung dịch acid Aanillinacetic phải được tạo thành trong cùng một ngày tiến hành đo đã được sử dụng nguyên nhân docơ chế của acid Acetic-vanillin, acid Percloric làm mất nước với các nhóm Hydroxyldo đó làm tăng số lượng liên kết đôi trong hệ thống liên hợp. 1.5) Phương pháp quang phổ UV/vis với một số mẫu thực vật Vật liệu Hỗn hợp chất phản ứng Linh ganoderma 0.2ml vanillin 5%-axit acetic+ 1.2 ml axit pecloric Củ khoai mì 0,5 ml 8% Ipomoea vanillin trong ethanol+ 5ml dungdịch axit sulfuric 72% trong nước Nhân 0.2ml vanillin Xanthocera 5%axit s sorbifolia acetic+ 1.2 ml Bunge axit pecloric 70% NHÓM 2-LỚP DHTP9B Điều kiện cho phép phát triển đầyđủ màu sắc 70oC,15 phút Điều kiện làm mát trước khí UV/vis đo lường Tiêu chuẩn sử dụng Bước sóng được chọn (nm) Loại máy đo quang Năng suất thu được Chạy nước, phút Axit oleanolic 550 Chùm kép 5.11%( bằng cách sử dụng cao nhất MAE) 60oC, 20 phút 0oC,5 phút Axit oleanolic 544 _ 200.01 mg/ 100g trọng lượng khô 70oC, 20 phút Chạy nước, phút Axit oleanolic 550 Máy quang phổ Unico 2100( shan ghai Unico Equipment Co.Ltd. Các thông số khai thác lò vi sóng hỗ trợ tối ưu ở 51OC, 7 phút, 900W, 52 ml/g, ethanol 42% và 3 quá trình chiết saponin mang lại 2 2 15 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ Trung Quốc) 0.5ml vanilin 8%+ 5ml axit sulfuric 72% _ 60oC, 10 phút Bồn nước đá,15 phút Axit oleanolic 538 _ _ _ _ _ Alium nigrum L Vanillin 0.7%axit sulfuric 72% _ _ Diosgeni n Diosgeni n 473 Tulbaghia violacea 250 ml thuốc thử vanillin( 8g/ 100 ml ethanol)+ 2.5 ml axit sulfuric 72% 0.5 ml dung dịch vanillin 8%( trong ethanol) và 5 ml axit sulfuric 27% 60oC, 10 phút Bồn nước đá, 3- 4 phút Diosgeni n 544 Máy quang phổ U2001( Hi tachi, Tokyo, Nhật Bản) _ 60oC, 10 phút Nước đá Soyasapo nin 544 Multidetec tionmicrop late reader(Syn ergyTMH T, BIOTEK,GA, USA). _ _ _ Soyasapo nin 544 _ 0.25 ml thuốc thử vanillin( 8%, w / v trong 99.9% ethanol) + 2.5ml 72% (v / v) axit sulfuric. 6 ml axit sulfuric 60oC, 10 phút Bồn nước đá Quillaja saponin 544 _ 60oC, 30 phút Nước lạnh Sarsasapo genin 283 _ Bryonia Laciniosa Cám gạo Sữa nành đậu Súp đậu Bian-Que (gồm đậu tương đen, đậu xanh và đậu đỏ adzuki) Hạt giống của Chi Ngưu tất Aspara, Tribulus Terrestris, và Albizia lebbeck Rhizoma anemarrhen a NHÓM 2-LỚP DHTP9B 16 cao nhất đạt 11.62±0.37% của hạt nhân đã khử chất béo 15 mg/ mg 236,14mgDE/g extract Sản lượng( mg/ g dw): rễ: 19.38; củ: 15.65; lá: 10,48 Sản lượng( mgDE/ ml): micropropagated: 25.14; trồng ngoài trời: 8.94 Đối với cả hai đậu nành lên men và không lên men chiết xuất sữa với 80% methanol cho sản lượng cao nhất 247,44 và 167,21 mg saponin / g chiết xuất, so với 50% acetone và nước Súp đậu đen đậu nành:76.60-108.50 mg / g; súp đậu đỏ adzuki: 103.18129.49mg / g; súp đậu xanh: 32.8439.23mg / g. Các nội dung tổng saponin của hạt giống trong cây trấu, gokhru và Siris là 45,75, 25,65 và 48,26% (w/w), tương ứng Purity 65.3% SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ Rễ của Panax quinquefoli um và nhân sâm Panax 0,2 ml vanillinacetic + ml percloric 5% axit 0,8 acid 60oC, 15 phút _ Ginsenosi de 560 _ Nó đã được tìm thấy bằng UAE nhanh hơn so với các phương pháp chiết xuất truyền thống khoảng ba lần 1.6) Xác định tổng Sapogenin: Các Sapogenin Triterpenoid trong H2SO4 đậm đặc có đỉnh hấp thu cực đại trong vùng tử ngoại ở 310nm. Cực đại này không thể hiện với các Saponin Steroid. Tổng Sapogenin Steroid được sử dụng để xác định số lượng cụ thể steroidal saponins bên trong của nguyên liệu thực vật (Baccou, Lambert, & Sauvaire, 1977). Sự khác biệt giữa tổng saponin và tổng sapogenins steroid là các dung môi được sử dụng để chuẩn bị các thuốc thử. 1.6.1) Cách xử lí mẫu: đối với tổng Sapogenins Steroid, cả Anasaldehyde và acid Sulfuric được pha loãng với Ethyl Acetate. Tổng Sapogenins Steroid đã được chứng minh ổn định và tái sản xuất với một số tiêu chuẩn, tức là., Diosgenin, Tigogenin, Hecogenin, Smilagenin, Yonagenin, Tokorogenin, vv... mà không cần sự can thiệp từ các loại đường, Sterol, acid béo và dầu thực vật (Baccou et al., 1977). 1.6.2) Nguyên tắc và cách tiến hành: Phương pháp này cũng dựa trên các phản ứng màu với anisaldehyde (hoặc vanillin), acid sulfuric và ethyl acetate đo tại bước sóng tối đa λmax = 430 nm. Các qui trình để xác định số lượng tổng sapogenin steroid là đo trọng lượng 0-40 mg thô và hòa tan trong 2 ml ethyl acetate trong ống nghiệm. Sau đó trộn với 1 ml thuốc thử A( bao gồm 0,5 ml anisaldehyde và 99,5 ml ethyl acetate) và 1 ml thuốc thử C (gồm 50ml axit Sulfuric đậm đặc và 50 ml Ethyl Acetate). Các ống nghiệm với hỗn hợp đã được đặt trong nồi cách thủy ở 60°C trong 10 phút để phát triển đầy đủ màu sắc. Sau đó, nó được làm lạnh trong 10 phút ở nhiệt độ phòng trước khi đo ở 430 nm của một máy quang phổ. Các ống nghiệm được đặt trong một bồn nước duy trì ở 70°C trong 15 phút để phát triển màu sắc đầy đủ, sau đó để nguội trong 2 phút ở bồn nước 0°C và đo khối lượng đến 25 ml acid Acetic bằng đồng hồ. Sau 30 phút ổn định, chỉ sau đó ống nghiệm đã được đo độ hấp thụ tại 454 nm trong một quang phổ kế và mang lại tổng saponin steroid 28,34% (w/w) của bột đông khô. 2) Phương pháp quang phổ tán huyết: Sử dụng để định lượng Sapponin tổng số của một nguyên liệu thực phẩm 2.1) Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp này là phản ứng của saponin với thuốc thử máu để sinh ra oxy-hemoglobin là một kết quả màu đo lường trong máy quang phổ. NHÓM 2-LỚP DHTP9B 17 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ 2.2) Hóa chất và cách tiến hành: Các saponin này hòa tan vào trong nước cất và 100 ml dung dịch này được ủ với 1ml EDTA- máu tươi ở 30oC trong 30 phút. Sau khi ly tâm trong 10 phút, hemoglobin được đo quang tại 545 nm và kết quả được thể hiện trong saponin tan máu 2.3) Ví dụ về kết quả đo được: Kết quả phân tích cho thấy giống mướp đắng trắng được phát hiện có chứa saponin rất thấp. Nồng độ là 0,25% thấp hơn so với giống xanh nồng độ là 0,67%. 3) Phương pháp đo quang: Chọn thảo dược: Bột ngưu tất làm mẫu xác định: 3.1) Cách xác định mẫu : +Mẫu chuẩnCân chính xác khoảng 1g bột ngưu tất, cho vào cối sứ nghiền kĩ với cồn 0 80 C . Tráng chày cối bằng cồn 80 C , thêm cồn đến vạch, lắc đều, lọc lấy dịch trong 0 +Mậu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,04 g Axit Oleanolic, hòa tan trong cồn 800 C vừa đủ 100 ml 3.2) Hóa chất pha chế thuốc thử : Thuốc thử gồm dung dịch Vanilin 8% và Axit Sunfuric 72 % Đề pha được dd thuốc thử cần :        Vanilin 800 mg Nước cất 28 ml Cồn tuyệt đối 10ml Axit H 2 SO 4 72 ml Thuốc thử Ortho Toluidin 8 ml Thioure 0,15 g Axit Axetic vừa đủ 100ml 3.3) Tiến hành : Lần lượt hút chính xác thể tích các dung dịch và thuốc thử, lần lượt chó vào 3 ống nghiệm như bảng sau : NHÓM 2-LỚP DHTP9B 18 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ Trộn đều, đun cách thủy ở 600 C trong 10 phút. Lấy ra làm lạnh bằng nước đá. Đo mật đọ quang của ống chuẩn và ống thử đối với ống trắng ở bước song λ= 538 nm. Định lượng Saponin ở mẫu thử và mẫu trắng 3.4) Kết quả: Hàm lượng Saponin trong mẫu thử Số lầ n 1 Các mẫu 0 1 2 3 4 5 6 7 10.08 9.12 10.36 10.12 10.04 10.46 9.28 10.02 2 9.48 10.20 9.28 9.76 9.78 9.70 10.46 9.56 3 10.46 10.26 9.96 10.20 10.30 10.06 10.14 10.38 T B 10.01 9.86 9.87 10.03 10.04 10.07 9.96 9.99 Hàm lượng Saponin trong mẫu trắng Nhận xét: Hàm lượng Sponin trong các mẫu khác nhau không đáng kể vá có giá trị xấp xỉ 10% 3.5 Một vài ví dụ khác về hóa chất và cách tiến hành đó quang: Ví dụ: định lượng acid glycyrrhetic trong cam thảo, phản ứng cho màu tím; còn đối với nhóm spirostan, A. Akahori dùng aldehyd có nhân thơm+ acid phosphoric để định lượng: 50mg sapogenin+ 500mg anis aldehyd trong ethanol 99%, đun 10 phút ở 100 oC để yên 1 giờ rồi đo mật độ quang ở 550nm. Các dẫn chất D 5- sapogenin ví dụ diosgenin thì dùng thuốc thử FeCl3- H3PO4: 800mg FeCl3 trong 10ml nước (a), lấy 1ml (a) thêm đủ 50ml với H3PO4 (b). 50 mg diosgenin + NHÓM 2-LỚP DHTP9B 19 SAPONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SAPONIN TỔNG SỐ 50ml (b) làm lạnh 5 phút trong nước đá, thêm 0,5ml H 2SO4, làm lạnh 10 phút rồi đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 700C trong 9 phút. Phụ lục 1) Xác định Saponin tồng số trong cỏ càri bằng phương pháp quang phổ UV/VIS Trigonella foenum-graecum, thường được gọi là cỏ cà ri, là một cây họ đậu để nhiều quốc gia châu Á, Trung Đông và châu Âu.Xác định kiểu gen cỏ cà ri giàu saponin nhất định sẽ có ích cho các ngành công nghiệp dược phẩm. Trong nghiên cứu này, saponin steroid được phân tích trong 46 kiểu gen cỏ cà ri khác nhau trên cơ sở trọng lượng khô. Sự khác biệt đáng kể nào trong tổng số saponin trong số các kiểu gen. Saponin dao động từ 0,92 g đến 1,68 g và 3,25-6,88 g tương ứng với giá trị trung bình 1,34 g và 5,19 g / 100 g dw tương ứng Fenugreek, Trigonella foenum-graecum còn được gọi là methi, hột cỏ Hy Lạp, và chân chim là một thành viên của gia đình họ đậu. Các hạt giống cỏ cà ri từ lâu đã được biết đến như một loại thuốc cổ truyền, có tác dụng hypocholesterol và đái tháo đường. Các hoạt động hypocholesterol có liên quan đến các phần đã khử chất béo của các chiết xuất từ hạt và liên quan đến subfractions saponin phong phú. Ngoài ra, hạt cỏ cà ri được cho là có tính chất phục hồi và dinh dưỡng và kích thích quá trình tiêu hóa. Tại Ấn Độ, họ được biết đến là một thành phần quan trọng của một món ăn truyền thống (MethiPak) tiêu thụ trong thời kỳ mang thai và cho con bú. Hơn nữa, hạt cỏ cà ri nổi tiếng với đặc tính thơm hăng của họ; như một gia vị, họ là một thành phần của nhiều chế cà ri và thường được sử dụng để thực phẩm hương vị và kích thích sự thèm ăn. Các vật liệu thí nghiệm gồm 46 đan có kiểu gen cỏ cà ri được lấy từ Ngân hàng Quốc gia Gene, quốc gia của Cục Tài nguyên di truyền thực vật, New Delhi, Ấn Độ. Các mẫu hạt giống (3 lần lặp lại của mỗi kiểu gen) đã được xay và qua Mỹ thử tiêu chuẩn Sàng vị trí 20 với Hiệp hội Kiểm nghiệm và Vật liệu (ASTM) thông số kỹ thuật E11 (Sieve Kích thước 0,850 mm) và sấy khô cho 3 h trong lò khí nóng ở 60 ° và được lưu trữ trong bình hút ẩm và giữ trong bóng tối. Hóa chất Tất cả các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này là các lớp phân tích. Diosgenin (~ 95%) được mua từ Sigma Chemical Co St. Louis, MO, USA. p-anisaldehyd (4methoxybenzaldehyde) (≥98%) và acid sulfuric (~ 98%) thu được từ Merck, Hohenbrunn, Đức. Tất cả các dung môi hữu cơ khác được mua từ Fisher Scientific, Nepean, ON, Canada. Cách xử lý mẫu NHÓM 2-LỚP DHTP9B 20