Tài liệu Các phương pháp phát hiện và định danh salmonella

Các phương pháp phát hiện và định danh Salmonella - Salmonella chỉ chứa hai loài, nhưng bao gồm khoảng 2.500 'phân loài', nhiều trong số đó có thể gây ra bệnh tật của con người, thường do thực phẩm gây ra. - Phương pháp phát hiện và xác đinh truyền thống được thiết lập lâu và mất thời gian từ 3 đến 5 ngày mới có kết quả. - Pháp pháp phát hiện và xác định nhanh được sử dụng rộng rãi và có khả năng phát hiện trong vòng 24h. I. Phát hiện và phân lập Lưu trữ và chuẩn bị mẫu Mẫu phân là thường xuyên nhất kiểm tra vật liêu lâm sàng cho Salmonella. Phân động vậtvà nguồn nước cũng có thể được kiểm tra. Số lượng lớn các thành phần thực phẩm và các sản phẩm thực phẩm được xét nghiệm thường qui của ngành công nghiệp thực phẩm, vì sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trong thức ăn sẵn sàng để ăn là không thể chấp nhận được. Một loạt các loại thực phẩm có thể được kiểm tra, nhưng các sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ sữa là một mối quan tâm đặc biệt. Thực phẩm và các thành phần khác, nơi kiểm tra thường xuyên được yêu cầu bao gồm, sô cô la bánh kẹo, các loại thảo mộc và gia vị, xà lách tươi, trái cây, các loại hạt, bột và sò ốc. Lấy mẫu từ thân thịtđộng vật giết mổ cũng có thể được thực hiện. Salmonella là không thể phát triển ở nhiệt độ thấp và mẫu phải được làm lạnh nếu họ không thể được gửi đi phân tích ngay lập tức.Các tế bào sống sót tốt trong thực phẩm đông lạnh và các vật liệu khác, nhưng mẫu phải được giữ đông lạnh trước khi thử nghiệm. Thông thường, các mẫu thực phẩm 25g được nuôi cấy trong kiểm tra phát hiện, nhưng các loại thực phẩm khô đòi hỏi một giai đoạn hồi sinh cho các tế bàosub-lethally bị hư hại trong môi trường tiền tăng sinh không chọn lọc,chẳng hạn như đệm peptone, trước khi môi trường hơn nữa. Hơn nữa, một số thực phẩmkhô, đặc biệt là các loại thảo mộc và gia vị và hành khô, chứa các hợp chất có thể ức chếsự phát triển vi khuẩn Salmonella trong các môi trường tăng sinh. Các hợp chất này nên được vô hiệu hóa, hoặc bằng việc bổ sung một tác nhân trung hòa thích hợp, hoặc bằng cách thêm pha loãng. Phương pháp truyền thống: - Mẫu lâm sàng thường được nuôi trực tiếp vào môi trường thạch chọn lọc, chẳng hạn nhưXylitol-LysineDesoxycholate (XLD) agar, ủ ở 37oC trong 18-24 giờ. Ngoài ra, mẫu phânthường được cấy vào broth tăng sinh chọn lọc, chẳng hạn như selenite cystine broth và ủ ở 37oC trong 18-24 giờ, trước khi cấy vào môi trường chọn lọc. - Mẫu thực phẩm, thức ăn gia súc, mẫu môi trường thường được thực hiện theo các bước cơ bản sau: + Tiền tăng sinh trong môi trường không chọn lọc như đệm pepton và ủ 37+/-1oC với thời gian 18 giờ+/-2 giờ. + Tăng sinh trong môi trường chọn lọc như Rappaport-Vassiliadis Soy Broth(RVS Broth) ủ nhiệt độ 41,5oC+/-1oC với thời gian 24+/-3 Giờ. Hoặc với Muller-Kauffmann Tetrathionate-Novobiocin (MKTTn) broth ủ 37+/-1oC với thời gian 24+/-3 giờ. + Cấy lên thạch chọn lọc: Môi trường sau khi tăng sinh chọn lọc được cấy ít nhất 2 môi trường chọn lọc ủ 37oC với thời gian 24 giờ. Tiêu chuẩn là XLD agar và một môi trường chọn lọc tự chọn như Bismuth Sulphite agar, Brilliant Green agar và Hektoen Enteric agar.Khuẩn lạc Salmonella điển hình trên môi trường thạch chọn lọc được cấy truyền vào môi trường không chọn lọc trước khi xét nghiệm khẳng định. Ngoài ra, hiện tại một số phương pháp sử dụng các môi trường chỉ thị có sẵn của các hãng Biokar Diagnostoc Pháp để rút ngắn thời gian cũng như thao tác đơn giản như sau: * Compass Salmonella Aga là môi trường chỉ thị Salmonalle. COMPASS Salmonella Agar là một môi trường chọn lọc được sử dụng để phân lập, sự khác biệt và liệt kê tất cả Salmonella. + Cấy bề mặt bởi vệt từ một môi trường tăng sinh chọn lọc được sử dụng để phát hiện Salmonella ủ 37+/-1oC trong vòng 24+/-3h Phương pháp nhanh Với phương pháp truyền thống sẽ mất thời gian dài từ 3 đến 5 ngày, do đó các chuyên gia của các hãng phát triển các phương pháp nhanh để rút ngắn thời gian phân tích, độ chính xác cao và các bước đơn giản hơn và các phương pháp nhanh này được xác nhận thành công AOAC, AFNOR. Với bộ dụng cụ sàng lọc và kiểm tra nhanh được sẵn để sử dụng với các công nghệ khác nhau như công nghệ môi trường tiên tiến, Lai DNA, PCR hoặc REal time PCR. Tất cả các công nghệ đều trải qua quá trình tăng sinh và sử dụng kỹ thuật chuyên biệt của từng hãng để phát hiện Salmonella và thời gian có kết quả không quá 48 giờ. Các phương pháp điển hình như sau: 1. Compact Dry Salmonella: + Tiền tăng sinh trong môi trường không chọn lọc như đệm pepton và ủ 37+/-1oC với thời gian 18 giờ+/-2 giờ. + Môi trường sau tiền tăng sinh cấy lên đĩa Compact Dry SL 41-43oC trong vòng 20-24 giờ. Khuẩn lạc màu xanh hoặc màu đen là Salmonella. 2. SESAME Salmonella TEST SESAME Salmonella Test đại diện cho một phương pháp thay thế để phát hiện vi khuẩn Salmonella trong các sản phẩm thực phẩm, thức ăn gia súc, sữa, trứng và mẫu môi trường. Phân tích có thể đượctuyên bố không phát hiện Salmonella trong 48 giờ sau khi chỉ có haibước trước tiền tăng sinh (Salmonella Enrichment) và sự khác biệt(SESAME Salmonella detection). Xác nhận mẫu dương tính và đếm Khuẩn lạc Salmonella có thể đạt được bằng cách sử dụng COMPASS Salmonella Agar,mà đòi hỏi thêm 24 giờ ủ. 3. IRIS Salmonella IRIS Salmonella là phương pháp phát hiện nhanh tất cà Salmonella trong thực phẩm, sữa, trứng, thức ăn chăn nuôi và mẫu môi trường trong vòng 37 giờ. - Tiền tăng sinh trong môi trường Salmonella Enrichment và thêm chất bổ sung chọn lọc IRIS Salmonella Supplement ủ 41+/-1oC với thời gian 18+/-2 giờ. - Môi trường sau tiền tăng sinh cấy trên môi trường IRIS Salmomella Agar ủ 37+/-1oC với thời gian 24+/-3 giờ. Khuẩn lạc màu hồng là Salmonella. 4. GeneQuence ® Salmonella: Phương pháp lai DNA phát hiện định tính Salmonella trong mẫu thực phẫm, sữa, trứng, thức ăn gia súc và mẫu môi trường. - Tăng sinh trong vòng 24h. - lai DNA thời gian khoảng 2h có kết quả với bộ kít được chuẩn bị sẵn. II. Khẳng định và định danh(Confirmation and identification) Phương pháp truyền thống - Xác định và khẳng định Salmonella dựa trên khuẩn lạc đặc thù sinh màu trên môi trường dinh dưỡng bằng test sinh hóa và huyết thanh. Phương pháp nhanh - Sử dụng các bộ dụng cụ đã được chuẩn bị sẵn của các nhà cung cấp để khẳng định và đinh danh nhanh và được chứng nhận bởi các tổ chức có uy tín trên thế giới như AOAC, AFNOR,... 1. Microgen® Salmonella Latex Agglutination Kit: Test ngưng kết latex dùng để định danh chính xác các khuẩn lạc Salmonela từ đĩa thạch agar chọn lọc trong vòng 2 phút 2. InstantLabs’ Salmonella Species Food Safety Kit: là phương pháp phát hiện nhanh chống DNA Salmonella trong thực phẩm, sữa, trứng, thức ăn gia súc và mẫu môi trường với giới hạn thấp : 1CFU khoảng 12 giờ bằng phương pháp Real-time PCR. Phương pháp được chứng nhân bởi AOAC.