Tài liệu Bước đầu xây dựng mô hình đánh giá hoạt tính đông cầm máu của công thức dược liệu định hướng tác dụng điều trị trĩ trên mô hình in vitro

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC LƯƠNG PHÚ HƯNG KHẢO SÁT CƠ CHẾ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI CHẤT KÍCH TẬP ADP CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CÂY DONG RIỀNG ĐỎ Canna warszewiczii A. Dietr KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: LƯƠNG PHÚ HƯNG KHẢO SÁT CƠ CHẾ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI CHẤT KÍCH TẬP ADP CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CÂY DONG RIỀNG ĐỎ Canna warszewiczii A. Dietr KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: 1. TS. Vũ Thị Thơm 2. TS. Nguyễn Thị Vân Anh Hà Nội – 2020 LỜI CẢM ƠN Khi nhận được đề tài khóa luận này, tôi cảm thấy bản thân rất may mắn khi được học tập và nghiên cứu về lĩnh vực mà tôi yêu thích. Tôi không chỉ học hỏi thêm được nhiều kiến thức mà còn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình và bạn bè. Đầu tiên, tôi xin gửi cảm ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và Bộ môn Y dược học cơ sở cùng các thầy cô giáo trong khoa đã tạo điều kiện cho tôi được làm khóa luận tốt nghiệp và giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Thị Thơm và TS. Nguyễn Thị Vân Anh. Các cô là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Không chỉ truyền đạt kiến thức khoa học cùng những kinh nghiệm quý báu của mình, các cô còn truyền cho tôi lòng yêu nghề, nhiệt huyết và tận tâm với công việc. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Hồng Luyến và nhóm sinh viên đến từ Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các bác sĩ và nhân viên Khoa Huyết học, Bệnh viện Bạch Mai đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn và tình yêu thương sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn quan tâm, khuyến khích, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận. Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Lương Phú Hưng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A AC ADP APTT Arg-Gly-Asp ATP AUC Ca++ CalDAG-GEFI cAMP COX-1 CW DCM DEA DMSO EA FPA GDP GP GTP G-actin IP3 K+ LTA Mg++ Phần trên mặt đất (Aerial) Adenylyl cyclase Adenosine diphosphate Thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa (Activated partial thromboplastin time) Arginylglycylaspartic acid Adenosine triphosphate Mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area Under the aggregation Curve) Ion Canxi Yếu tố trao đổi guanine điều hòa bởi canxi và DAG – 1 Cyclic adenosine monophosphate Cyclooxygenase 1 Canna warszewiczii A. Dietr Dichloromethane Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation) Dimethyl sulfoxide Ethyl acetate Phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final Platelet Aggregation) Guanine diphosphate Glycoprotein Guanine triphosphate Monomer actin Inositol (1,4,5) trisphosphate Ion Kali Phương pháp đo độ ngưng tập tiểu cầu thông qua độ dẫn truyền ánh sáng (Light Transmission Aggregometry) Ion Magie PC PE PIP2 PI 3-K PKB/Akt Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximal Platelet Aggregation) n-Hexan Ngưng tập tiểu cầu Thụ thể hoạt hóa bởi protease (Protease – activated receptor) Phosphatidylcholine Phosphatidylethanolamine Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate Phosphoinositide 3-kinase Serine-threonine protein kinase B/Akt PLC Phospholipase C PLCγ PPADS PPP PRP PS PT R Slope TXA2 t-SNARE UDP UTP vWF v-SNARE Phospholipase Cγ Pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,4′-disulfonic acid Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet-poor plasma) Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet-rich plasma) Phosphatidylserine Thời gian prothrombin (Prothrombin time) Phần thân rễ (Rhizome) Tốc độ ngưng tập tiểu cầu Thromboxane A2 Protein liên kết màng bào tương Uridine diphosphate Uridine triphosphate Yếu tố von Willebrand Protein liên kết màng hạt tiểu cầu MPA nH NTTC PAR DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Bảng Trang Bảng 1.1 Đặc điểm của một số GP chính 4 Bảng 1.2 Thành phần của hạt α 6 Bảng 2.1 Các nhóm tiến hành đo ngưng tập tiểu cầu 26 Bảng 3.1 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) 29 Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) 30 Bảng 3.3 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) 32 Bảng 3.4 Giá trị P của sai khác giữa AUC của các nhóm 32 Bảng 3.5 Mức độ phân rã ngưng tập (DEA) 33 Bảng 3.6 Đánh giá sự phối hợp của PPADS và phân đoạn dịch chiết 39 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên Hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo 3 Hình 1.2 Giai đoạn bám dính 8 Hình 1.3 Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu 9 Hình 1.4 Hiện tượng thay đổi hình dạng 13 Hình 1.5 Cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa 14 Hình 1.6 Cơ chế hòa màng và giải phóng chất từ hạt tiểu cầu 16 Hình 1.7 Các con đường hoạt hóa tiểu cầu và đích tác dụng của các thuốc kháng tiểu cầu 17 Hình 2.1 Mẫu cây Dong riềng đỏ C. warszewiczii A. Dietr 22 Hình 2.2 Sơ đồ tách chiết các phân đoạn dịch chiết C. warszewiczii A. Dietr 23 Hình 2.3 Quá trình ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP 5 M 25 Hình 3.1 So sánh sự khác biệt giữa giá trị trung bình Slope của các nhóm 30 Hình 3.2 So sánh sự khác biệt giữa giá trị trung bình MPA của các nhóm 31 Hình 3.3 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của các nhóm 34 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................ 3 1.1. Sinh lý học tiểu cầu ..................................................................................... 3 1.1.1. Cấu trúc tiểu cầu ..................................................................................... 3 1.1.2. Chức năng tiểu cầu ................................................................................. 7 1.1.2.1. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu .................... 7 1.1.2.2. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương .......... 10 1.2. Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa bởi ADP ....................................... 10 1.2.1. Thụ thể purinergic ................................................................................ 10 1.2.2. Quá trình ngưng tập tiểu cầu in vitro gây ra bởi ADP ......................... 12 1.2.2.1. Pha ngưng tập nguyên phát ............................................................ 12 1.2.2.2. Pha ngưng tập thứ phát .................................................................. 15 1.3. Các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu ...................................................... 16 1.3.1. Nhóm ức chế Cyclooxygenase 1 (COX-1) .......................................... 17 1.3.2. Nhóm ức chế thụ thể P2Y12 .................................................................. 18 1.3.3. Nhóm ức chế thụ thể của thrombin ...................................................... 18 1.3.4. Nhóm ức chế phức hợp GPIIb/IIIa ....................................................... 19 1.3.5. Nhóm ức chế phosphodiesterase .......................................................... 19 1.4. Tổng quan về cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr ............ 19 1.4.1. Đặc điểm thực vật, thực trạng phân bố và công dụng .......................... 19 1.4.2. Các nghiên cứu trước đây về Canna warszewiczii A. Dietr ................ 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 22 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 22 2.1.1. Đối tượng .............................................................................................. 22 2.1.2. Thu thập mẫu máu ................................................................................ 23 2.1.3. Dụng cụ nghiên cứu.............................................................................. 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 24 2.2.1. Phương pháp pha các phân đoạn dịch chiết và hóa chất ...................... 24 2.2.2. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm .................................. 24 2.2.3. Phương pháp phân tích ngưng tập tiểu cầu .......................................... 24 2.2.4. Phân tích và xử lý số liệu ..................................................................... 27 2.2.5. Đạo đức nghiên cứu.............................................................................. 28 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 29 3.1. Kết quả ....................................................................................................... 29 3.1.1. Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) ....................................................... 29 3.1.2. Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA)......................................... 30 3.1.3. Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) ....................................................... 31 3.1.4. Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation – DEA) ............................ 33 3.1.5. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu ..................................................................... 33 3.2. Bàn luận ..................................................................................................... 35 3.2.1. Thiết kế nghiên cứu .............................................................................. 35 3.2.2. Kết quả nghiên cứu............................................................................... 35 3.2.3. Hạn chế của nghiên cứu ....................................................................... 40 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 41 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh lý về tim mạch hiện đang là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Phần lớn trong số đó có liên quan đến các cơn đau tim và đột quỵ. Đây là những triệu chứng cấp tính gây ra bởi sự tắc nghẽn lưu thông máu đến tim hoặc não bộ mà tác nhân chính là sự xuất hiện của huyết khối [32, 48]. Những nghiên cứu về sinh lý học đã chứng minh vai trò quan trọng của tiểu cầu trong hình thành cục máu đông. Nằm trong chuỗi các biến đổi xảy ra kể từ khi tiểu cầu được hoạt hóa, ngưng tập tiểu cầu, sự kết tập của các tiểu cầu tạo thành đám tiểu cầu, được xem là tiền đề để hình thành huyết khối. Để ngăn ngừa và điều trị các bệnh lý có liên quan đến huyết khối, nhiều thuốc kháng tiểu cầu đã được nghiên cứu và ra đời. Bên cạnh những lợi ích mang lại trong điều trị, các thuốc kháng tiểu cầu cũng gây ra nhiều tác dụng không mong muốn như làm tăng nguy cơ chảy máu hay loét dạ dày. Do đó, xu hướng nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng được quan tâm với mong muốn phát triển các thuốc kháng tiểu cầu có tác dụng tốt hơn và quan trọng là gây ít tác dụng không mong muốn hơn đối với người sử dụng. Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật vô cùng phong phú. Hơn nữa, kinh nghiệm sử dụng cây cỏ làm thuốc chữa bệnh của người dân cũng rất dồi dào. Điều này giúp cho Việt Nam có một nguồn tài nguyên cây thuốc quý giá. Theo kinh nghiệm dân gian của một số địa phương, cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr đã được sử dụng để điều trị một số triệu chứng trong bệnh lý tim mạch như đau thắt ngực, cơn đau tim [6, 35]. Theo đó, một vài nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết của Canna warszewiczii A. Dietr. Tổng hợp kết quả các nghiên cứu cho thấy các phân đoạn dịch chiết ethyl acetate, dichloromethane, n-hexan đều có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi các chất kích tập ADP, collagen, ristocetin [13, 31]. Do đó, đề tài “Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP của phân đoạn dịch chiết cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr” được thực hiện với mục tiêu: 1 Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu của phân đoạn dịch chiết cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr với chất kích tập ADP và chất ức chế nhóm thụ thể P2 là PPADS. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Sinh lý học tiểu cầu Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, hình đĩa, không có nhân, đường kính trung bình 2 đến 5 m, dày 0,5 m [2, 20]. Số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi ở người khỏe mạnh khoảng 150 – 400 x 109/L [5, 47]. Trong quá trình tạo máu, tiểu cầu được tách ra từ mẫu tiểu cầu trong tủy xương, mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo ra 3000 tiểu cầu [5, 7]. Đời sống của tiểu cầu ngắn, trung bình khoảng 10 ngày, bị tiêu hủy bởi đại thực bào ở gan và lách [2, 47]. 1.1.1. Cấu trúc tiểu cầu Cấu trúc tiểu cầu được chia thành 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel, khu bào quan và khu màng. Hình 1.1. Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo [51]  Khu ngoại vi 3 Khu ngoại vi gồm lớp áo ngoài glycocalyx, màng bào tương và vùng dưới màng. Glycocalyx được cấu thành từ rất nhiều loại glycoprotein (GP). Các GP này hoạt động như các receptor bề mặt, có vai trò vô cùng quan trọng trong sự bám dính, hoạt hóa và ngưng tập tiểu cầu [20, 51]. Bảng 1.1. Đặc điểm của một số GP chính [51] Glycoprotein Cấu trúc Chất liên kết GPIIb/IIIa Integrin αIIbβ3 Fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin và thrombospondin GPIa/IIa Integrin α2β1 Collagen GPIb/IX/V GPVI Thụ thể nhiều đoạn acid vWF amin giàu leucine lặp lại Thụ thể thuộc siêu họ Collagen globulin miễn dịch Màng bào tương là màng lipid kép với thành phần chính là các phospholipid như phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine (PS) cùng với một lượng đáng kể sphingolipid, sphingomyelin và cholesterol. Các phospholipid này phân bố không đều. PC cấu trúc nên lớp ngoài; ngược lại, PE và PS cấu trúc nên lớp trong của màng. Sự phân bố này được kiểm soát bởi các enzyme phụ thuộc ATP là flipase và flopase [47]. Nằm ngay dưới màng bào tương, vùng dưới màng là nơi vùng nội bào của các thụ thể xuyên màng tương tác với các protein phụ trách quá trình truyền tin trong tiểu cầu. Vùng dưới màng còn có một cấu trúc đặc biệt dính vào màng bào tương giúp ổn định hình dạng bình thường của tiểu cầu, gọi là hệ khung màng spectrin. Hệ thống này là một chuỗi polymer xoắn được tạo ra bởi từ các tiểu đơn vị α và  của spectrin. Cấu trúc này tồn tại những vị trí gắn với các protein giúp liên kết hệ thống màng spectrin với hệ thống các vi sợi, tạo nên một mạng lưới liên tục [47]. 4  Khu sol – gel Thành phần chính của khu sol – gel là hệ thống vi ống và hệ thống vi sợi. Hai hệ thống này cùng với hệ thống màng spectrin cấu thành hệ khung nâng đỡ tiểu cầu. Hệ thống vi ống nằm ngay dưới hệ thống màng spectrin, là tập hợp của 3 – 24 vi ống, bao quanh chu vi tiểu cầu, nằm trên mặt phẳng xích đạo của tiểu cầu. Mỗi vi ống được tạo nên từ các chuỗi polymer của heterodimer tubulin, hình thành những ống rỗng, cứng, đường kính mỗi ống khoảng 25 nm. Chức năng của hệ thống vi ống là duy trì kích thước, hình dạng bình thường của tiểu cầu và tham gia vào hiện tượng co rút khi tiểu cầu bị kích thích [5, 47]. Các vi sợi là các chuỗi polymer được hình thành từ các monomer actin (Gactin). Đây là những sợi mỏng, dẻo, có ái lực với ATP khác nhau ở mỗi đầu. 98% đầu có ái lực cao với ATP gắn với các protein CapZ và adducin, trong khi phần lớn đầu có ái lực thấp với ATP gắn với phức hợp Arp2/3. Trong khi CapZ ức chế phản ứng trùng ngưng, Arp2/3 có thể kéo dài sợi acin và bảo vệ sợi khỏi sự khử trùng ngưng (depolymerization). Hệ thống vi sợi được hình thành chủ yếu nhờ filamin và α-actinin. Filamin là protein có hình dạng giống chữ V, đầu chụm vào tương tác với phần nội bào của GPIb và các -integrin, hai đầu còn lại gắn với hai sợi actin. α-actinin giữ các vi sợi gần nhau hơn [47]. Hệ thống vi sợi trong tế bào chất, giữ các bào quan cách xa nhau và tham gia tạo chân giả của tiểu cầu [5, 20]. Khi bị kích thích, hệ thống vi sợi trong tế bào chất làm co hệ thống vi ống lại, đẩy các hạt α và các hạt đặc vào trung tâm tiểu cầu. Các hạt này giải phóng các chất ra bên ngoài qua hệ thống các kênh mở. Ngoài ra, khu sol – gel còn bao gồm một lượng lớn glycogen và một vài túi trơn hoặc được bọc clathrin [20].  Khu bào quan Khu bào quan chứa hệ thống các hạt đặc hiệu và các thành phần tế bào như lysosome, ty thể, bộ máy Golgi… Các bào quan này thực hiện các quá trình chuyển hóa của tiểu cầu, dự trữ enzyme và một lượng lớn cơ chất cần thiết cho hoạt động của tiểu cầu [51]. 5 Hệ thống hạt đặc hiệu được chia thành 3 nhóm: hạt α, hạt đặc và túi lysosome [7]. Có mặt ít nhất trong tiểu cầu là túi lysosome (< 3 hạt/tiểu cầu). Thành phần trong túi lysosome là các enzyme phân giải protein (cathepsins, elastase, collagenase, carboxypeptidase); enzyme phân giải carbohydrate (glucosidase, galactosidase, mannosidase) và enzyme cắt cầu ester (acid phosphatase). Mỗi tiểu cầu có thể chứa 3 đến 8 hạt đặc với kích thước khoảng 150 nm. Hạt đặc chứa một lượng lớn các nucleotide (ADP, ATP, UTP, GTP); cation (Ca++, Mg++, K+); các amin (serotonin, histamine) và pyrophosphate. Các chất này tham gia vào quá trình cầm máu và quá trình đáp ứng viêm. Trong các loại hạt, hạt α có số lượng nhiều nhất với 50 đến 80 hạt/tiểu cầu, kích thước lớn nhất từ 200 đến 500 nm và cũng đa dạng nhất về thành phần chứa trong hạt. Thành phần của hạt α được trình bày ở Bảng 1.2. Bảng 1.2. Thành phần của hạt α [20] Nhóm chất Thành phần Protein kết hợp màng αIIbβ3, GPIb/IX/V, GPVI, P-selectin Chất tham gia quá trình đông máu Yếu tố V, IX, XIII, antithrombin, protein S, plasminogen, α2-macroglobulin Protein dính Fibrinogen, vWF, thrombospondin Hóa chất CXCL1, CXCL4, CXCL5, CXCL8, CCL2 Yếu tố tăng trưởng Yếu tố tăng trưởng biểu bì, yếu tố tăng trưởng tế bào gan Chất ức chế Angiostatin, endostatin Chất điều hòa miễn dịch Complement C4 precursor, IgG Protein vi sinh Thymosin-β4, thrombocidins1 và 2  Khu màng 6 Khu màng chứa hệ thống các ống dày đặc và hệ thống các kênh mở. Hệ thống các ống dày đặc là khối vật chất không định hình, dày đặc điện tử, là nơi dự trữ Ca++, tổng hợp prostaglandin và chứa nhiều enzyme cyclooxygenase tham gia vào con đường chuyển hóa prostaglandin [5, 51]. Hệ thống các kênh mở là các ống mở vào trong tiểu cầu như các không bào làm tăng diện tích bề mặt tiểu cầu. Các hạt tiểu cầu giải phóng các chất cũng như các chất ngoại bào có thể thâm nhập vào tổ chức bên trong tiểu cầu qua hệ thống kênh này (như sự hấp thu fibrinogen vào hạt α) [5, 43, 47]. 1.1.2. Chức năng tiểu cầu Ở điều kiện sinh lý bình thường, tiểu cầu lưu hành trong máu ở trạng thái nghỉ. Khi xuất hiện tổn thương ở thành mạch, tiểu cầu lập tức bị thu hút và trải qua một loạt các sự kiện diễn biến liên tục. Nhìn chung, quá trình này gồm các bước quan trọng là bám dính, hoạt hóa, chế tiết và ngưng tập. 1.1.2.1. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu  Giai đoạn bám dính ban đầu Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị phã vỡ, một số protein ở tổ chức dưới nội mô được bộc lộ và tương tác với tiểu cầu, bao gồm: yếu tố von Willebrand (vWF), collagen, fibronectin, laminin và thrombospodin-1 [7, 40]. Trong đó, collagen và vWF có vai trò quan trọng nhất. vWF bám vào collagen, dãn thẳng và bộc lộ nhiều vị trí liên kết (vùng A1) với phức hợp glycoprotein (GP) Ib/IX/V trên màng tiểu cầu. Dưới tốc độ dòng máu cao, sự bám dính của tiểu cầu phụ thuộc chủ yếu vào liên kết giữa GPIb và vWF. Liên kết này được hình thành nhanh và chịu áp lực đẩy của dòng máu nhưng tồn tại không lâu. Tuy nhiên, nó lại quan trọng do giúp tiểu cầu “lăn” gần về bề mặt bám dính, tạo điều kiện để collagen liên kết với GPVI và tương tác này lại hoạt hóa GPIa/IIa gắn với collagen [1, 32, 40]. 7 Hình 1.2. Giai đoạn bám dính [40] Sự phối hợp giữa những tín hiệu sinh ra bởi các tương tác vWF – GPIb, collagen – GPVI, collagen – GPIa/IIa thúc đẩy một chuỗi các biến đổi phức tạp bên trong tiểu cầu dẫn đến hoạt hóa phospholipase Cγ (PLCγ) và tạo ra inositol (1,4,5) trisphosphate (IP3) từ sự thủy phân màng phospholipid. IP3 gắn với thụ thể của nó trên hệ thống các ống dày đặc để huy động Ca++ từ kho dự trữ này. Nồng độ Ca++ nội bào tăng kích hoạt một loạt các biến đổi quan trọng của tiểu cầu có ý nghĩa trong giai đoạn ngưng tập sau đó như thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành hình cầu gai, hoạt hóa GPIIb/IIIa, giải phóng chất từ các hạt và tổng hợp TXA2. 8 GPIIb/IIIa được hoạt hóa, liên kết với vùng C1 của vWF đảm bảo tiểu cầu bám dính chặt vào vị trí tổn thương của thành mạch [40].  Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu Hình 1.3. Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu [40] Ngưng tập tiểu cầu (NTTC) là hiện tượng các tiểu cầu liên kết với nhau để tạo thành nút tiểu cầu và là giai đoạn tiếp theo của quá trình cầm máu ban đầu. Nồng độ Ca++ nội bào tăng cao, kích hoạt tiểu cầu biến đổi từ hình đĩa thành hình cầu gai. Đây được cho tín hiệu đầu tiên của sự NTTC [44]. GPIIb/IIIa bộc lộ trên bề mặt tiểu cầu và được hoạt hóa từ trạng thái có ái lực thấp thành trạng thái có ái lực cao, liên kết được với các protein hòa tan trong huyết tương như vWF, fibronectin, fibrinogen [32]. Đồng thời, sự giải phóng chất từ hệ thống các hạt đặc hiệu thông qua hệ thống các kênh mở cũng diễn ra. Các chất chủ vận được giải phóng hay hình thành trong quá trình bám dính như ADP, thrombin, TXA 2 gắn với thụ thể của chúng trên màng tiểu cầu, hoạt hóa tiểu cầu theo những cơ chế 9 khác nhau. Các tiểu cầu này cũng trải qua một loạt biến đổi như thay đổi hình dạng, giải phóng chất từ các hạt và ngưng tập với nhau thông qua liên kết GPIIb/IIIa – fibrinogen – GPIIb/IIIa, GPIIb/IIIa – vWF, GPIb – vWF. Cứ như vậy, quá trình hoạt hóa và ngưng tập diễn ra làm bền nút tiểu cầu và chuẩn bị cho giai đoạn tạo cục máu đông [40]. 1.1.2.2. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương Quá trình đông máu là một chuỗi phản ứng hoạt hóa các yếu tố đông máu hay còn gọi là dòng thác đông máu và kết quả cuối cùng là hình thành cục máu đông từ mạng lưới fibrin. Trong đó, có hai con đường khởi động quá trình đông máu. Con đường đông máu ngoại sinh xảy ra khi máu tiếp xúc với mô tổn thương, trong khi con đường đông máu nội sinh xảy ra khi máu tiếp xúc với bề mặt lạ [2]. Tiểu cầu có vai trò quan trọng trong cả hai con đường này. Màng tiểu cầu có chứa các phospholipid tích điện âm, phosphatidylserine (PS) và phosphatidylethanolamin (PE). Các aminophospholipid này chỉ được bộ lộ ra khi hoạt hóa tiểu cầu. Nhờ đó, các yếu tố đông máu gắn có hồi phục với màng tiểu cầu. Phức hợp TF-VIIa có thể hoạt hóa yếu tố IX và X một cách hiệu quả. Yếu tố XII tự động hoạt hóa trên bề mặt tích điện âm, khởi động con đường đông máu nội sinh theo nguyên lý khuếch tán diễn tiến cùng với prekallikrein và kinninogen trọng lượng phân tử cao [7, 45]. Tiểu cầu hoạt hóa còn giải phóng hàng loạt chất tham gia quá trình đông máu như yếu tố V, IX, XIII, fibrinogen. 1.2. Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa bởi ADP ADP là phân tử trọng lượng thấp gây NTTC được biết đến đầu tiên. Tuy là một chất chủ vận yếu, ADP đóng vai trò quan trọng trong chức năng tiểu cầu bởi vì khi được tiết ra từ hạt đặc, nó khuếch đại đáp ứng của tiểu cầu với các chất chủ vận khác [34]. Trong huyết tương giàu tiểu cầu đã chống đông bằng citrate, ADP gây NTTC thông qua tương tác các thụ thể purinergic của nó. 1.2.1. Thụ thể purinergic 10 Khái niệm về thụ thể purinergic lần đầu được mô tả bởi Burnstock vào năm 1972 để chỉ những thụ thể của các nucleotide trên màng tế bào. Ban đầu, các thụ thể purinergic được phân loại dựa trên ái lực của các chất chủ vận. Tuy nhiên, hệ thống sắp xếp đã được thay đổi dựa trên không chỉ những thông tin dược lý mà còn cả những thông tin hóa sinh [38]. Theo đó, các thụ thể được phân loại thành hai nhóm lớn: P1, các thụ thể được hoạt hóa bởi adenosine và P2, các thụ thể được hoạt hóa bởi purine và pyrimidine nucleotide (ATP, ADP, UTP và UDP) [41]. Nhóm P1 là các thụ thể bắt cặp protein G, bao gồm bốn thụ thể A1, A2A, A2B và A3. Các thụ thể A1 và A3 bắt cặp với protein Gi/o, ức chế adenylyl cyclase (AC), trong khi thụ thể A2A và A2B bắt cặp với protein Gs, hoạt hóa AC, dẫn đến sự tổng hợp cAMP. Ngoài ra, thụ thể A2B cũng bắt cặp với protein Gq, chịu trách nhiệm cho sự hoạt hóa phospholipase C và huy động Ca++ [29, 33]. Dựa vào cấu trúc phân tử, nhóm thụ thể P2 tiếp tục được chia thành hai phân nhóm: P2X, các kênh ion hoạt hóa bởi phối tử và P2Y, các thụ thể bắt cặp với protein G. Hầu hết các thụ thể P2Y đều có cơ chế truyền tín hiệu chung là hoạt hóa phospholipase C (PLC) và/hoặc kiểm soát hoạt động của AC. Các thụ thể P2X là các kênh ion điều hòa sự vận chuyển Na+, K+ và Ca++ dẫn đến sự khử cực tế bào và hoạt hóa các enzyme nội bào [9]. Bốn thụ thể purinergic xuất hiện trên màng tiểu cầu là P2X1, P2Y1, P2Y12 và A2A. P2X1 được hoạt hóa bởi ATP, trong khi P2Y1 và P2Y12 là hai thụ thể của ADP [33]. P2Y1 là thụ thể được tìm ra trước và mỗi tiểu cầu chỉ có khoảng 150 thụ thể này. P2Y1 là thụ thể bắt cặp với protein Gq. Hoạt hóa thụ thể này bởi ADP dẫn đến kết quả là nồng độ Ca++ nội bào tăng cao. Do đó, P2Y1 điều khiển quá trình thay đổi hình dạng của tiểu cầu và khởi động quá trình ngưng tập [9, 17, 27]. P2Y12 là thụ thể có vai trò trung tâm trong ngưng tập tiểu cầu do ADP và là đích tác dụng của nhiều thuốc kháng tiểu cầu. P2Y12 bắt cặp với protein Gi, khuếch đại và ổn định ngưng tập thông qua tác dụng ức chế AC và tham gia quá trình giải phóng chất từ hạt. Sự phối hợp của hai thụ thể này là cần thiết để quá trình NTTC do ADP diễn ra trọn vẹn [9, 27, 42]. 11