Tài liệu Bước đầu ứng dụng kỹ thuật pcr reverse dot blot nhằm phát hiện đồng thời một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên mẫu thit heo tươi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT NHẰM PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU THỊT HEO TƯƠI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS. CAO BẢO HIỀN SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH MSSV: 1153010315 Khóa: 2011 – 2015 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT NHẰM PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU THỊT HEO TƯƠI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS. CAO BẢO HIỀN SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH GVHD ký xác nhận: MSSV: 1153010315 Khóa: 2011 – 2015 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh Học trường Đại học Mở TP.HCM trong những năm vừa qua đã tận tình dạy bảo em, truyền đạt những kiến thức quý báu để làm hành trang cho em bước vào đời. Em kính gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy đã tận tình cố vấn, truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn bổ ích. Em chân thành cảm ơn Thầy Lao Đức Thuận đã tạo điều kiện cho em được thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, trường Đại Học Mở TP.HCM. Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô Trương Kim Phượng, người đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình em học tập và thực hiện khóa luận tại trường. Em chân thành cảm ơn Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á đã tạo điều kiện cho em học tập kỹ thuật, hỗ trợ bộ hóa chất thí nghiệm giúp em hoàn thành tốt chuyên đề khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cao Bảo Hiền đã tận tình hỗ trợ, chuyển giao kỹ thuật, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp của em. Đặc biệt, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc của mình đến ba mẹ, người thân đã ủng hộ, động viên em rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Sinh viên DƯƠNG NGỌC HUỲNH SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH i KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADH Arginine dehydrolase AMC Acetyl methyl carbinol AMP Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat AP Alkaline phosphatase BLAST Basic local alignment search tool Bp base pair cAMP Cyclic Andenosine monophosphate CONS Coagulase Negative Staphylococcus CFU Colony-forming unit CS cộng sự dATP deoxyadenosine triphosphate dCTP deoxycytidine triphosphate dGTP deoxyguanosine triphosphate DNA deoxyribonucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate dTTP deoxythymidine triphosphate dUTP deoxyuridine triphosphate IDT Integrated DNA technologies gtt giải trình tự LDC Lysine decarboxylase MR Methyl Red NBT/BCIP Nitrobluetetrazdium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction pH Potential Hydrogen RDB Reverse Dot Blot rDNA ribosomal Deoxyribonucleic Acid SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH ii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 RNA Ribonucleic acid rRNA ribosomal Ribonucleic Acid S Semi-conserved SDS Sodium dodecyl sulfate SEs Staphylococcal enterotoxins SNP Single nucleotide polymorphism SSC Saline sodium citrate T3SS type III secretion systerm Ta annealing temperature TDH Thermostable direct hemolysin TE Tris - EDTA TLH Thermolabile hemolysin TLTK Tài liệu tham khảo Tm melting temperature TRH Thermostable – related hemolysin TSI Triple Sugar Iron VP Voges Proskauer SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH iii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng I.1. Đặc điểm của các vùng siêu biến động V1 – V9 ....................................... 9 Bảng II.1. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 16S-F, 16S-R .......................... 27 Bảng II.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 16S-F, 16S-R .................. 28 Bảng III.1. Các vùng gen mục tiêu trong các nghiên cứu phát hiện vi khuẩn gây bệnh đường ruột ............................................................................................................. 34 Bảng III.2. Kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng nhằm phát hiện vi khuẩn gây bệnh đường ruột .................................................................................................... 35 Bảng III.3. Các trình tự gen được sử dụng trong nghiên cứu .................................. 36 Bảng III.4. Bảng thông tin bộ mồi phổ quát của trình tự gen 16S rRNA và gen 23S rRNA ..................................................................................................................... 37 Bảng III.5. Bảng thông tin bộ mẫu dò đặc hiệu của một số loài vi khuẩn .............. 37 Bảng III.6. Bảng thông số vật lí của bộ mồi 16S-F, 16S-R và 23S-F, 23S-R .......... 39 Bảng III.7. Kết quả phân tích mức độ tương đồng của cặp mồi 16S-F, 16S-R bằng công cụ BLAST ..................................................................................................... 42 Bảng III.8. Kết quả phân tích mức độ tương đồng của cặp mồi 23S-F, 23S-R bằng công cụ BLAST ..................................................................................................... 45 Bảng III.9. Bảng chỉ số OD của các mẫu DNA vi khuẩn tách chiết từ mẫu thịt heo 58 Bảng III.10. Mức độ nhiễm đồng thời các vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên mẫu thịt heo tươi ................................................................................................................. 65 Bảng III.11. Bảng kết quả số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào CFU/ml ............... 67 Bảng III.12. Bảng số liệu về lượng DNA thực tế và mật độ tế bào vi khuẩn trong mẫu thịt heo .................................................................................................................. 67 SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH iv KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình I.1. Nguyên tắc phương pháp PCR ................................................................ 15 Hình I.2. Nguyên tắc phản ứng lai RDB ................................................................ 19 Hình III.1. Kết quả BLAST trình tự mồi 16S-F ..................................................... 41 Hình III.2. Kết quả BLAST trình tự mồi 16S-R ..................................................... 41 Hình III.3. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 16S-F và trình tự 16S rDNA bằng công cụ Bioedit ................................................................................... 42 Hình III.4. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 16S-R và trình tự 16S rDNA bằng công cụ Bioedit ................................................................................... 42 Hình III.5. Kết quả phân tích trình tự cặp mồi 16S-F, 16S-R bằng phần mềm Annhyb .............................................................................................................................. 43 .............................................................................................................................. 44 Hình III.6. Kết quả BLAST trình tự mồi 23S-F ..................................................... 44 .............................................................................................................................. 45 Hình III.7. Kết quả BLAST trình tự mồi 23S-R ..................................................... 45 Hình III.8. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 23S-F và trình tự 23S rDNA bằng công cụ Bioedit ................................................................................... 46 Hình III.9. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 23S-R và trình tự 23S rDNA bằng công cụ Bioedit ................................................................................... 46 Hình III.10. Kết quả phân tích trình tự cặp mồi 23S-F, 23S-R bằng phần mềm Annhyb .............................................................................................................................. 47 Hình III.11. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SAL ................................................ 48 Hình III.12. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAL bằng công cụ Annhyb .............................................................................................................................. 49 Hình III.13. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò VPA ............................................... 50 Hình III.14. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò VPA bằng công cụ Annhyb ................................................................................................................. 50 Hình III.15. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SAU ................................................ 51 SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH v KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Hình III.16. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAU bằng công cụ Annhyb .............................................................................................................................. 52 Hình III.17. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò CPE ................................................ 53 Hình III.18. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CPE bằng công cụ Annhyb .............................................................................................................................. 53 Hình III.19. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò CBO ............................................... 54 Hình III.20. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CBO bằng công cụ Annhyb ................................................................................................................. 55 Hình III.21. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SHI ................................................. 56 Hình III.22. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SHI bằng công cụ Annhyb .............................................................................................................................. 57 Hình III.23. Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu M1 và M2 với cặp mồi 16S-F, 16SR ........................................................................................................................... 59 Hình III.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu M3, M4 và M5 với cặp mồi 16S-F, 16S-R .................................................................................................................... 59 Hình III.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu M6 với cặp mồi 16S-F, 16S-R ... 60 Hình III.26 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M1 .................................. 61 Hình III.27. Kết quả BLAST trình tự gtt_M1F ...................................................... 62 Hình III.28 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M2 .................................. 62 Hình III.29 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M3 .................................. 63 Hình III.30 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M4 .................................. 64 Hình III.31 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M5 .................................. 64 Hình III.32 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M6 .................................. 65 SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH vi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. ii DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ẢNH...................................................................................... v MỤC LỤC............................................................................................................ vii ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 I. TỔNG QUAN................................................................................................... 3 I.1. Tổng quan về vi khuẩn gây bệnh đường ruột: .......................................... 4 I.1.1. Staphylococcus aureus ......................................................................... 4 I.1.2. Clostridium perfringens ....................................................................... 5 I.1.3. Clostridium botulinum ......................................................................... 5 I.1.4. Shigella spp. ........................................................................................ 6 I.1.5. Vibrio parahaemolyticus ...................................................................... 7 I.1.6. Salmonella spp..................................................................................... 8 I.2. Thông tin vùng gen 16S rRNA và 23S rRNA: ........................................... 9 I.2.1. Vùng gen 16S rRNA ............................................................................. 9 I.2.2. Vùng gen 23S rRNA ........................................................................... 10 I.3. Các phương pháp phát hiện tác nhân vi khuẩn: ..................................... 11 I.3.1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống ................................................... 11 I.3.2. Phương pháp sinh học phân tử hiện đại .............................................. 13 I.4. Các công trình nghiên cứu ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử để phát hiện nhanh, đồng thời vi khuẩn gây bệnh đường ruột: ..................... 201 II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 22 II.1. Vật liệu: ................................................................................................... 23 II.1.1. Các công cụ tin sinh học được sử dụng .............................................. 23 II.1.2. Mẫu thực phẩm trong khảo sát thực nghiệm ....................................... 23 II.2. Phương pháp nghiên cứu: ...................................................................... 23 II.2.1. Khảo sát dữ liệu ................................................................................. 23 SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH vii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 II.2.2. Khảo sát in silico ............................................................................... 24 II.2.3. Khảo sát thực nghiệm ........................................................................ 25 III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................... 33 III.1. Thu thập dữ liệu: ..................................................................................... 34 III.2. Kết quả khảo sát in silico......................................................................... 36 III.2.1. Thu thập trình tự gen 16S rRNA và 23S rRNA của các loài vi khuẩn .. 36 III.2.2. Thu thập và đánh giá hệ cặp mồi, mẫu dò .......................................... 36 III.2.3. Khảo sát bộ mồi phổ quát .................................................................. 38 III.2.4. Khảo sát bộ mẫu dò ........................................................................... 47 III.3. Kết quả thực nghiệm: .............................................................................. 57 III.3.1. Kết quả tách chiết DNA vi khuẩn và đo OD....................................... 58 III.3.2. Kết quả điện sản phẩm PCR............................................................... 59 III.3.3. Kết quả lai RDB ................................................................................ 60 III.3.4. Kết quả xác định mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu: ............... 66 IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 69 IV.1. Kết luận ................................................................................................... 70 IV.2. Đề nghị .................................................................................................... 70 V. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 72 VI. PHỤ LỤC..........................................................................................................79 SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH viii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột là nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh ngộ độc thực phẩm, tác động lớn đến sức khoẻ cộng đồng và có thể dẫn đến tử vong [29]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization, WHO), hàng năm ngộ độc thực phẩm dẫn đến khoảng 16,8 triệu trẻ em tử vong do mắc các bệnh về tiêu chảy [57]. Theo thống kê của Cục An toàn Thực phẩm (2012), ở Việt Nam có khoảng 168 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.541 trường hợp, trong đó 4.335 trường hợp nhập viện và 34 trường hợp tử vong [41]. Các tác nhân gây bệnh đường ruột thường lây truyền qua thực phẩm, nước giải khát. Đây là nguyên nhân chính dẫn đến ngộ độc thực phẩm, bệnh viêm dạ dày cấp tính và có thể gây ra những biến chứng nghiêm trọng. Cụ thể, Listeria monocytogens gây sảy thai hoặc viêm màng não ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch, Escherichia coli O157:H7 gây hội chứng tan ure huyết (hemolytic uremic syndrome),...[29]. Phương pháp nuôi cấy truyền thống thường được áp dụng để phát hiện vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm, đây là “tiêu chuẩn vàng” trong quy trình chẩn đoán thường quy ở bệnh viện [5]. Tuy nhiên, phương pháp truyền thống vẫn tồn tại nhiều hạn chế: tiêu tốn thời gian, khó phát hiện đồng thời nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh đường ruột [11,35]. Nhiều phương pháp phát hiện các tác nhân vi khuẩn dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử như Multiplex PCR, real-time PCR, Microarray,... đã được phát triển và áp dụng trong thực tế [11,35,40]. Đáng chú ý là phương pháp PCR kết hợp Reverse Dot Blot cho phép phát hiện nhanh, chính xác nhiều trình tự gen mục tiêu, với bộ mẫu dò chuyên biệt/đặc hiệu với các dạng đột biến/các tính đa hình hoặc trình tự gen của nhiều loài vi sinh vật (vi khuẩn) khác nhau [32]. Dựa vào các sơ sở khoa học nêu trên và được sự đồng ý của Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á, chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp “BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT NHẰM PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU THỊT HEO TƯƠI”. SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Mục tiêu: Tìm hiểu và ứng dụng quy trình PCR kết hợp lai Reverse Dot Blot nhằm phát hiện nhanh, chính xác và đồng thời một số tác nhân vi khuẩn gây bệnh đường ruột: Salmonella spp., Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Vibrio parahaemolitycus, Staphylococcus aureus, Shigella spp.,... trong các mẫu thịt heo được bày bán trên địa bàn Tỉnh Bình Dương. Nội dung nghiên cứu: - Thu thập thông tin về đặc điểm hiện diện của nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên các loại mẫu thực phẩm (thịt heo tươi). - Thu thập dữ liệu về các công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học phân tử PCR, PCR – RDB phát hiện nhanh và đồng thời các chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột, cụ thể là Salmonella spp., Shigella spp., Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Vibrio parahaemolitycus, Staphylococcus aureus. - Khảo sát tính chất vật lý, độ đặc hiệu của bộ mồi phổ quát (universal primers) và bộ mẫu dò chuyên biệt (kế thừa kết quả nghiên cứu cùng nhóm) với các loài vi khuẩn gây bệnh đường ruột (Salmonella spp., Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Vibrio parahaemolitycus, Shigella spp., Staphylococcus aureus,…). - Tìm hiểu quy trình PCR - RDB (bộ Kit RDB – VA.A92 – 0036A) của Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á. - Thực hiện quy trình tách chiết DNA vi khuẩn và quy trình PCR – RDB phát hiện đồng thời một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên một số mẫu thịt heo tươi được bày bán trên địa bàn Tỉnh Bình Dương. SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 I. TỔNG QUAN SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 I.1. Tổng quan về vi khuẩn gây bệnh đường ruột: I.1.1. Staphylococcus aureus Đặc điểm hình thái: Staphylococcus aureus (S. aureus) là vi khuẩn Gram dương (+), tế bào hình cầu, đường kính khoảng 1µm. Các tế bào S. aureus xếp thành chuỗi không đều nhau, đứng riêng lẻ, từng đôi hay thành chuỗi. Vi khuẩn S. aureus không có lông, không di động và không sinh bào tử [7]. Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi. Vi khuẩn S. aureus phát triển ở nhiệt độ 15oC – 40oC (nhiệt độ tối ưu là 35oC – 37oC), khoảng pH phát triển 4 – 9,3 (pH thích hợp 7 – 7,5) [4]. Vi khuẩn S. aureus là vi khuẩn sống được trong điều kiện tương đối khô, nóng, chịu được nồng độ muối cao (NaCl 10% – 15%) [7]. Đặc điểm sinh hóa: Staphylococcus aureus có các đặc điểm sinh hóa điển hình: lên men các nguồn carbohydrat khác nhau (lactose, sucrose, galactose, glucose), sinh các loại enzyme (urease, catalase, coagulase, hyaluronidase, Staphylokinase, proteinase, lipase) [30,7,34]. Yếu tố độc lực: Staphylococcus aureus sinh 2 nhóm độc tố: Nhóm ngoại độc tố với bản chất là protein: độc tố tróc vảy (Exfoliative toxin) là ngoại độc tố làm bong tróc biểu bì, tạo nốt phỏng ngoài da; độc tố gây sốc (Toxic shock syndrome toxin) [30,7]. Nhóm nội độc tố: S. aureus sản xuất nội độc tố bền nhiệt (Heat – stabe enterotoxins, SEs), nội độc tố gây nôn, chia thành các type huyết thanh khác nhau từ SEA đến SEE, trong đó có SEC được chia thành SEC1, SEC2, SEC3. Sau đó, các SE mới cùng các gen tương ứng được tìm thấy và đánh dấu từ SEG đến SER và SEU, không có SEF [25,8]. Thông tin bộ máy di truyền: Bộ gen của vi khuẩn Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus subsp. aureus MW2) có kích thước khoảng 2,82 Mb, tỉ lệ %GC khoảng 32,8%. Gen 16S SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 rRNA có kích thước khoảng 1.556 bp, gen 23S rRNA có kích thước khoảng 2.923 bp [50]. I.1.2. Clostridium perfringens Đặc điểm hình thái: Clostridium perfringens (C. perfringens) là trực khuẩn Gram dương (+), tế bào hình que, sinh bào tử chịu nhiệt, là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi [31,20]. Clostridium perfringens phát triển ở nhiệt độ thích hợp là 43oC – 45oC, pH thích hợp khoảng 5 – 9. Vi khuẩn C. perfringens là vi khuẩn ưa mặn, sinh trưởng được trong môi trường có nồng độ NaCl 4% - 6% [7]. Đặc điểm sinh hóa: C. perfringens có đặc điểm sinh hóa điển hình: lên men các nguồn carbohydrat (galactose, sucrose, fructose, maltose), không lên men đường mannitol, không sinh indol, phản ứng MR âm tính (-), VP âm tính (-), không sinh enzyme catalase [23]. Yếu tố độc lực: Vi khuẩn C. perfringens sản xuất cả ngoại độc tố và nội độc tố: độc tố ruột (Clostridium perfringens enterotoxin, CPE) và 4 ngoại độc tố chính: alpha (α), beta (β và β2), epsilon (ε) và iota (ι), được chia thành 5 type khác nhau C. perfringens (A, B, C, D và E) [7,25,20]. C. perfrigens type A sinh nội độc tố α là type chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm và viêm đường ruột ở người - gastroenteritis, C. perfrigens type C gây ngộ độc thực phẩm dẫn đến hoại tử ruột - enteritis necroticans [25,20]. Các nội độc tố của Clostridium perfrigens chỉ được hình thành trong quá trình tạo bào tử [25]. Thông tin bộ máy di truyền: Bộ gen của Clostridium perfringens (Clostridium perfringens ATCC 13124) có kích thước khoảng 3,26 Mb, tỉ lệ %GC khoảng 28,4%, vùng gen 16S rRNA có kích thước khoảng 1.522 bp và gen 23S rRNA khoảng 2.909 bp [55]. I.1.3. Clostridium botulinum Đặc điểm hình thái: Clostridium botulinum (C. botulinum) là vi khuẩn Gram dương (+), di động, tế bào hình que, sinh bào tử, là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc [4,7]. SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Vi khuẩn Clostridium botulinum phát triển ở nhiệt độ 35oC - 37oC, tăng trưởng trong môi trường pH lớn hơn 4 [7]. Đặc điểm sinh hóa: Đặc điểm sinh hóa điển hình của vi khuẩn Clostridium botulinum: lên men các nguồn carbohydrat khác nhau (galactose, lactose, maltose, glucose), sinh H2S, NH3, sinh enzyme lecithinase, lipase, không sinh indol [24]. Yếu tố độc lực: Vi khuẩn Clostridium botulinum sinh ba loại độc tố: botulinum neurotoxin (BoNT), C2 toxin và C3. Botulinum neurotoxin (BoNT) tác động đến các tế bào thần kinh, độc tố C2 và C3 gây tổn thương tế bào, tạo điều kiện cho độc tố BoNT lây lan vào mô. Các độc tố có bản chất là protein, nhạy với nhiệt, độc tố có thể bị phá hủy ở nhiệt độ lớn hơn 85oC trong 5 phút [7]. Dựa vào khả năng sinh độc tố, vi khuẩn Clostridium botulinum được phân loại thành các serotype A, B, C, D, E, F và G [7]. Thông tin bộ máy di truyền: Bộ gen của Clostridium botulinum (Clostridium botulinum A str. ATCC 3502) có kích thước khoảng 3,89 Mb, tỉ lệ %GC khoảng 28,2%, vùng gen 16S rRNA có kích thước khoảng 1.442 bp và gen 23S rRNA khoảng 2.902 bp [54]. I.1.4. Shigella spp. Đặc điểm hình thái: Shigella spp. hay còn gọi là trực khuẩn lỵ, là vi khuẩn Gram âm (-), không sinh bào tử, không di động, đây là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy nghi [4,7]. Shigella spp. phát triển ở nhiệt độ từ 7oC – 46oC, pH từ 6,5 – 8,8, thích hợp nhất ở nhiệt độ 37oC và pH 7 – 8 [7]. Đặc điểm sinh hóa: Shigella spp. có đặc điểm sinh hóa điển hình: lên men glucose nhưng không sinh hơi, hầu hết các loài không lên men đường lactose, không sinh enzyme khử nitrat, enzyme urease, enzyme citochrome oxidase, lysine decarboxylase, không sinh H2S, không có khả năng làm tan gelatin [4,7]. SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Yếu tố độc lực: Vi khuẩn Shigella spp. có 2 dạng độc tố: nội độc tố là lipopolysaccharide của vách tế bào vi khuẩn được phóng thích khi tế bào ly giải, góp phần kích thích thành ruột. Ngoại độc tố có tên là Shiga toxin, không bền nhiệt, hoạt động như một enterotoxin, tác động lên thành ruột gây tiêu chảy và tác động lên hệ thần kinh trung ương ở ruột, chặn các xung thần kinh, gây tê liệt. Ngoài ra, ngoại độc tố này còn hoạt động như cytotoxin, giết chết các tế bào bằng cách ức chế hấp thụ đường và các amino acid ở ruột non [7]. Thông tin bộ máy di truyền: Bộ gen của vi khuẩn Shigella spp. (Shigella dysenteriae Sd197) có kích thước khoảng 4,37 Mb, tỉ lệ %GC khoảng 51,2%. Gen 16S rRNA có kích thước khoảng 1.542 bp, gen 23S rRNA có kích thước khoảng 2.902 bp [52]. I.1.5. Vibrio parahaemolyticus Đặc điểm hình thái: Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) là vi khuẩn Gram âm (-), tế bào hình dấu phẩy, có lông ở một đầu, di động [1,7]. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, phát triển ở nhiệt độ trong khoảng 22oC – 42oC [9,4]. Khoảng pH phát triển 5 – 11 (thích hợp nhất là 7,8 – 8,6) [9]. Vi khuẩn ưa mặn, tăng trưởng tốt trong môi trường có nồng độ muối cao (NaCl 1% - 7%) nhưng bị ức chế khi nồng độ muối quá cao (NaCl 10%) [1,4,9]. Đặc điểm sinh hóa: Vi khuẩn V. parahaemolyticus có đặc điểm sinh hóa: sinh nhiều loại enzyme khác nhau (Oxidase, LDC), không sinh ADH, không lên men đường sucrose, sinh H2S trong môi trường TSI (Triple Sugar Iron) [4,7]. Yếu tố độc lực: Vibrio parahaemolyticus được phân loại dựa vào kháng nguyên thân (O) và kháng nguyên nang (K), gồm có O3:K6, O4:K12, O4:K68, O1:K41, O1:K25, O1:KUT [7]. SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Vi khuẩn V. parahaemolyticus sinh nội độc tố Hemolysin bền nhiệt (Thermostable direct hemolysin, TDH và Thermostable – related hemolysin, TRH), độc tố không bền nhiệt (Thermolabile hemolysin, TLH) [1,7]. Ngoài ra vi khuẩn V. parahaemolyticus còn sản xuất các yếu tố độc lực khác như type III secretion systerm, T3SS bao gồm 2 dạng độc tố: độc tố tế bào (cytotoxicity) và độc tố ruột (enterotoxicity) [16]. Thông tin bộ máy di truyền: Bộ gen của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Vibrio parahaemolyticus BB22OP) có kích thước khoảng 5,1 Mb, tỉ lệ %GC khoảng 45,3%, vùng gen 16S rRNA khoảng 1.475 bp và vùng gen 23S rRNA có kích thước khoảng 2.891 bp [53]. I.1.6. Salmonella spp. Đặc điểm hình thái: Salmonella spp. là vi khuẩn Gram âm (-), tế bào hình gậy, quan hệ gần gũi với họ Enterobacteriaceae, kích thước 0,5 x 3µm, có nhiều lông xung quanh thân, di động mạnh và không sinh bào tử [25,7]. Salmonella spp. là vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy nghi. Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ 6oC - 42oC, pH 6 - 9, nhiệt độ tối ưu nhất cho vi khuẩn phát triển là 35oC 37oC và pH thích hợp nhất là 7,2 [7]. Đặc điểm sinh hóa: Vi khuẩn Salmonella spp. có đặc điểm sinh hóa điển hình: sinh enzyme Oxidase, tryptophanase, sinh H2S, không sinh enzyme Urease, lên men đường glucose, không lên men lactose [25]. Yếu tố độc lực: Dựa trên kháng nguyên thân (O), kháng nguyên lông (H) và kháng nguyên bề mặt (Vi), Salmonella spp. được chia ra khoảng 2.463 type huyết thanh (serotypes). Ngoài ra giống Salmonella spp. được chia làm hai loài: S. Bongori và S. enterica. Trong đó S. bongori gồm tất cả các type huyết thanh (serotype) của loài phụ số V, và S. enterica được chia làm 6 loài phụ đánh số: I (enterica), II (salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diarizonae), IV (houtenae), VI (indica) [7]. SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 Salmonella sp. sinh hai loại độc tố: độc tố ruột (enterotoxicity) và độc tố tế bào (cytotoxicity) [7]. Thông tin bộ máy di truyền: Bộ gen của Salmonella spp. (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typehimurium str. LT2) có kích thước khoảng 4,59 Mb, trong đó tỉ lệ %GC khoảng 52,22%. Vùng gen 16S rRNA có kích thước khoảng 1.366 bp và vùng gen 23S rRNA có kích thước khoảng 2.904 bp [51]. Thông tin vùng gen 16S rRNA và 23S rRNA: I.2. I.2.1. Vùng gen 16S rRNA Vùng gen 16S ribosomal RNA (rRNA) có chiều dài khoảng 1.500 bp và có tính chất bảo tồn cao, hiện diện ở tất cả các loài vi khuẩn [13]. Trình tự vùng gen 16S rRNA được xem là một công cụ quan trọng cho việc phát hiện mối quan hệ phát sinh loài giữa các vi khuẩn, được xem là phân tử mục tiêu cho việc phát hiện và định danh vi khuẩn trong các thí nghiệm lâm sàng [26,30]. Trên vùng trình tự gen 16S rRNA có các vùng bất biến U (Universal) là các vùng có sự biến đổi rất ít giữa các loài (bảo tồn ở cấp độ loài) và các vùng siêu biến động V (Hypervariable regions) là những vùng có sự khác nhau giữa các loài, các chủng thuộc loài hoặc nhóm loài. Vùng siêu biến động gồm 9 vùng khác nhau (V1 V9), chứa các trình tự đặc hiệu cho loài, được sử dụng làm trình tự mục tiêu khuếch đại và thiết kế mẫu dò để phát hiện các loài vi khuẩn khác nhau [13]. Giữa hai vùng trên (vùng bảo tồn và vùng siêu biến động) là những vùng có biến đổi ít được gọi là vùng bán bảo tồn S (semiconserved). Bảng I.1. Đặc điểm của các vùng siêu biến động V1 – V9 [13] Vùng siêu biến động Đặc điểm (Hypervariable regions, V) Vùng V1 Sử dụng để phân biệt các tác nhân gây bệnh thuộc chi Streptococcus spp. và sự khác nhau giữa Staphylococcus aureus SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 9 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015 với các loài Staphylococcus không sinh enzyme coagulase (Coagulase Negative Staphylococcus, CONS). Có ít nhất 4 biến thể đơn đa hình độc nhất (unique single nucleotide polymorphisms, SNPs), vùng V1 có ý nghĩa trong thiết kế mẫu dò cho S. aureus. Kích thước trung bình 100 bp, dùng để phân biệt các loài vi khuẩn đến mức chi, phân biệt tác nhân gây bệnh thuộc Staphylococcal và Streptococcal, Clostridium, Haemophilus và Vùng V2 Neisseria, các loài thuộc Mycobacterial. Không phân biệt được Escherichia sp. và Shigella sp., K. pneumoniae và E. aerogenes. Vùng V2 có chứa nhiều biến thể đơn đa hình (single nucleotide polymorphisms, SNPs). Vùng V3 tương tự vùng V2 có thể phân biệt vi khuẩn ở mức chi, vùng trình tự ngắn trong V3 gồm số lượng lớn các SNPs. Được Vùng V3 sử dụng để xác định các loài Mycobacterium fortuitum, Nocardia spp., Propionibacterium acnes và Rhodococcus equi. Vùng V3 cũng giúp phân biệt vi khuẩn họ Enterobacteriacea: Enterobacter aerogene và Klebsiella pneumoniae. Là vùng siêu biến động ngắn nhất, dài khoảng 58 bp, có sự biến Vùng V6 động lớn và giúp phân biệt vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae: Escherichia spp., Shigella spp. và Salmonella spp. Vùng V4, V5, V7 và V8 Các vùng có mức độ bảo tồn cao hơn mức độ biến động, do đó không thích hợp là trình tự mục tiêu hỗ trợ cho việc định danh ở mức loài. I.2.2. Vùng gen 23S rRNA Vùng gen 23S rRNA có kích thước khoảng 2.900 bp với mức độ biến động ở mức độ loài cao hơn so với vùng gen 16S rRNA. Các nhà nghiên cứu dựa trên vùng bảo tồn và vùng biến động của trình tự gen 23S rRNA để thiết kế hệ mồi phổ quát SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 10