Tài liệu Biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã dehydration responsive element binding của đậu tương (gmdreb) để tăng khả năng chịu hạn ở cây chuyển gen

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐỖ THANH KIM HƯỜNG TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐỖ THANH KIM HƯỜNG TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG Ngành: Di truyền học Mã số: 8 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu. Tác giả luận văn Đỗ Thanh Kim Hường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS. Nguyễn Thị Hải Yến - Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi tiến hành các thí nghiệm trong đề tài luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục Sinh học; cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này. Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành bài luận văn này. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019 Tác giả luận văn Đỗ Thanh Kim Hường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn TÀI TRỢ Đề tài nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.012018.27" với tên đề tài là: “Biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã dehydration responsive element binding của đậu tương (GmDREB) để tăng khả năng chịu hạn ở cây chuyển gen” do GS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm. Tác giả luận văn Đỗ Thanh Kim Hường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN……………………………………………………… ii TÀI TRỢ…………………………………………………………… iii MỤC LỤC………………………………………………………… iv DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………… v DANH MỤC CÁC HÌNH………………………………………… vi DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT…………………………… vii MỞ ĐẦU…………………………………………………………... 1 1. Đặt vấn đề……………………………………………………… 1 2. Mục tiêu nghiên cứu…………………………………………… 2 3. Nội dung nghiên cứu…………………………………………… 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài……………………… 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………… 4 1.1. Đặc tính chống chịu của thực vật……………………………… 4 1.1.1. Tác động của các nhân tố phi sinh học đến thực vật………… 4 1.1.2. Cơ chế phân tử của đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi của thực vật………………………………………………………… 5 1.2. Họ nhân tố phiên mã AP2…………………………………… 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 1.2.1. Cây đậu tương……………………………………………… 6 1.2.2. Nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương………………… 8 1.3. Vector biểu hiện gen thực vật và đánh giá hoạt động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá mô hình……………………………… 12 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…. 16 2.1. Vật liệu nghiên cứu…………………………………………… 16 2.1.1. Vật liệu thực vật…………………………………………… 16 2.1.2. Các loại vector và chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu………………………………………………………………… 16 2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu…………………… 16 2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu……………………………… 16 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu………………………………………… 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………… 17 2.3.1. Nhóm phương pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide của gen GmDREB7………………………………………………… 18 2.3.1.1. Tách chiết RNA tổng số và nhân bản gen GmDREB7 từ cDNA………………………………………...…………………….. 18 2.3.1.2. Tách dòng gen GmDREB7………………………………… 19 2.3.1.3. Xác định trình tự nucleotide……………………………… 21 2.3.2. Nhóm phương pháp thiết kế gen GmDREB7, vector chuyển gen và tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 mang vector chuyển gen chứa gen GmDREB7………………………………… Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 21 2.3.3. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua A. tumefaciens... 22 2.3.4. Nhóm phương pháp phân tích, xử lý số liệu………………… 24 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN……... 25 3.1. Đặc điểm của gen GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương DT2008….......................................................................................... 25 3.1.1. Kết quả nhân bản, tách dòng và giải trình tự gen GmDREB7.......................................................................................... 25 3.1.2. Mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương DT2008 và các mẫu đậu tương mang mã số BT092314, BT089389, NM001249580, NM001248527, AY244760 trên GenBank……….. 31 3.2. Thiết kế gen và vector chuyển gen thực vật mang gen GmDREB7………………………………………………………… 33 3.2.1. Thiết kế gen GmDREB7 nhân tạo…………………………… 33 3.2.2. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB7.......................................................................................... 34 3.3. Chuyển gen và phân tích sự biểu hiện của gen GmDREB7 trên cây thuốc lá………………………………………………………… 36 3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens……………………………………… 36 3.3.2. Phân tích sự có mặt và sự biểu hiện ở mức phiên mã của gen chuyển GmDREB7 trên cây thuốc lá chuyển gen.............................. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN 39 http://lrc.tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................. ........................................... 41 1. Kết luận.......................................................................................... 41 2. Đề nghị........................................................................................... 41 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN....... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................... 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR………............ 19 Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn………........... 20 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB7 vào vector tách dòng pBT…………………………………………………………… 20 Bảng 2.4. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá…………….. 24 Bảng 3.1. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen GmDREB7 giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide mang mã số BT092314 trên GenBank…………………………… 28 Bảng 3.2. Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB7 giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide mang mã số BT092314 trên GenBank…………………..................... 30 Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB7 vào cây thuốc lá giống K326………………………………………….....…… Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN 38 http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Tran g Hình 1.1. Thông tin về trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank……………………………………………………………. 10 Hình 1.2. Đặc điểm trình tự amino acid suy diễn của trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank……………………………………. 11 Hình 1.3. Vị trí của gen GmDREB7 trên nhiễm sắc thể 12 của đậu tương.................................................................................................. ... 11 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121……………… 13 Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát………………………………. 18 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121_GmDREB7…… 22 Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế cặp mồi DREB7-F/DREB7-R...................... 25 Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn gen GmDREB7 từ cDNA của giống đậu tương DT2008………………… 26 Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ 4 dòng khuẩn lạc………………………………………………………. 27 Hình 3.4. Kết quả phân tích bằng BLAST trong NCBI…………….. 27 Hình 3.5. Sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương DT2008 so với trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank……………………… Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN 29 http://lrc.tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Hình 3.6. Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB7 của giống đậu tương DT2008 so với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự nucleotide mang mã số BT092314 trên GenBank………………….. 31 Hình 3.7. Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự nucleotide của đoạn mã hóa DREB phân lập từ giống đậu tương DT2008 và các trình tự mang mã số BT092314, BT089389, NM 001249580, NM 001248527, AY244760 trên GenBank……………………………… 32 Hình 3.8. Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự amino acid suy diễn của protein DREB từ giống đậu tương DT2008 và từ các trình tự mang mã số BT092314, BT089389, NM 001249580, NM 001248527, AY244760 trên GenBank…………............................…. Hình 3.9. Trình tự đoạn gen GmDREB7 nhân tạo………..……….. 33 34 Hình 3.10. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt gen GmDREB7 trong vector pUC18 và sản phẩm cắt vector pBI121 bằng cặp enzyme SacI và XbaI………………………………………………... 35 Hình 3.11. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121_GmDREB7 sử dụng cho chuyển gen vào thuốc lá nhờ A. tumefaciens………………………. 35 Hình 3.12. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc A. tumefaciens chủng CV58……………………………… Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN 36 http://lrc.tnu.edu.vn Hình 3.13. Hình mô tả quá trình biến nạp gen GmDREB7 và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật lây nhiễm A. tumefaciens........................................................................................... 37 Hình 3.14. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản gen GmDREB7 trong các cây thuốc lá chuyển gen.................................... 39 Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trong các cây thuốc lá chuyển gen....................................................................... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN 40 http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid (DNA bổ sung) DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GM Môi trường tái sinh chồi LB Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Lysogeny Broth) M Thang DNA chuẩn (Maker) MS Murashige – Skoog NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia) NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction RM Môi trường ra rễ RNA Ribonucleic Acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một trong những cây trồng chiếm vị trí quan trọng trong các cây nông nghiệp và trong đời sống của con người. Đậu tương được xem là cây trồng khá nhạy cảm với các tác động của môi trường. Trong những năm gần đây, biến đổi khí hậu và sự nóng lên của trái đất đã ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây đậu tương. Stress phi sinh học gây ảnh hưởng nghiêm trọng, đặc biệt là hạn và có thể làm giảm năng suất đậu tương khoảng 40%. Tính chống chịu các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh của thực vật nói chung và của đậu tương nói riêng do nhiều gen quy định, sản phẩm của các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện khả năng chống chịu hoặc có chức năng điều hòa nhóm gen chống chịu. Trình tự cis và nhân tố trans giữ vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng với tác động của các stress phi sinh học. Nhân tố trans - protein DREB có thể liên kết với trình tự cis để kích hoạt biểu hiện gen khi có tín hiệu stress ở thực vật. Protein DREB là một phân họ của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF, có chức năng điều khiển sự biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn hán, nhiễm mặn và nhiệt độ thấp, tạo ra tính chống chịu các stress của ngoại cảnh ở nhiều loài thực vật. Thuộc tính chủ yếu của gen DREB là vùng bảo thủ AP2 liên kết với các nhân tố phản ứng với các stress. Nhiều gen DREB đã được phân lập từ các loài thực vật khác nhau, như cây Arabidopsis, lúa (Oryza sativa L.), ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum aestivum) và nhiều cây trồng khác. Ở cây đậu tương, hai gen GmDREB6, GmDREB7 đã được xác định tồn tại trong hệ gen cây đậu tương, tuy nhiên đặc điểm về cấu trúc gen cũng như hoạt động của các gen này Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn như thế nào và sản phẩm protein của chúng có liên quan trực tiếp đến nhóm chống chịu nào hay không đang là vấn đề cần tìm lời giải đáp. Cách tiếp cận kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu chức năng của gen đang được ứng dụng ngày càng rộng rãi và nhiều gen mới trong hệ gen của cây đậu tương đã được giải mã chức năng. Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi đã chọn và tiến hành đề tài: “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương” để phục vụ chuyển gen với mục đích đánh giá hoạt động và chức năng sinh học của gen GmDREB7 ở cây đậu tương. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Phân tích được đặc điểm của gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương. 2.2. Thiết kế được vector biểu hiện thực vật mang gen GmDREB7 của cây đậu tương. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu thông tin, thiết kế cặp mồi PCR, nhân gen, tách dòng và xác định trình tự gen GmDREB7 từ cây đậu tương. 3.2. Nghiên cứu thiết kế gen và vector biểu hiện mang gen GmDREB7. 3.3. Chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào cây thuốc lá. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Về mặt khoa học Nghiên cứu góp phần làm rõ đặc điểm cấu trúc của gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (giống DT2008). Những kết quả về tạo cây chuyển gen thêm một lần nữa khẳng định cơ sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện tính chống chịu các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh của cây trồng. 4.2. Về mặt thực tiễn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Trình tự gen GmDREB7 phân lập được và các cây thuốc lá chuyển gen được tạo ra có khả năng chống chịu tốt hơn so với cây đối chứng. Qua đó, góp phần làm tiền đề cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chống chịu của cây trồng nói chung cũng như trong thực tiễn chọn giống cây trồng ở Việt Nam nói riêng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc tính chống chịu của thực vật 1.1.1. Tác động của các nhân tố phi sinh học đến thực vật Trong những thập kỷ gần đây, stress phi sinh học đã trở thành mối quan tâm chính trong sản xuất nông nghiệp. Sự tăng trưởng và phát triển của thực vật trong các điều kiện stress có thể ảnh hưởng đến vụ mùa. Thực vật có đặc điểm trạng thái sống đặc thù – bám trụ vào đất tại một chỗ, không di chuyển trong suốt quá trình phát triển cá thể. Vì vậy, chúng thường xuyên đối mặt với điều kiện ngoại cảnh ngày càng nhiều tác động bất lợi lên quá trình sinh trưởng phát triển, gây ra những biến đổi và đặc biệt ảnh hưởng đến năng suất cây trồng [2]. Ngày nay, do có sự biến đổi khí hậu toàn cầu nên môi trường ngày càng bị tác động nặng nề hơn. Các tác nhân gây stress sẽ tạo nên những khả năng thích ứng đặc trưng của thực vật. Do đó, việc tìm hiểu cơ chế tác động của các tác nhân gây stress cũng như những phản ứng thích nghi của cây trồng có vai trò quan trọng trong trồng trọt. Một số tác nhân gây stress có thể tác động riêng rẽ nhưng cũng có nhiều stress có thể phối hợp với nhau tác động lên cơ thể thực vật. Ví dụ stress thiếu nước thường liên kết với stress nhiễm mặn ở vùng rễ và stress nhiệt độ cao ở lá. Một số yếu tố môi trường từ tác nhân bình thường chuyển sang tác nhân stress chỉ trong vài phút (ví dụ nhiệt độ), có những yếu tố môi trường phải mất nhiều ngày hay nhiều tháng mới trở nên tác nhân stress (nước trong đất, chất khoáng...) [2]. Đối với cây trồng, nhiệt độ tối ưu để phát triển bình thường là 23 - 28°C. Nếu nhiệt độ trên 30°C thậm chí đến 35°C sẽ ảnh hưởng lớn đến cây. Trường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn hợp tương tự xảy ra nếu nhiệt độ xuống dưới 15°C, năng suất cây trồng sẽ giảm đáng kể. Một yếu tố khác đóng vai trò vô cùng quan trọng, đó là nước. Nước là nguyên liệu khởi đầu, sản phẩm trung gian và cũng là sản phẩm cuối cùng trong mọi quá trình trao đổi chất của tế bào. Mọi quá trình phản ứng trong cơ thể đều được thực hiện trong môi trường nước. Do đó, thiếu hay thừa nước đều ảnh hưởng xấu đến cây trồng. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã thống kê được thiệt hại hàng năm do hạn hán gây ra là rất lớn, có thể làm mất mùa, giảm đến trên 60% sản lượng [2]. 1.1.2. Cơ chế phân tử của đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi của thực vật Stress hạn, mặn và sốc nhiệt tác động xấu đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của nhóm cây trồng cạn. Trong các điều kiện stress, thực vật vẫn có những cơ chế để thích nghi đối với sự thay đổi cường độ khác nhau của stress, tuy nhiên những cơ chế này vẫn chưa đủ để giúp thực vật chống chịu. Thực vật có nhiều cơ chế phản ứng khác nhau với các stress thông qua các con đường truyền tin và phản ứng tế bào, từ việc thay đổi biểu hiện gen, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến mức độ sinh trưởng và năng suất cây trồng. Khi gặp các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, những biến đổi trong quá trình phát triển và trao đổi chất sẽ làm thay đổi sự biểu hiện của gen. Điều này bắt đầu từ việc nhận biết tín hiệu ở mức độ tế bào, lan truyền tín hiệu trong tế bào, sau đó lan truyền khắp cơ thể. Để chống chịu với stress, các phản ứng sinh hóa được kích hoạt trong cây trồng để tích lũy nhiều các loại chất dễ hòa tan như: đường, amino acid, glycine betaine và polyamine để giúp các cây trồng đối phó với stress [15] và giúp cây phục hồi sau một thời gian nhất định chịu tác động từ điều kiện môi trường [14]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn