Tài liệu Báo cáo thực tập-môi trường nb-vật liệu-phương pháp

  • Số trang: 23 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 180 |
  • Lượt tải: 1
quangtran

Đã đăng 3721 tài liệu

Mô tả:

PHẦN 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 20 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2. Vật liệu 2.1. 2.1.1. - Đối tượng Hạt cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) được mua ở Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu, quận 1, Tp. Hồ Chí Minh. Hình 2.1. Hạt đậu phộng (Arachis hypogaea L.) giống VD1 - Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được mua từ ngân hàng RIKEN-BRC thông qua dự án của MEXT, Nhật Bản. Vật liệu – Phương pháp 21 Hình 2.2. Khuẩn lạc của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 2.1.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường Murashige và Skoog (MS) (phụ lục1): Môi trường muối khoáng đa lượng và vi lượng MS, bổ sung saccharose dùng để nuôi cấy mô thực vật in vitro. - Môi trường Nutrient Broth (NB) (phụ lục1): Môi trường NB sử dụng để tăng sinh vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 - Các tác nhân cảm ứng: nhôm clorua, natri acetate, vi khuẩn - Tiền chất bổ sung: phenylalanine Vật liệu – Phương pháp 22 2.1.3. Hóa chất sử dụng 2.1.3.1. Hóa chất sử dụng trong thử hoạt tính kháng oxi hóa - Phương pháp Yen và Duh: Vitamine E (α -tocopherol), Potassium ferricyanide (K 3 (Fe(CN) 6 )), acid tricloroacetic, NaH 2 PO 4 . 2H 2 O, Na 2 HPO 4 .12H 2 O, FeCl 3 - Phương pháp DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 2.1.3.2. Hóa chất PCR (Polymerase chain reaction) - Các hóa chất: Dream Taq DNA polymerase, Dream Taq buffer (Fermentas), dNTPs 2mM (Fermentas), nước siêu sạch. - Mồi sử dụng: • Mồi khuếch đại gen rolB Gen rolB được khuếch đại với cặp mồi rolBF và rolBR. Sản phẩm khuếch đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 423 bp [22, 37]. Bảng 2.1. Đặc điểm của cặp mồi rolBF và rolBR Mồi Trình tự rolBF rolBR 5’-GCT CTT GAC GTG 5’-GAA GGT GCA AGC CTA GAT TT-3’ TAC CTC TC-3’ 20 20 6114,0 6102,0 53,0 55,3 Chiều dài (bp) Trọng lượng phân tử (g/mol) Nhiệt độ nóng chảy (G/C) • Mồi khuếch đại gen rolC Vật liệu – Phương pháp 23 Gen rolC được khuếch đại với cặp mồi rolCF và rolCR. Sản phẩm khuếch đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 626 bp [22, 37]. Bảng 2.2. Đặc điểm của cặp mồi rolCF và rolCR Mồi Trình tự Chiều dài (bp) Trọng lượng phân tử (g/mol) Nhiệt độ nóng chảy (G/C) 2.1.3.3. rolCF rolCR 5’-CTC CTG ACA 5’-TGC TTC GAG TTA TCA AAC TCG TC-3’ TGG GTA CA-3’ 20 20 5996,9 6163,0 52,9 53,3 Hóa chất tách chiết và điện di - Các dung môi hữu cơ: hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol. - Hóa chất tách chiết DNA: CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide), phenol, chloroform, nitơ lỏng, TE (Tris – EDTA), ethanol. - Hóa chất tách chiết plasmid: Dung dịch I gồm glucose 50 mM, Tris HCl 2,5 mM pH 8 và EDTA 10 mM pH 8. Dung dịch II gồm SDS 10% và NaOH 5N. Dung dịch III gồm KOAc 5M và glacial acetic 0.2M. - Hóa chất điện di: Agarose, dung dịch TAE (Tris-Acetate-EDTA), ethidium bromide, dung dịch nạp mẫu (glycerol, bromophenol blue, xyencyanol). Vật liệu – Phương pháp 24 2.1.4. Địa điểm thí nghiệm Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thực - vật và chuyển hóa sinh học và Phòng thí nghiệm sinh học phân tử B, Trường Đại học Khoa học Tư nhiên Tp. Hồ Chí Minh. 2.2. 2.2.1. - Phương pháp Tạo cây con in vitro Thao tác ngoài tủ cấy: Các hạt được tách vỏ, rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được rửa lại bằng nước cất cho sạch xà phòng. Erlen chứa hạt được đậy bằng giấy bạc và đưa vào tủ cấy vô trùng. - Thao tác trong tủ cấy vô trùng: Tiến hành lắc với cồn 70o trong khoảng 30 giây đến 1 phút. Tiếp đó, ngâm và lắc hạt trong dung dịch sodium hypochlorite (NaOCl) 1,5% trong 7 phút. Sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần. Các hạt được cấy lên môi trường MS có bổ sung saccharose (30 g/l) và agar (7,5 g/l). Sau 5 ngày thì hạt nãy mầm với điều kiện chiếu sáng 16 giờ trong ngày, cường độ ánh sáng 2500 lux, nhiệt độ 25 – 28oC. Vật liệu – Phương pháp 25 Hình 2.3. Cây đậu phộng in vitro 2.2.2. Cảm ứng tạo rễ tơ Vật liệu – Phương pháp 26 Hình 2.4. Quy trình tạo rễ tơ Rễ tơ được tạo ra thông qua sự chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được hoạt hóa trên môi trường lỏng NB lắc với vận tốc 100 - 130 vòng/phút trong 48 giờ ở 25oC vào tế bào thực vật. Vi khuẩn sau khi hoạt hóa được cấy vào môi trường NB để tăng sinh khối. Khi A. rhizogenes phát triển đến giữa pha tăng trưởng (mid-log phase) với OD 600 = 0,5 được dùng để gây nhiễm nhằm chuyển gen. Các mẫu (tử diệp, trụ thượng diệp, trụ hạ diệp, lá, cuống lá) được cắt và tạo vết thương được nhúng vào dịch khuẩn A. rhizogenes. Thời gian ngâm mẫu trong dịch khuẩn là 15 phút. Sau đó, các mẫu cấy được đặt lên giấy thấm vô trùng, để khô bề mặt và chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật để thực hiện quá trình đồng nuôi cấy. Quá trình đồng nuôi cấy được thực hiện trong tối. Sau thời kỳ đồng nuôi cấy, mẫu được rửa với môi trường MS lỏng có bổ sung cefotaxime (250 mg/l) để loại vi khuẩn trên bề mặt mẫu. Sau khi rửa, mẫu được chuyển vào nuôi cấy trên môi trường MS rắn bổ sung cefotaxime (250 mg/l) để loại bỏ vi khuẩn và cảm ứng tạo rễ tơ. Sau 2-3 tuần nuôi cấy, rễ tơ được tao thành từ vết thương. [28, 61] 2.2.3. Phương pháp PCR và điện di 2.2.3.1. Phương pháp PCR Nguyên tắc của phương pháp: Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự Vật liệu – Phương pháp 27 đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gọi là mồi xuôi và mồi ngược.[2] 2.2.3.2. Điện di Nguyên tắc của phương pháp: Phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu rúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử trong gel phụ thuộc vào hai chỉ tiêu: khối lượng phân tử nucleotide hay cặp nucleotide và nồng độ các chất cấu thành gel.[2] Mục tiêu của điện di: Phân tích và kiểm tra kích thước của sản phẩm khuếch đại PCR. 2.2.4. Phương pháp tách chiết hợp chất 2.2.4.1. Điều chế các loại cao Mỗi loài cây đều chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến loại rất phân cực, vì thế dung môi được sử dụng điều chế cao có độ phân cực tăng dần [5]. Xử lý nguyên liệu: Rễ tơ sau 25 ngày nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc được rửa sạch môi trường nuôi cấy, ghi nhận trọng lượng tươi. Quy trình điều chế cao xử dụng máy Soxhlet: Rễ tơ tươi Sấy khô ở 40oC tới khối lượng không đổi Xay nhuyễn Bột khô Vật liệu – Phương pháp Tận trích với các dung môi khác nhau trong dụng cụ Soxhlet Cô cạn dung môi ở 40oC 28 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ điều chế cao Các loại cao thu nhận được được dùng để khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa và định tính stilbene. 2.2.4.2. Phương pháp tách chiết rễ tươi và dung dịch môi trường nuôi cấy. Sinh khối rễ tơ tươi: mẫu được ngâm đông lạnh trong nitơ lỏng, rồi nghiền giã cho thật mịn trước khi được ngâm trong dung môi methanol trong 30 phút trước khi lọc, dịch lọc đem xác định hàm lượng hợp chất.[5] Dung dịch môi trường nuôi cấy rễ tơ: hòa dung môi ethyl acetate vào dịch môi trường, hỗn hợp dung môi và dịch môi trường được trộn đều trong 30 phút, sau đó hổn hợp được lắng, thu lấy phân đoạn ethyl acetate để xác định hàm lượng. 2.2.5. Xác định hoạt tính kháng oxi hóa 2.2.5.1. Phương pháp thử năng lực khử (Phương pháp Yen và Duh) Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa khử. Do đó, năng lực khử cũng biểu hiện khả năng kháng oxy hóa của một chất. Trong phương pháp của Yen và Duh (1993) [59], chất khử sẽ khử potassium ferricyanide (K 3 (Fe(CN) 6 )) thành potassium ferrocyanide (K 4 (Fe(CN) 6 )), hay nói cách khác ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanide bị Vật liệu – Phương pháp 29 khử thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanide. Phương trình ph ản ứng như sau: hay X + K 3 (Fe(CN) 6 ) K 4 (Fe(CN) 6 ) X + (Fe(CN) 6 )3- (Fe(CN) 6 ) 4- Sau đó bổ sung Fe3+ phản ứng với ion ferrocyanide tạo thành một phức hợp ferric ferrocyanide màu xanh (Prussian Blue) có công thức Fe 4 (Fe(CN) 6 ) 3 . Cường độ màu tỉ lệ với hàm lượng ion ferrocyanide, tức là tỉ lệ với khả năng khử của hợp chất thử nghiệm. 4Fe3+ + 3(Fe(CN) 6 )4- Fe 4 (Fe(CN) 6 ) 3 Màu xanh 2.2.5.2. Phương pháp bắt gốc tự do sử dụng DPPH DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (hình 2.5 ) được đặc trưng bởi gốc tự do ổn định. Gốc tự do này bền do được an định bởi các hiệu ứng điện tử và hiệu ứng lập thể nội phân tử tạo ra, do đó các phân tử này không thể kết hợp tạo thành nhị phân tử. DPPH có màu tím đặc trưng. Đỉnh hấp thu của dung dịch DPPH trong dung môi methanol là 515 - 517 nm. Khi DPPH phản ứng với hợp chất có thể cho phân tử hydrogen, thì màu tímđ ặc trưng của DPPH giảm xuống [39]. Vì vậy, phương pháp này dùng để sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất thu nhận được trong nhiều nghiên cứu. Hình 2.5. Cấu trúc DPPH ở trạng thái tự do (có màu tím đặc trưng) Vật liệu – Phương pháp 30 Hình 2.6. Cấu trúc DPPH mất gốc tự do (có màu vàng) 2.2.6. Định lượng hợp chất nhóm stilbene 2.2.6.1. Bán định lượng bằng phương pháp phổ tử ngoại Nguyên tắc: Mỗi hợp chất có màu đều có phổ đồ đặc trưng ở độ dài sóng hấp thu chuyên biệt, chẳng hạn như trans – resveratrol được hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 308 nm [10,43] , trans – pterostilbene có phổ đồ đặc trưng ở độ dài sóng hấp thu 308 nm [43]. Do đó, khi đo mật độ quang ở bước sóng đặc trưng cho chất chuẩn có nồng độ khác nhau sẽ có một đường chuẩn tuyến tính của mật độ quang với nồng độ chất chuẩn đó. Từ đó, với bất kỳ hổn hợp nào có chứa hợp chất này, chỉ cần xác định mật độ quang của nó ở bước sóng hấp thu đặc trưng đó, nồng độ hợp chất có trong dung dịch đem đo sẽ được xác định. Hàm lượng stilbene được suy ra dựa vào đường cong phổ hấp thu ở bước sóng 308 nm của resveratrol chuẩn. Resveratrol được xem là đại diện của nhóm stilbene trong rễ cây đậu phộng [13]. Các bước tiến hành: Xây dựng đường chuẩn: Resveratrol được cân chính xác và được hòa tan trong dung môi methanol để đạt nồng độ 1 mg/ml, sau đó được pha loãng thành các dung dịch có nồng độ từ 0,005 mg/ml đến 0,030 mg/ml. Đo mật độ quang của các dung dịch được pha ở bước sóng 308 nm; trong đó, dung môi methanol có giá trị ABS = 0. Vật liệu – Phương pháp 31 Bảng 2.3. Độ hấp thu ở 308 nm của các nồng độ resveratrol khác nhau. Nồng độ resveratrol (mg/ml) OD 308 0,000 0,005 0,010 00015 0,020 0,025 0,030 0,000 0,4757 0,9957 1,5340 2,3090 2,8979 3,2561 ±0,000 ±0,0016 ±0,060 ±0,0025 ±0,062 ±0,073 ±0,021 4.000 3.500 y = 113,7x - 0,068 R² = 0,994 OD 308nm 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 .500 .000 -.500 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 Nồng độ resveratrol (mg/ml) Biểu đồ 2.1. Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa resveratrol và độ hấp thụ Định lượng hợp chất có trong dịch được tách chiết: Pha loãng dung dịch có chứa hợp chất cần định lượng cho đến khi mật độ quang của chúng nằm trong khoảng giới hạn các mật độ quang có trong đường chuẩn. Dựa vào phương trình đường chuẩn y = 113,7x – 0,068 với y là giá trị OD và x là nồng độ resveratrol (mg/ml), suy ra nồng độ hợp chất tương ứng trong dung dịch đem đo, từ đó quy về hàm lượng hợp chất có trong hỗn hợp ban đầu. Vật liệu – Phương pháp 32 2.2.6.2. Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Trong luận văn này, phương pháp HPLC-UV được gửi phân tích tại phòng thí nghiệm phân tích trung tâm thuộc Trường ĐH Khoa học tự nhiên, TP. HCM. Phương pháp xử lý thống kê 2.2.7. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với số mẫu trên mỗi nghiệm thức từ 30-35 mẫu. Số liệu thu được từ kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, SPSS 16.0 phân nhóm các giá trị bằng phương pháp Duncan và so sánh các giá trị bằng phương pháp Dunnett. Kết quả được trình bày ở dạng: trung bình ± sai số (Mean ± SE). Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3. Phương pháp nghiên cứu chung gồm có khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tơ. Sau đó kiểm tra sự chuyển gen tạo rễ tơ của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes sang bộ gen của thực vật bằng phương pháp PCR. Tiếp theo là sàng lọc loại cao chứa nhóm stilbene và có hoạt tính kháng oxi hóa. Cuối cùng, khảo sát các yếu tố góp phần tăng sinh hàm lượng các hợp chất thuộc nhóm stilbene. 2.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tơ 2.3.1.1. Khảo sát loại mô thích hợp để tạo rễ tơ Hầu hết các mô và cơ quan thực vật gồm trục hạ diệp, lá, trục thượng diệp, cuống lá được xâm nhiễm đều có thể được chuyển gen bởi A. rhizogenes dẫn đến cảm ứng hình thành rễ tơ. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen thì phụ thuộc vào sự tương tác giữa vi khuẩn A. rhizogenes với từng loại mô, từng loại tế bào [55]. Vì vậy, thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định nguồn nguyên liệu đầu phù hợp để cảm ứng tạo rễ tơ. Lá, cuống lá, trụ thượng diệp, tử diệp, trụ hạ diệp của cây 20 ngày tuổi được cắt và tạo vết thương được sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu để khảo sát sự tạo rễ tơ sau khi xâm nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Vật liệu – Phương pháp 33 Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn là 15 phút và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ [28,32]. Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ và số rễ tơ tạo ra trên mỗi mẫu sau 14 - 21 ngày nuôi cấy. Mẫu đối chứng là các khúc cắt được nuôi cấy không được gây nhiễm với vi khuẩn, cũng được nuôi cấy trên trên các môi trường tương tự. Số mẫu thực hiện trên cảm ứng ở mỗi loại bộ phận là 30 – 45 mẫu. 2.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên quá trình cảm ứng tạo rễ tơ Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gene từ Agrobacterium vào tế bào thực vật là thời gian đồng nuôi cấy [55]. Thí nghiệm được tiến hành nhằm tìm thời gian đồng nuôi cấy cho hiệu suất chuyển gen tạo rễ tơ cao nhất. Sau khi tiến hành khảo sát loại mô, ta chọn được nguồn vật liệu đầu phù hợp cho sự cảm ứng tạo rễ tơ ở đậu phộng. Mẫu sau khi được nhúng trong dịch khuẩn 15 phút, được chuyển sang giấy thấm vô trùng để giảm độ ẩm trên bề mặt mẫu và sau đó chuyển lên môi trường MS không có chất điều hòa sinh trư ởng để đồng nuôi cấy. Thời gian đồng nuôi cấy được bố trí lần lượt: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ. Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng ra rễ tơ. Số mẫu trên mỗi nghiệm thức là 45 mẫu. Lặp lại 3 lần. 2.3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong dịch khuẩn đến việc hình thành rễ tơ Trong các nghiên cứu về cảm ứng tạo rễ tơ, mỗi tác giả sử dụng một thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn đã hoạt hóa. Vì vậy, thí nghiệm này được tiến hành nhằm tìm thời gian nhúng mẫu trong dịch khuẩn thích hợp tạo rễ tơ nhiều nhất. Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn lần lượt: 5, 10, 15, 20, 25, 30 phút. Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ. Vật liệu – Phương pháp 34 2.3.2. Chứng minh sự chuyển gen rolB, rolC thành công và kh ảo sát khả năng sinh trưởng rễ tơ trong môi trường lỏng lắc 2.3.2.1. Kiểm tra sự chuyển gen Kiểu hình rễ tơ là sự biểu hiện của việc tái tổ hợp các gen từ T-DNA (chẳng hạn rol và aux) của Ri plasmid vào trong tế bào thực vật. Do đó, kiểm tra chuyển gen thành công có 2 cách: phương pháp trực tiếp phát hiện thông qua T-DNA hoặc gián tiếp phát hiện thông qua opine. Phương pháp trực tiếp thường được sử dụng hơn vì trong m ột số trường hợp opine tại ra không bền. Để phát hiện T-DNA, phương pháp PCR hay Northern Blot thường được sử dụng [61]. Trong đó, phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi của các gen rolA, rolB, rolC, rolD và aux1 để kiểm tra sự chuyển gen vào tế bào.[49] Thí nghiệm được tiến hành gồm các bước: tách chiết Ri – plasmid của Agrobacterium rhizogenes sử dụng làm chứng dương; tách chiết DNA bộ gen của rễ cây đậu phộng in vitro để làm mẫu đối chứng; tách chiết DNA bộ gen của rễ tơ được cảm ứng từ mẫu lá, trụ hạ diệp, trụ thượng diệp, tử diệp, cuống lá để kiểm tra; thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của gen rolB, rol C; điện di xem sản phẩm PCR. Tách DNA bộ gen thực vật DNA bộ gen đâu phộng được tách chiết theo phương pháp CTAB của Stewart và Via (1993) [52] đã được thay đổi một số điểm nhằm kiểm tra sự chuyển gen tự nhiên từ A. rhizogenes vào thực vật. Vật liệu – Phương pháp 35 Cân 0,1 g mẫu Cho vào cối nghiền với nitơ lỏng CTAB (1 ml) Ủ 1 giờ, 65oC, lắc liên tục trong khi ủ Ly tâm 13000 rpm /5 phút Dịch nổi Tủa protein với phenol:chloroform (1:1) 500µl Ly tâm 13000 rpm/5 phút Thu pha trên 1 ml EtOH 100% lạnh, ủ 0oC qua đêm Ly tâm 13000 rpm/ 20 phút 4oC Tủa DNA Ethanol 80o lạnh Ly tâm 13000 rpm/ 3 phút Bỏ dịch, phơi khô ở 37oC 20 µl TE DNA bộ gen, bảo quản ở -20oC Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chiết DNA bộ gen thực vật Tách plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Vi khuẩn A. rhizogenes phát triển đến giữa pha tăng trưởng (OD = 0,5 - 1) được thu nhận sinh khối để tách plasmid theo quy trình của Curier và Nester (1976) [19] và Shoja [49] Vật liệu – Phương pháp 36 10-15 ml dịch khuẩn A. rhizogenes Ly tâm 6000 rpm/15 phút Thu tủa vào eppendolf 1,5 ml Sinh khối giữ trong gel lạnh 100 µl dung dịch I. Votex kĩ 100 µl TE 0,1X, để lạnh 200 µl dung dịch II, đảo nhẹ 600 µl phenol:chloroform (1:1), đảo nhẹ 100 µl dung dịch III đảo nhẹ Ly tâm 13000 rpm/5 phút, thu dịch nổi Dịch nổi 200 µl phenol:chlorofrom (1:1), đảo nhẹ Ly tâm 13000 rpm /10 phút 4oC, thu pha trên Dịch biến tính 1 ml EtOH 100% lạnh, ủ -20oC qua đêm Ly tâm 13000 rpm/20 phút -4oC Tủa DNA Phơi mẫu, hòa tan tủa vào 20 µl TE 0,1X Thêm 1 µl Rnase 1 mg/ml, ủ 37oC trong 1 giờ DNA plasmid Sơ đồ 2.3. Quy trình tách chiết DNA plasmid Chứng minh sự hiện diện của gen chuyển bằng PCR: Vật liệu – Phương pháp 37 Thành phần phản ứng: Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR Thể tích phản ứng (µl) Thành phần dNTP 2 mM 1,5 Mồi xuôi, 10 pmol/µl 1 Mồi ngược, 10 pmol/µl 1 DEPC-H 2 O 17,75 Dream Taq buffer 1,5 Dream Taq DNA polymerase, 1 U/µl 1,25 DNA khuôn 1 Tổng thể tích phản ứng 25 Lần lượt đặt phản ứng cho các cặp mồi của gen rolB và rolC. Bảng 2.5: Chương trình khuếch đại cặp mồi RolBF-RolBR, rolCF-rolCR Các bước khuếch đại Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Biến tính ban đầu 95,0 5:00 Biến tính 94,0 0:30 Bắt cặp 54,0 0:30 Kéo dài 72,0 1:00 Kết thúc 72,0 5:00 4,0 ∞ Vật liệu – Phương pháp Số chu kỳ 35 38 Sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được phân tích và kiểm tra kích thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Gel sau đó sẽ được ngâm với dung dịch ethidium bromide và xem dưới đèn UV. Kích thước các đoạn được khuếch đại được xác định thông qua thang DNA. 2.3.2.2. Xây dựng đường cong tăng trưởng của rễ tơ trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc Rễ tơ được tạo ra từ mẫu lá, được cắt và chuyển sang nuôi cấy trên môi trường MS lỏng có bổ sung saccharose 30 g/l, không có chất điều hòa sinh trư ởng thực vật, lắc với vận tốc 100 – 130 vòng/phút, đ ể kiểm tra sự tăng sinh theo thời gian nuôi cấy. Đo sự tăng trưởng của rễ tơ trong 30 ngày, 3 ngày đo một lần. Chỉ tiêu theo dõi là trọng lượng tươi rễ tơ. Trọng lượng tươi ban đầu khoảng 0,3 – 0,4 g. 2.3.3. Chứng minh sự hiện diện của nhóm stilbene, đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các loại cao từ rễ tơ cây đậu phộng 2.3.3.1. Chứng minh sự hiện diện của hợp chất nhóm stilbene trong các loại cao sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng Sắc ký bản mỏng là phương pháp định tính để xác định các chất trong cao có chứa chất hợp chất đang quan tâm [5]. Thí nghiệm này tiến hành để xác định xem cao nào chứa hợp chất nhóm stilbene. Tiến hành: Chấm dung dịch methanol có hòa tan các loại cao (cao hexan, cao chloroform, cao ethyl acetate, cao methanol) lên bản silica gel, sấy khô. Hệ dung môi giải ly là chloroform: ethyl acetate: formic acid (5:4:1) [45] nhưng do điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi sử dụng acetic acid thay thế cho formic acid và chất chuẩn là resveratrol. Kết quả ghi nhận được khi quan sát dưới đèn UV (254 nm). 2.3.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các loại cao Phương pháp Yen và Duh: Phương pháp tiến hành: Dựa theo quy trình của Sanja và cộng sự (2009) [46] Vật liệu – Phương pháp
- Xem thêm -