Tài liệu Báo cáo thực tập chuyên ngành cnsh y dược phần, nuôi cấy tế bào động vật phần, thụ tinh trong ống nghiệm.pptx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH CNSH Y DƯỢC PHẦẦN 1: NUÔI CẦẤY TẾẤ BÀO ĐỘNG VẬT PHẦẦN 2: THỤ TINH TRONG ÔẤNG NGHIỆM PHẦẦN 1: NUÔI CẦẤY TẾẤ BÀO ĐỘNG VẬT 1. ĐẶT VẦẤN ĐẾẦ 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 4. KẾẤT QUẢ - GIẢI THÍCH 5. KẾẤT LUẬN – KIẾẤN NGHỊ 2 I. ĐẶT VẦẤN ĐẾẦ Mô hình thử nghiệm và chẩn đoán bệnh Tạo cơ quan Nuôi câếy têế bào động vật Sản xuâết các hợp châết sinh h ọc Nguyên liệu câếy ghép Sản xuâết virus diệt côn trùng Thành thạo các thao tác cơ bản trên têế bào trước khi thực hiện các thí nghiệm chuyên sâu hơn. 3 II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nuôi cấấy tếấ bào • Nuôi câếy têế bào là quá trình mà các têế bào được nuôi trong điêều kiện có kiểm soát vêề:  pH.  Nhiệt độ.  Áp suâết thẩm thâếu.  Châết khí.  Châết dinh dưỡng. • Điêều kiện nuôi câếy là khác nhau cho từng loại têế bào  Tạo ra một hoặc hai dòng têế bào mong muôến. 4 II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Nuôi cấấy sơ cấấp - Sử dụng các têế bào sau khi được tách từ các mảnh mô và trước lâền câếy chuyêền đâều tên. - Thu nhận các mảnh sinh phẩm, mô sôếng  loại bỏ các thành phâền không mong muôến và các thành phâền gây hại cho mô  tách để tạo huyêền phù têế bào đơn trước khi nuôi câếy.  Nuôi câếy sơ câếp thường được sử dụng để khai thác các têế bào ban đâều trong những mảnh mô, nhằềm tạo ra các dòng têế bào mới. 5 II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3. Cấấy chuyếền và nuôi cấấy thứ cấấp • Câếy chuyêền cung câếp châết dinh dưỡng và không gian cho các dòng têế bào phát tri ển liên t ục. • Tâền sôế (độ thường xuyên câếy chuyêền) và tỉ lệ pha loãng, hay nôềng đ ộ têế bào ph ụ thu ộc vào đ ặc tnh c ủa môỗi dòng. Nêếu dòng được câếy chuyêền quá th ường xuyên hay nôềng đ ộ têế bào quá thâếp, chúng có th ể b ị mâết. • Nuôi câếy thứ câếp được tnh từ sau lâền câếy chuyêền đâều tên từ nuôi câếy s ơ câếp. 6 II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4. Đông lạnh và giải đông tếấ bào Đông lạnh Giữ têế bào ở trạng thái ngủ (Lưu trữ têế bào sôếng trong thời gian dài) Câền châết bảo quản đông lạnh (DMSO, glycerol, PEG,..) Giải đông Đưa têế bào vêề trạng thái sinh lý bình thường (Hoạt hóa têế bào) Câền môi trường dinh dưỡng Đông lạnh chậm: 40C  (-20) 0C  (-80) 0C  (-196) 0 C Giải đông nhanh (370C) Hạn chêế nhiêỗm Lưu trữ têế bào phục vụ mục đích nghiên cứu Tiêết kiệm môi trường nuôi câếy 7 III. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP  Vật liệu: 1.1. Mấẫu vật: Chuột nhằết trằếng Swiss Albino, 6-8 tuâền tuổi, nặng 18-22g, được cung câếp bởi Viện Pasteur TP. HCM 1.2. Hóa chấất:  Côền 70o.  Dung dịch PBS (kháng sinh 5X, 2X và 1X).  Trypsin/EDTA 0,25%/1%.  Môi trường DMEM/F12 FBS 10%. 1.3. Dụng cụ:  Erlen 250ml, 50ml; becher 50ml.  Kẹp thẳng, kẹp cong; kéo thẳng, kéo cong.  Đĩa petri đường kính 9-10cm.  ỐỐng ly tâm loại 15ml.  Buôềng đêếm hôềng câều, lamelle.  Đâều tp 1ml, 0.1ml; micropipete  Bình Flask 25cm2.  Khay rác.  Kim têm 1ml. 8 III. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Phương pháp: + Thu nhận xương đùi và xương cẳng chân chuột + Thu nhận quâền thể têế bào trong tủy xương + Xác nhận tỷ lệ sôếng chêết của têế bào + Thay môi trường và câếy chuyêền + Đông lạnh – Giải đông 9 SƠ ĐỒ THỰC NGHIỆM Têế bào tủy xương chuột Nuôi cấấy sơ cấấp Thay môi trường Têế bào MCF7 Cấấy chuyếền Đông lạnh Giải đông 10 IV. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 1. Nuôi cấấy sơ cấấp  Hôỗn hợp têế bào có trong tủy xương bao gôềm têế bào gôếc tạo máu, têế bào máu trưởng thành và têế bào gôếc trung mô.  Quan sát hình thái, kích thước: • Gôềm 2 nhóm têế bào: có nhân và không có nhân. • ~6,33 µm, tròn đêều, không nhân, lõm  Têế bào hôềng câều. 20X Hình 1. Các tếế bào thu được từ tủy xương chuột. 11 IV. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 1. Nuôi cấấy sơ cấấp X20 X20 Mật độ: 1,052 x 107 (tb/ml) NHÓM 6 Mật độ: 7,92 x 106 (tb/ml)7 NHÓM Trên cùng 1 con chuột, mật độ têế bào tủy xương thu được của nhóm khi đêếm trên kính hi ển vi l ớn h ơn c ủa nhóm 7, tuy nhiên khi quan sát cảm quan qua hình ảnh nhận thâếy sôế lượng têế bào thu đ ược ít h ơn. Sai sôế hệ thôếng trong quá trình đêếm têế bào; nhận diện sai têế bào câền đêếm (đêếm nhâềm têế bào hôềng câều) 12 1. Nuôi cấấy sơ cấấp Kếết quả nuôi cấếy sơ cấếp sau 3 ngày • • Xuâết hiện quâền thể nhiêều loại têế bào (tròn, hình thoi, hình que dài), tr ải và không tr ải. Sôế lượng têế bào bám trải ít (dưới 70-90%), không đủ để câếy chuyêền. Biện luận: Xương lớn không chọc đúng lôỗ tủy  thu được sôế lượng têế bào tủy xương ít 13 2. Thay môi trường Trước 10X 10X 20X 20X Sau Hình 2. Têế bào tủy xương TRƯỚC và SAU thay môi trường ở các vật kính X10, X20 Các tế bào không bám dính bị loại bỏ, quan sát được các tế bào bám dính rõ ràng hơn. 14 Theo dõi đĩa nuôi cấếy ngày thứ 6 của nuôi cấếy 5X 10X 20X Hình 3. Têế bào tủy xương ngày 21/10/2016 Mật độ các têế bào bám thâếp hơn 70%  Không thể câếy chuyêền 15 3. Đông lạnh – Giải đông Mật độ têế bào tổng: 5,8 x 105 (tb/ml) Mật độ têế bào sôếng: 4,2 x 105 (tb/ml) 72,4% têế bào sôếng; 27,6% têế bào chêết 5X 10X 20X Tỉ lệ têế bào chêết cao  Trong quá trình đông lạnh một sôế têế bào chêết do hình thành tnh thể đá, do stress, do sôếc nhiệt hoặc do thao tác. 16 4. Kếất luận – Kiếấn nghị  Kếất luận Nuôi câếy được 1 dòng têế bào từ tủy xương, không bị nhiêỗm Nằếm được các kiêến thức và thao tác cơ bản trong nuôi câếy têế bào đ ộng v ật Nằếm được các kyỗ nằng cơ bản trong quan sát, đánh giá têế bào nuôi câếy  Kiếấn nghị Nuôi câếy têế bào động vật là một kyỗ thuật khó và câền nhiêều th ời gian th ực t ập đ ể thao tác thành thạo hơn. 17 PHẦẦN 2: THỤ TINH TRONG ÔẤNG NGHIỆM 1. NGUYẾN TẮẤC CỦA PHƯƠNG PHÁP 2. KẾẤT QUẢ - GIẢI THÍCH - GÂY SIÊU BÀI NOÃN - THU TRỨNG - THU TINH - THỤ TINH (ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI VÀ NHUỘM HUỲNH QUANG) + SAU 4 GIỜ + SAU 1,5 NGÀY - TIÊM THUỐỐC MÊ CHO CHUỘT - LỌC DÂẦU KHOÁNG - TẠO VI GIỌT - KÉO PIPETTE PASTEUR - CHỌN GIAO TỬ - THU TRỨNG - THU TINH 3. MỘT SÔẤ LƯU Ý 4. KẾẤT LUẬN – KIẾẤN NGHỊ 1. NGUYẾN TẮẤC CỦA PHƯƠNG PHÁP GẦY SIẾU BÀI NOÃN CHUỘT  Côế định chuột trên tay  Sát trùng vùng bụng chuột  Tiêến hành têm hCG vào vùng bụng chuột sau khi têm PMSG khoảng 46 – 48 giờ. TIẾM THUÔẤC MẾ CHUỘT  Côế định chuột trên tay  Sát trùng bằếp chân chuột  Tiêm thuôếc mê vào cơ bằếp chân bên trong của chuột Lưu ý: thuôếc mê chỉ có tác dụng trong vòng 30 phút