Tài liệu BÁNH QUY BƠ VỊ TRÀ XANH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ===  === ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: KHẢO SÁT VÀ TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY POLYPHENOL TRONG LÁ CHÈ ( Camellia sinensisL). GV hướng dẫn: Ths. Trần Phương Chi SV thực hiện: Hà Thị Lương: 1252041722 Phan Thị Lý : 1252041687 Lớp : 53K1 - Công nghệ Thực phẩm NGHỆ AN - 05/2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Hà Thị Lương MSSV: 1252041722 Phan Thị Lý Khóa : 53 Ngành: 1. MSSV: 1252041687 Công nghệ thực phẩm Tên đề tài: “Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện trích ly polyphenol trong lá chè. ( Camellia sinensis L.)”. 2. Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: - Lý thuyết chung về lá chè - Lý thuyết chung về các hợp chất polyphenol - Xác định một số thành phần hóa học trong lá chè - Khảo sát điều kiện trích ly polyphenol trong lá chè - Tối ưu hóa điều kiện trích ly polyphenol từ lá chè 3. Họ tên cán bộ hướng dẫn: 4. Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 5. Ngày hoàn thành đồ án: ThS. Trần Phương Chi Ngày Ngày tháng tháng năm năm Ngày tháng năm 2017 Chủ nhiệm bộ môn Cán bộ hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Hà Thị Lương Phan Thị Lý Khóa: MSSV: 1252041687 53 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: ThS. Trần Phương Chi 1. MSSV: 1252041722 Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………… ………………………………………………………………………………………… 2. Nhận xét của cán bộ hướng dẫn: ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2017 Cán bộ hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Hà Thị Lương Phan Thị Lý Khóa: 53 Ngành: Công nghệ thực phẩm MSSV: 1252041722 MSSV: 1252041687 Cán bộ duyệt: 1. Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………… ………………………………………………………………………………………… 2. Nhận xét của cán bộ duyệt: ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2017 Cán bộ duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Đồ án này được hoàn thành tại phòng Trung tâm phân tích và chuyển giao công nghệ Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại học Vinh. Để hoàn thành được đồ án này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo Trần Phương Chi, thầy giáo Lê Thế Tâm đã giao đề tài, hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình hoàn thành đồ án. Em xin cũng xin bày tỏ lòng biết ơn: - Các kỹ thuật viên tại Trung tâm, cô Ngô Thị Thủy Hà đã giúp đỡ tạo điều kiện sử dụng máy móc thiết bị nghiên cứu. - Các bạn trong nhóm đồ án, các bạn 53K - CNTP đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm luận văn. Tuy nhiên, trong bản đồ án chắc chắn vẫn còn nhiều thiếu sót nên em rất mong quý thầy cô và các bạn góp ý để em hoàn thiện bản đồ án của mình và học hỏi, rút kinh nghiệm cho công tác nghiên cứu sau này. Cuối cùng, một lần nữa em xin gửi đến tất cả những người đã quan tâm, giúp đỡ em hoàn thành đồ án lời cảm ơn chân thành nhất ! Vinh, tháng 05 năm 2017 Sinh viên Hà Thị Lương Phan Thị Lý SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Mở đầu 1.Lý do chọn đề tài. Chè là một loại nước uống phổ biến trên thế giới, uống chè không những là một nét văn hóa lâu đời mà nhiều công trình khoa học còn chứng minh chè có tác dụng trong việc phòng và chữa nhiều loại bệnh khác nhau. Ngày nay, nhiều công trình nghiên cứu đã cho kết quả khả quan, xác định được thành phần các chất có trong chè xanh, trong đó đặc biệt quan tâm là nhóm hợp chất polyphenol với nhiều chất có hoạt tính sinh học mạnh mẽ và nó còn chiếm hàm lượng tương đối lớn trong lá chè. Do có tính chất chống oxy hóa mạnh, polyphenol từ chè đã được sử dụng trong nhiều mục đích khác nhau và chủ yếu được dùng bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm, mang lại giá trị kinh tế to lớn. Ngoài ra polyphenol còn được sử dụng trong các ngành dược phẩm, mĩ phẩm,… Việt Nam là một trong những nước có diện tích trồng chè và sản lượng chè lớn trên thế giới và có điều kiện phù hợp cho ngành trồng chè. Tuy nhiên việc khai thác, chế biến cây chè của Việt Nam mới chỉ dừng lại ở việc sản xuất sản phẩm chè xanh từ búp và lá non chè xanh để sản xuất trà. Chính vì vậy, việc nghiên cứu khai thác nguồn polyphenol từ nguyên liệu lá chè xanh là một hướng nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị và nguồn lợi từ cây chè Việt Nam. Dựa trên nguồn nguyên liệu phong phú đó,chúng em đã thực hiện đề tài: KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÍCH LY POLYPHENOL TỪ CHÈ.→ KHẢO SÁT VÀ TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY POLYPHENOL TỪ LÁ CHÈ (Camellia sinensis L). 2. Ý khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa về mặt kinh tế: chè là nguyên liệu phổ biến và giá cả thu mua rẻ nên dẫn đến chi phí về một sản phẩm thấp. - Ý nghĩa về mặt xã hội: Khi chi phí cho một đơn vị sản phẩm thấp đồng nghĩa với giá thành sản phẩm không cao nên chi phí về chi tiêu giảm dẫn đến chi phí về giáo dục cao. - Ý nghĩa đối với nhà sản xuất: việc chiết xuất thu nhận polyphenol từ chè từ đó bổ sung vào các sản phẩm thục phẩm làm đa dạng hóa sản phẩm,mở rộng thị trường… SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Ý nghĩa về mặt sức khoẻ: polyphenol có nhiều nhất trong chè xanh. Ngoài ra, hợp chất polyphenol thường có trong các loại hoa quả, rau củ, các loại hạt, ngũ cốc,... Hợp chất này có đặc tính chống oxy hóa, kháng viêm và chống ung thư. Chất polyphenol cũng giúp động mạch co giãn để duy trì lưu lượng máu và giữ cho động mạch không bị xơ vữa. - Ý nghĩa trong công nghệ thực phẩm: polyphenol được ứng dụng nhiều trong sản xuất nước giải khát, bánh kẹo, trong sản xuất mỹ phẩm, dược phẩm… 3 .Nhiệm vụ nghiên cứu - Xác định một số thành phần hóa học trong chè - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly polyphenol - Tối ưu hóa điều kiện thu nhận polyphenol Căn chỉnh mục đề, dòng cho phù hợp SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chương I : Tổng quan 1.1 Sơ lược về cây chè 1.1.1 Tên gọi Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis Lind O.Kuntze, tên gọi sinensis trong tiếng Latinh có nghĩa là Trung Quốc. Hình 1.1: Lá chè Chè thuộc: Ngành: Bí tử (Angiospermae) Lớp: Song diệp tử (Dicotylednae) Bộ: Sơn trà (Theals) Họ: Trà (Theacea) Chi: Trà (Camenllia) Loài: Camenllia sinensis 1.1.2. Đặc điểm hình thái Chè là một loại cây sống xanh tươi quanh năm, và sống chủ yếu ở vùng nhiệt đới, ôn đới. Căn cứ vào đặc tính sinh trưởng và hình thái của cây chè, người ta phân thành 3 loại cây khác nhau: cây bụi, cây trung bình và cây to. SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Cây bụi: Loại này cây nhỏ, phân bố nhiều cành, gọn, các cành mọc từ cổ rễ, sau đó các cành phát triển theo tuổi lá. Loại này không có than nổi trên mặt đất, cao từ 2-3m, chịu được lạnh, trồng chủ yếu ở: Nga, Trung Quốc, Nhật Bản. - Cây trung bình: thân cây nhỏ, phân cành ngay từ khi cây còn thấp, các cành mọc xiên với thân một góc nhất định, cành mọc phân tán và có thể cao tới 5-6m; loại cây này sống chủ yếu ở vùng nhiệt đới. - Cây to: thân cây to, lên cao mới bắt đầu phân cành, nếu để mọc tự nhiên có thể cao tới 17m 1.1.3. Nguồn gốc cây chè. Năm 1753, Carl Von Linnaeus, nhà thực vật học Thủy Điện nổi tiếng, lần đầu tiên trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu trên một số loại chè cổ ở Trung Quốc. Nhiều công trình nghiên cứu và khảo sát trước đây cho rằng: Nguồn gốc của cây chè là vùng cao nguyên Vân Nam – Trung Quốc, nơi có khí hậu ẩm ướt và ẩm. Cũng theo tài liệu này thì vùng biên giới Tây Bắc nước ta nằm trong vùng nguyên sản của giống chè tự nhiên trên thế giới. Năm 1823, Robert Bruce, một học giả người Anh, lần đầu tiên phát hiện một số cây chè hoang dã trong dảy núi Sadiya ở vùng Atxam( Ấn Độ). Năm 1918, Cohen Stuart (Java), một nhà phân loại thực vật Hà Lan đã thu thập mẩu tiêu bản chè tại Vân Nam, Bắc Việt Nam và Bắc Mianma. Kết quả đã tìm thấy những cây chè thân gỗ lớn ở khu vực miền núi phía Nam và phía Tây Vân Nam. Tuy có những quan điểm khác nhau về nguồn gốc cây chè, nhưng vùng phân bố chè nguyên sản và vùng chè dại đều nằm ở khu vực núi cao, có điều kiện sinh thái lí tưởng. Từ những nghiên cứu trên có thể đi đến kết luận là cây chè có nguồn gốc từ Châu Á. 1.1.4. Phân bố chè. 1.1.4.1 Phân bố chè trên thế giới Chè được trồng nhiều tại vành đai á nhiệt đới, khu vực có đặc điểm khí hậu ôn hòa, ẩm ướt từ 300C vĩ bắc đến 490C vĩ nam. Hiện nay, chè được trồng ở hơn 30 nước và được sử dụng ở hầu hết các nước trên thế giới. Các nước sản xuất và xuất khẩu chè nhiều trên thế giới là Ấn Độ, Trung Quốc, Srilanca, Kenia, Thổ Nhĩ Kì, Indonesia, Nhật Bản,….Năm 1995, diện tích trồng chè toàn thếgiới là 2.500.000 ha, sản lượng 2.590.000 tấn chè khô. SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hiện nay, chè được sản xuất và chế biến thành nhiều loại sản phẩm khác nhau, trong đó khoảng 76 – 78% là chè đen, 20 -22% là chè xanh, 2% là chè ôlong, còn lại là các sản phẩm chè khác… 1.1.4.2 Phân bố trà?? tại Việt Nam. - Vùng chè Tây Bắc: Chè trồng tập trung ở Sơn La( 3 tiểu vùng Mộc Châu, Mai Sơn, Phú Yên), Lai Châu( 2 tiểu vùng Phong Thổ, Tam Đường). Vùng chè Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn: Gồm các tỉnh Tuyên Quang, Lào Cai, Hà Giang, Bắc Cạn và phía tây Yên Bái. Vùng chè Trung du Bắc Bộ: vùng này nằm tại ranh giới giữa miền núi và miền đồng bằng Bắc Bộ bao gồm các tỉnh: Phú Thọ, Hòa Bình, Vĩnh Phú, Thái Nguyên,.. Vùng chè Bắc Trung Bộ: Đây là vùng chè lâu đời nhất tại Việt Nam gồm 3 tỉnh: Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh. Vùng chè Tây Nguyên: gồm 3 tỉnh: Lâm Đồng, Gia Lai, Kon Tum. Vùng chè Duyên Hải miền Trung: Đây là vùng chè quan trọng của Việt Nam trước thời kì Pháp thuộc. Phần lớn chè được trồng nhiều theo dọc ở Duyên Hải Trung Bộ, trên sườn của dãy núi Trường Sơn. Ngành chè Việt Nam vẫn tập trung vào các sản phẩm chè truyền thống như: chè đen, chè olong, chè xanh, gần đây là các sản phẩm trà hoà tan...; chưa phát triển các sản phẩm trích ly từ chè, vốn là những sản phẩm có giá trị thương mại cao, nên chưa tận dụng hết ưu thế về vùng nguyên liệu và khả năng phát triển của ngành. - 1.1.5. Phân loại các giống chè. Để phân loại cây chè, người ta dựa trên các cơ sở: - Cơ quan sinh dưỡng: loại thân bụi hoặc thân gổ, hình dáng của tán, hình dạng và kích thước của loại lá, số đôi gân lá… Cơ quan sinh trưởng: độ lớn cánh hoa, số lượng đài hoa, vị trí phân nhánh THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHÈ? 1.2. TỔNG QUAN VỀ POLYPHENOL? (CẤU TẠO, TÍNH CHẤT, VAI TRÒ, ỨNG DỤNG..) TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ TRÍCH LY POLYPHENOL TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI.. TỔNG QUAN CHƯA RA CÁI GÌ CẢ. THỂ HIỆN SỰ KHÔNG ĐẦU TƯ!!! SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, dụng cụ và hóa chất. 2.1.1 Nguyên liệu - Nguyên liệu chè được hái ở xã Hòa Sơn, Đô Lương, Nghệ An Các lá chè non, bánh tẻ, già. Nguyên liệu sử dụng để nghiên cứu phải tươi, không dập nát, để tránh polyphenol thất thoát do bị oxy hóa. 2.1.2 Hóa chất - Ethanol 980, nước cất Sodium tungstate ( Na2WO4.H2O) Acid citric Acid phosphoric Liti sunphat ( Li2SO4 ) Dung dịch Brôm (Br2). Axit Gallic (C7H6O5) Axit HCl đậm đặc 37,3%. Na 2 CO 3 7,5% 2.1.3 Thiết bị - Bếp điện Tủ sấy Máy đo pH Máy quang phổ UV – Vis Agilent 8453, cuvet thủy tinh có bề dày 1,001cm SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Cân phân tích,độ chính xác 0,001g Bộ đun hồi lưu Tủ hút Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml Ống nghiệm Bình định mức 10ml, 25ml, 100ml. - Bình hút ẩm - Phễu thủy tinh. - Bình tam giác. Và một số thiết bị hổ trợ khác. Tủ sấy Bình hút ẩm 2.2 Pha chế dung dịch 2.2.1 Thuốc thử Folin – Ciocalteu Hòa tan 10 gam Sodium tungstate và 2,5 gam Sodium molybdate trong 70ml nước cất. Thêm 5ml axit phosphoric 85% và 10ml axit hydrochloric đậm đặc. Đun hồi lưu trong 10 giờ. Sau đó thêm 15 gam Lithium sulfat, 5ml nước cất và 1 giọt dung dịch Brôm. Tiếp tục đun hồi lưu trong 15 phút. Làm nguội tới nhiệt độ phòng và điều chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Dung dịch thu được có màu vàng tươi sáng, nồng độ axit từ 1,9 – 2,1 N dựa theo dung dịch NaOH chuẩn độ. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Đun hồi lưu sau 24h đun SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý định mức bằng nước cất 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.2 Thuốc thử Folin – Ciocalteu 10% Dùng pipet 10ml hút chính xác 10ml thuốc thử Folin – Ciocalteu đậm đặc cho vào bình định mức 100ml rồi định mức đến vạch bằng nước cất. 2.2.3 Dung dịch Na2CO3 7,5% Cân chính xác 7,5g Na2CO3 đựng trong cốc sạch rồi hòa tan bằng nước cất, cho vào bình định mức 100ml rồi định mức đến vạch bằng nước cất. Na2CO3 7,5%. Folin - Ciocalteu 10%. 2.2.4 Ethanol 70% Qua các tài liệu đã nghiên cứu thì dùng ethanol 70% đem lại hiệu quả trích ly cao nên chúng tôi chon ethanol 70% làm dung môi khảo sát quá trình trích ly polyphenol trong chè. Cách pha: Lấy 70ml ethanol tinh khiết vào bình định mức 100ml rồi định mức bằng nước cất đến vạch ta thu được ethanol 70%. 2.2.5 . Pha chế dãy dung dịch chuẩn M acid galic = 170,12 g/ml Lấy 0,0425 (g) cho vào bình định mức 25 ml , định mức đến vạch bằng etanol 70% ta được dung dịch axit gallic có nồng độ 10 mM . SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lấy 2,5 ml dung dịch axit gallic 10 mM cho vào bình định mức 25 ml, định mức đến vạch bằng etanol 70% ta được dung dịch axit gallic 1 mM. Pha dãy dung dịch chuẩn từ dung dich axit gallic 1 mM STT Acid gallic 1mM( ml) 1 1 2 2 3 3 4 4 5 7 C 2 H 5 OH 70 %( ml ) 9 8 7 6 3 Nồng độ( mM ) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.7 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Một số phương pháp xác định tính chất vật liệu.  Xác định độ ẩm: Sử dụng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi Cách tiến hành: - Dùng cân phân tích hoặc cân điện tử cân chính xác 5g mẩu lá chè. Sau đó cho vào cốc sạch, khô đã biết trước khối lượng trước( tức là sau khi rửa, sấy khô, để nguội đến nhiệt độ phòng, cân). - Dùng đũa thủy tinh san đều lượng mẩu ở cốc để ẩm bốc hơi nhanh và đều. - Để mẩu vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không đổi. Sau khi sấy lấy mẩu ra cho vào bình hút ẩm để làm nguội, cân. Khi kết quả giữa hai lần cân cuối có sai số chênh lệch 0,5% là coi như khối lượng không đổi. - Tính kết quả thí nghiệm: nếu gọi: G1 : là khối lượng cốc và mẩu trước khi sấy (g) G0 : là khối lượng cốc không (g) G2 : là khối lượng cốc và mẩu sau sấy (g) G : khối lượng mẩu cần xác định (g) G = G1 –G0 (g) - Độ ẩm tương đối hay độ ẩm nguyên liệu được xác định theo công thức sau, tính bằng %: W= G1−G2 .100 % G SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Xác định tổng chất khô hòa tan: xác định chỉ số bằng khúc xạ kế Theo TCVN: 4335:86 - Cân 5-10g cho vào chén sứ và cân bằng cân kĩ thuật chính xác đến 0,01g. - Sau đó dùng chày sứ nghiền nhanh và cẩn thận. Cho 1 lượng nước bằng lượng mẫu đã cân. - Lọc qua vải thô và lấy ngay giọt thứ 3, hay thứ 4 để đo( để dịch lọc cho trong rồi mới đo). * Tiến hành đo - Dùng nước cất rửa sạch mặt kính, dùng giấy thấm khô. Dùng ống nhỏ giọt lấy vài giọt dịch trong nhỏ lên mặt kính của khúc xạ kế. - Đọc kết quả ở thang đo,ở phía có ghi hàm lượng chất khô theo %. Nhiệt độ 20oc - Kết quả là giá trị trung bình số học của 3 lần xác định song song, đồng thời chênh lệch giữa kết quả 3 lần đo không được vượt quá quá 0,0003.  Xác định tro: Theo TCVN: 5611:1991 về chè - Cân 3g chè( chính xác đến 0,001g) vào chén đốt tro đã được nung ở 5250C và biết trước khối lượng. Đặt chén vào lò nung và nung ở nhiệt độ 525 ± 25oC . giữ nhiệt độ đó trong 3h. Sau đó lấy chén ra và cho vào bình hút ẩm. Để nguội và cân chính xác đến 0,001(g) . - Hàm lượng tro được tính theo công thức: X= G2 .100 G1 Trong đó: G1 là khối lượng mẩu G2 là khối lượng tro của mẩu chè  Xác định axit toàn phần: Cân 5g chè đã được cắt nhỏ cho vào bình tam giác sau đó cho khoảng 30ml nước cất và tiến hành lắc trong 1h. SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tiến hành định mức trong bình định mức 50 ml bằng nước cất. Sau đó lấy ra 25ml thêm vào 3-4 giọt chỉ thị phenolphthalein. Chuẩn độ bằng dd NAOH 0,1N đến khi dung dịch xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây. Kết quả: X =k. V . N .50 m.25 Trong đó: V: thể tích NAOH tiêu tốn N: Nồng độ đương lượng m: khối lượng mẩu k: hệ số của axit (k= 0,064)  Xác định hàm lượng chất xơ: Theo TCVN 4413:87 Cân 2,5g chè với độ chính xác 0,01g. Cho mẩu vào cốc dung tích 600 ml. Thêm vào 200ml dd H2SO4 vào tủ hút và đun đến sôi. Thỉnh thoảng lắc để chè không bị bám vào thành cốc, đun sôi 30 phút, trong quá trình đun bổ sung phần nước bị bay hơi. - - - Lấy cốc ra thêm 50ml nước cất, lọc qua vải lọc. Rửa cặn bằng nước sôi cho đến khi dịch rửa không còn axit( thử bằng giấy quỳ). Cho cặn vào cốc, thêm 200ml NaOH, đặt lên bếp và đun sôi trong 30 phút. Thỉnh thoảng lắc để cặn không bám vào thành cốc, phần nước bay hơi được bổ sung bằng nước cất. Lọc và cho cặn vào cốc, rửa cặn dính lại ở cốc để lấy hết cặn. Cho cặn vào tủ sấy rồi sấy ở 100 ± 20C. Làm nguội rồi cân. Lặp lại thao tác này cho đến khi chênh lệch khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không vượt quá 0,001g. Cho cặn sau sấy vào lò nung ở 525 ± 200C, nung đến khối lượng không đổi, làm nguội rồi cân. Kết quả: X= ( M 1−M 2 ) .100 .100 Mo .(1−W ) Trong đó: M1: khối lượng cặn sau sấy (g) SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP M2: khối lượng cặn sau nung (g) Mo: khối lượng mẫu (g) W : độ ẩm của chè 2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu  Xử lý mẫu: Mẫu thu hái về được rửa sạch, để ráo, đem sấy khô ở 0 105 C 0 trong , đem nghiền nhỏ, bảo quản ở −20 C .SAO LẠI SẤY NHIỆT ĐỘ NÀY ??? (SẤY Ở NHIỆT ĐỘ 85-90 0C ĐẾN ĐỘ ẨM 6-7%)  Trích ly mẫu: Lá chè khô nghiền nhỏ thêm etanol 70% siêu âm 1h lọc dịch chiết hút đem đi phân tích. 2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3.3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi Thực hiện 4 công thức sau: CT1: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm 8ml dung môi etanol 70%, siêu âm trong vòng 1h, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT2: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm 10ml dung môi etanol 70%, siêu âm trong vòng 1h, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT3: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm 15ml dung môi etanol 70%, siêu âm trong vòng 1h, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT4: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm 20ml dung môi etanol 70%, siêu âm trong vòng 1h, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT5: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm 25ml dung môi etanol 70%, siêu âm trong vòng 1h, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. Các công thức được tiến hành với các thông số như nhau: nhiệt độ phòng, thời gian trích ly 1h, pH = 6. Dịch chiết thu được đo UV-Vis, xác định tỷ lệ nguyên liệu/dung môi hiệu quả nhất. 2.3.3.2. Khảo sát thời gian trích ly sơ bộ Thực hiện thí nghiệm với 5 công thức tương ứng thời gian: 20, 40, 60, 80, 100 phút. SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CT1: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm số ml dung môi etanol 70%, siêu âm trong 20 phút, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT2: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm số ml dung môi etanol 70%, siêu âm trong 40 phút, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT3: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm số ml dung etanol 70%, siêu âm trong 60 phút, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT4: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm số ml dung môi etanol 70%, siêu âm trong 80 phút, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT5: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm số ml dung môi etanol 70%, siêu âm trong 100 phút, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. Các công thức được tiến hành với các thông số như nhau: tỉ lệ dung môi / nguyên liệu đã xác định, pH = 6. Dịch chiết thu được đo UV-Vis, xác định thời gian trích ly cho hàm lượng phenolic dịch chiết lớn nhất. 2.3.3.4. Khảo sát pH trích ly sơ bộ Thực hiện thí nghiệm với 5 công thức tương ứng pH = 2, 3, 4, 5, 6. CT1: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm số ml dung môi etanol 70%, thời gian trích ly tối ưu chọn ở trên, pH = 2, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT2: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm số ml dung môi etanol 70%, thời gian trích ly tối ưu chọn ở trên, pH = 3, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT3: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm số ml dung môi tốt etanol 70%, thời gian trích ly tối ưu chọn ở trên, pH = 4, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT4: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm số ml dung môi etanol 70%, thời gian trích ly tối ưu chọn ở trên, pH = 5, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. CT5: Cân 1 gam nguyên liệu, thêm số ml dung môi etanol 70%, thời gian trích ly tối ưu chọn ở trên, pH = 6, lọc thu dịch lọc, hút lấy phần trong. Dịch chiết thu được đo UV-Vis, xác định pH trích ly cho hàm lượng phenolic dịch chiết lớn nhất. SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Polyphenol bền trong pH axit và kém bền trong pH bazơ. Khi trích ly ở pH thấp tránh được hiện tượng oxy hóa polyphenol và tăng hiệu quả của quá trình trích ly. PH của dịch trích ly đo được pH=6, để đưa pH dịch trích về pH = 2, 3, 4, 5 ta dùng các axit sau: HCl, axit citric,…Việc thêm acid vào dung môi chiết quyết định trạng thái ổn định của hợp chất phenolic như anthocyanins (hợp chất bền trong môi trường acid, ở pH cao, nó bị biến đổi), ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các polimer thủy phân như lignin, hydroxycinnamic acid và procyanidins, và cuối cùng có thể làm tăng mức độ thẩm thấu của thành tế bào từ đó tăng độ hòa tan của poliphenol. Ở đây ta chọn axit citric nồng độ 20% để điều chỉnh pH dịch trích ban đầu. 2.3.4. Phương pháp xác định tổng hàm lượng pholyphenol . Hàm lượng phenolic tổng số được xác định bằng quang phổ, sử dụng axit galic như là chất chuẩn, theo phương pháp mô tả bởi tiêu chuẩn Tổ chức quốc tế (ISO) 14.502-1:2005. Tiến hành lên màu theo trình tự: Hút 1 ml dịch chiết mẫu pha loãng, thêm 5ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% và lắc đều, sau 5 phút tiếp tục thêm 4ml dung dịch Na 2CO3 7,5%, lắc đều và để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó tiến hành so màu ở bước sóng 765 nm. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Hàm lượng phenolic tổng số được tính dựa vào đồ thị chuẩn của axit gallic trong khoảng nồng độ 10 - 80 μg/ml. Dịch pha loãng sau khi cho Folin sau khi cho Na2CO3 để yên 30 phút đo uv- vis Quy trình phân tích tổng phenolic bằng thuốc thử Folin-Ciocalteu: SVTH: Hà Thị Lương- Phan Thị Lý 53K - CNTP