Tài liệu Bài tiểu luận-lập thư viện cadn

Bài tiểu luận: Lập thư viện cADN Nhóm sinh viên thưc hiên: 1. Trần Thị Vân Anh 6. Trần Trung Hiếu 2. Trần Xuân Bách 7. Nguyễn Quang Huy 3. Trương Thị Hải 8. Cấn Thị Khánh Huyền 4. Hà Minh Hiền 9. Hoàng Thị Thu Hường 5. Phùng Thị Thu Hiền 10. Hoàng Thị Yến Khái quát chung  Ngày nay trái đất đối mặt với biến đổi khí hậu. Thay đổi khí hậu sẽ làm thay đổi mức độ thiệt hại của khô hạn, ngập úng, ngập mặn, nhiệt độ cao, tác hại của sâu bệnh. Chiến lược phát triển chung của ngành nông nghiệp thế giới là sẽ tập trung vào những nội dung sau: làm cho cây trồng thích ứng với biến đổi khi hậu; cải tiến năng suất vượt trội; tạo nền tảng đa dạng di truyền...   Để làm được những điều ấy người ta phải thực hiện nghiên cứu trình tự genom, cải tiến phương pháp đánh giá kiểu hình, áp dụng các kĩ thuật di truyền và đặc biệt là xây dựng thư viện cDNA Trong nội dung của Hội nghị quốc tế lần thứ 6 ở ĐBSCL đã chỉ rõ: nước nào xem nhẹ công tác ngân hàng gen nước đó sẽ phải đối mặt với rất rất nhiều khó khăn trong công tác chọn giống trong tương lai   Thư viện cDNA giúp chúng ta có được các dòng cDNA mã hóa liên tục của một gen, tìm ra chúng một cách dễ dàng. Nhận thấy tầm quan trọng của đề tài chúng tôi xin trình bày những hiểu biết của mình về Thư viện cDNA Tổng quan đề tài I, Thư viện cDNA là gì?  1, Khái niệm  2, Các bước tổng hợp cDNA  3, Các bước lập thư viện cDNA  4, Ưu điểm của việc lập thư viện cDNA II, Thành tựu I. Thư viện cDNA (c-DNA library) là gì?     1. Khái niệm cDNA (complementary DNA) có nghĩa là ADN bổ trợ. ADN bổ trợ chính là ADN đựơc tổng hợp từ ARN thông tin( messenger RNA hay m- RNA) duới sự xúc tác của enzim phiên mã nguợc (reverse transcriptase). Thư viện cADN chính là tập hợp lưu trữ các ADN bổ trợ được tổng hợp từ các ARN thông tin.    Là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mARN của một tế bào. Không giống với thư viện bộ gen thư viện cDNA được thiết lập từ một tế bào xác định. Trong đó gen cần nghiên cứu phải biểu hiện thành mARN Thường nguời ta thiết lập thư viện cADN trên vectơ thực khuẩn thể lambda( vectơ chèn) trong truờng hợp cần lập thư viện cADN tổng thể, hay vectơ plasmid trong truờng hợp cần lập thư viện cADN hạn chế. Thư viện cADN thường được lập cho eukaryote 1.Các buớc chính để tổng hợp cDNA 1. Tổng hợp sợi thứ nhất bằng enzyme reverse transcriptase ( enzim phiên mã nguợc). 2. Biến tính và cắt RNA trong thể lai mRNAcDNA tuần tự bằng nhiệt và enzyme RNase H của E. coli. Thay thế khuôn mẫu là chuỗi RNA bằng chuỗi cDNA thứ nhất và tổng hợp sợi cDNA thứ hai nhờ DNA polymerase I của E. coli. 3. Cắt vòng cặp tóc của cDNA sợi đôi nhờ nuclease S1 và sửa chữa hai đầu bằng đoạn Klenow. (1). Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất  ARN thông tin của sinh vật bậc cao thuờng có đuôi (3’ end) là một chuỗi các gốc A (poly-A). Như vậy mồi để tổng hợp sẽ là một chuỗi các gốc T ( oligo-dT). Enzim xúc tác quá trình này là enzim phiên mã nguợc (reverse transcriptase). Nguyên liệu: dNTP ( bao gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP) . Có thể tóm tắt quá trình làm như sau: Người ta tách riêng mARN nhờ các tổ hợp ologonucleotid chỉ chứa deoxythimidin (Oligo dT). Người ta gắn các oligo (dT) trong phiễu chiết. Sau đó chiết xuất toàn bộ ARN của tế bào gồm rARN, tARN, mARN rồi cho hỗn hợp này chảy qua phễu có gắn xellulooligo (dT) Các mARN sẽ bị giữ lại trong phễu do hình thành liên kết bổ sung A-T. Sau đó ta dùng dung dịch muối NaCl để đẩy tARN và mARN ra khỏi phễu. Cuối cùng dung dịch đệm Tris EDATA cho chảy qua phễu, các mARN sẽ được giải phóng do liên kết A-T bị phân giải. Dùng mARN này làm khuôn với sự có mặt của enzyme sao chép ngược cùng với các nguyên liệu , quá trình tổng hợp DNA sẽ xảy ra, kết quả sẽ thu được cDNA. (1). Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất Sau khi tổng hợp xong sợi 1 của ADN bổ trợ, lúc này sợi 1 của ADN bổ trợ vẫn còn kết cặp với ARN thông tin bởi liên kết hydro ( hỗn hợp 2 sợi ARN và ADN này gọi là heteroduplex) Nguời ta gây biến tính (đun sôi) thể lai mRNA-cDNA để cắt RNA bằng RNase H của E. coli tại một số điểm ngẫu nhiên nào đó. Xử lý enzim Rnase-H để làm đứt sợi m-RNA trong cặp heteroduplex bao gồm m-RNA + cADN sợi 1 (2). Tổng hợp sợi cADN thứ 2   Thông thường, đầu tận cùng 3’ của các cDNA sợi đơn có khả năng tạo thành các cấu trúc vòng cặp tóc (hairpin loop) và vì thế có thể được sử dụng để làm mồi (primer) cho quá trình tổng hợp sợi cDNA thứ hai bằng DNA polymerase I của E. coli hoặc reverse transcriptase . Đoạn Klenow của DNA polymerase I thiếu hoạt tính exonuclease 5'-3' cũng được sử dụng thành công để tổng hợp sợi cDNA thứ hai. (3). Cắt vòng cặp tóc của cDNA sợi đôi   Sau khi tổng hợp cDNA hoàn toàn, sợi thứ nhất và thứ hai được liên kết cộng hóa trị bởi vòng cặp tóc và vòng cặp tóc dễ bị cắt bởi nuclease S1. Sau đó, đoạn cDNA được sửa chữa bằng enzyme Klenow,kết quả là hai đầu tận cùng là đầu bằng. Sợi đôi cDNA sau đó được tách thành các tiểu phần theo kích thước và các phân tử lớn nhất được gắn vào các plasmid của vi khuẩn. Hoặc là một tập hợp đầy đủ các kích thước của cDNA sợi đôi được tạo dòng trong bacteriophage l để xây dựng thư viện cDNA (cDNA library).  Tuy nhiên, việc đưa các đầu bằng vào vector sẽ gây khó khăn trong việc lấy chúng ra khỏi vector một cách nguyên vẹn sau này. Do đó các linker thường được nối vào hai đầu của các cDNA nhờ DNA ligase. Linker là những đoạn nucleotide ngắn có chứa vị trí nhận biết của một loại RE (ví dụ: EcoRI) được tổng hợp nhân tạo tương ứng với vị trí nhận biết RE (ví dụ: EcoRI) của vector. Sau đó, các cDNA mang linker và vector sẽ được cắt bởi cùng một enzyme (ví dụ: EcoRI). Nhờ đó các cDNA và vector đều có đầu sole tương đồng (đầu dính) và cDNA sẽ dễ dàng gắn cũng như lấy ra khỏi vector một cách nguyên vẹn. 3. Các bước lập thư viện cADN trong bacteriophage l vector      1. Chọn lọc kích thước của cDNA 2. Gắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage l 3. Phân tích các đoạn chèn cDNA 4. Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh 5. Khuếch đại thư viện cDNA (1). Chọn lọc kích thước của cDNA  cDNA sau khi cắt hạn chế được phân đoạn bằng sắc ký cột Sepharose để loại bỏ những linker thừa và các phân tử cDNA có kích thước nhỏ hơn 500 bp. Cột sắc ký thường có kích thước 27´0,3 cm thích hợp cho việc phân đoạn các cDNA. (2). Gắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage l   Thông thường cần phải tiến hành thử một loạt các phản ứng gắn và phản ứng đóng gói. Trong các phản ứng này, một lượng không đổi của các nhánh bacteriophage l được gắn với các lượng khác nhau của cDNA, mục đích là để xác định lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5´ 106 bacteriophage tái tổ hợp. Phản ứng gắn cần được thiết kế sao cho tối thiểu một bacteriophage tái tổ hợp đơn sẽ chứa nhiều hơn một phân tử cDNA bằng cách dùng tỷ lệ của các nhánh được phosphoryl hóa và cDNA để chỉ 5% bacteriophage được tái tổ hợp. Nếu sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa, thì các bacteriophage không tái tổ hợp bị ức chế hiệu quả, và vì thế không thể xác định lượng cDNA cần thiết để tạo ra một quần thể bacteriophage chứa 5% thể tái tổ hợp.