Tài liệu Bài giảng thực hành hóa sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------ BÀI GIẢNG THỰC HÀNH HÓA SINH TS. Nguyễn Hoài Hương CN. Bùi Văn Thế Vinh Dùng cho sinh viên ngành Môi trường và Công nghệ Sinh học Năm xuất bản: 2009 MỤC LỤC Trang Giới thiệu môn học 4 Quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm Hóa 5 sinh 1. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 5 2. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm 6 Cách pha chế các dung dịch dùng trong thí 8 Bài 1 nghiệm Hóa sinh I Lý thuyết 8 1. Dung dịch 8 2. Dung dịch đệm 14 II Thực hành 20 III Bài nộp 20 Bài 2 Định lượng đường khử bằng phương pháp Acid 21 dinitro-salicylic (DNS) I Lý thuyết 21 1. Định nghĩa 21 2. Nguyên tắc 21 3. Xử lý mẫu 21 Thực hành 22 1. Dụng cụ - hóa chất 22 2. Tiến hành thí nghiệm 23 3. Tính kết quả 24 III Bài nộp 24 Bài 3 Định lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp 25 II Kjeldahl I 1. Lý thuyết 25 Định nghĩa 25 2 2. Nguyên tắc 26 Thực hành 26 1. Dụng cụ - hóa chất 26 2. Tiến hành thí nghiệm 27 3. Tính kết quả 28 III Bài nộp 28 Bài 4 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 30 I Lý thuyết 30 1. Định nghĩa 30 2. Nguyên tắc 30 Thực hành 31 1. Dụng cụ - hóa chất 31 2. Tiến hành thí nghiệm 31 3. Tính kết quả 32 III Bài nộp 32 Bài 5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 33 I Lý thuyết 33 1. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme 33 2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 34 3. Enzyme amylase và phương pháp xác định hoạt 35 II II tính II III Thực hành 36 1. Dụng cụ - hóa chất 36 2. Tiến hành thí nghiệm 36 3. Tính kết quả 38 Bài nộp 38 Tài liệu tham khảo 39 3 GIỚI THIỆU MÔN HỌC Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính của học phần lý thuyết hóa sinh cơ sở. 1. Giới thiệu phòng thí nghiệm hóa sinh, cách pha chế các dung dịch dung trong thí nghiệm hóa sinh ; 2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS); 3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl; 4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford; 5. Xác định hoạt tính enzyme amylase. 4 QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH I. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 1. An toàn khi làm việc với axit: Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng với các hơi axit tự do. Khi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp. Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng tay và kính bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn. Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng. H2SO4: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng, sử dụng khẩu trang và găng tay để tránh phòng khi văng acid Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay, kính bảo hộ. 2. An toàn khi làm việc với kiềm Kiềm có thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp. Mang găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc. Thao tác trong tủ hút, mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm. Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da, mang găng tay cao su, khẩu trang, thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. Hơi amoniac dễ cháy, phản ứng mạnh với chất oxy hoá, halogen, axit mạnh. Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kim loại nặng: Ag, Pb, Zn ... và muối của chúng. Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO2, halogen, axit mạnh, dẫn xuất clo của hydrocacbon. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. Cần mang dụng cụ bảo vệ da mắt. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate, cho vào từ từ. Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. Tương tự khi hoà tan với nước, đồng thời phải làm lạnh nhanh. Oxit canxi rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước, cần bảo vệ da mắt, đường hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit. 5 Natri và kali hydroxyt: rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước. Các biện pháp an toàn như trên, cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại. II. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm 1. Hoá chất thí nghiệm: Các hoá chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, ... trong phòng thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm. Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na, MgO, NaOH, KCl, (CH 3COO)2...; lỏng (H2SO4, aceton, ethanon, chloroform, ...) hoặc khí (Cl2, NH3, N2, C2H2 ...) và mức độ tinh khiết khác nhau: - Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90% - Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99% - Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99% Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu. 2. Nhãn hiệu hoá chất: Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi tên hoá chất, công thức hóa học, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng phân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản. 3. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất: Khi làm việc với hóa chất, nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức cẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau: - Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ, vô cơ, muối, acid, bazơ, kim loại, ...) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm. - Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước khi dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu. - Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp, cổ chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai. - Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối. 6 - Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay, không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất. - Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. Khi cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi,... phải đưa vào tủ hút, chú ý đậy kín nắp sau khi lấy hóa chất xong. - Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không ngửi hay nếm thử hóa chất. - Khi làm việc với acid hay base mạnh: Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nước vào acid hay base); Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ống bóp cao su. Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base). Nếu bị bắn vào mắt, dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%. Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày, nếu là acid phải súc miệng và uống nước lạnh có MgO, nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có CH3COOH 1%. Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm: 7 BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM HÓA SINH I. Lý thuyết 1.1. Dung dịch Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về mặt vật lý và hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. Nếu chất hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất. Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịch khan. Phần lớn các dung dịch acid, base, muối trong phòng thí nghiệm là dung dịch nước, dùng dung môi là nước. Một số chất khác tan trong dung môi hữu cơ. Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. Có nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị, phân tích và tính toán khác nhau. 1.1.1. Các đơn vị nồng độ dung dịch a) Nồng độ phần trăm, (%) i) Nồng độ phần trăm khối lượng - khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan có trong 100g dung dịch. Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl ii) Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch. Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4 iii) Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml dung dịch. Ví dụ: dung dịch glycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerine. b) Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch. c) Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam (hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch. Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam KH2PO4. 8 d) Nồng độ đương lượng (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lit dung dịch. Số đương lượng chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z) Hệ số đương lượng (z): phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà chất đó tham gia. i) Nếu phản ứng là phản ứng acid, base: z là số ion H+ hay OH- mà 1 phân tử, ion của chất đó tác dụng vừa đủ. Ví dụ: Phản ứng giữa HCl và NaOH H2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 H2O H2SO4 → 2 H+  z = 2 NaOH → 1 OH-  z = 1 ii) Nếu phản ứng là phản ứng ôxy – hóa khử: z là số electron mà 1 phân tử, ion của chất đó cho hay nhận. Ví dụ: 2 Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2 NaI I + 1e → I-  z = 1 S2+ - 1e → S+  z = 1 e) Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan có mặt trong dung dịch. f) Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng : - Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch - Miligam phần trăm, mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch. - Microgam phần trăm, µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch. - Phần nghìn, 0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch. - Phần triệu, ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch. - Phần tỷ, ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch. 1.1.2. Cách pha dung dịch có nồng độ xác định a) Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng, % (w/w) i) Chất tan là chất rắn khan: Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w) 100g dung dịch cần 40g NaOH 500g dung dịch cần X g? 9 Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml) Vậy, cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất, hòa tan ta được 500g dung dịch NaOH 40% ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O;...) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn. Ví dụ: Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4.5H2O M(CuSO4) = 160 và M(CuSO4.5H2O) = 250 Lượng CuSO4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g Lượng CuSO4.5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml) Vậy, cân 50g CuSO4.5H2O, đong 270ml nước cất, hòa tan ta được 320g dung dịch CuSO4 10%. b) Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn: Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g Vậy, đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%, hòa tan ta được 500g NaOH 5% c) Pha dung dịch bão hoà: Lấy chất tan cần pha vào becher, thêm một ít nước cất và khuấy cho tan. Nếu sau khi khuấy, chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch bão hòa. Nếu chất tan tan hết, thêm chất tan và tiếp tục khuấy, cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nữa. d) Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích i) Chất tan là chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết, chuyển sang bình định mức, dùng nước cất hòa tan và định mức đến thể tích đúng. Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v) Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g 10 Vậy, cân 50g NaCl, hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất, ta được 1 lít dung dịch NaCl 5%. ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O;...) Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống như ở phần a. iii) Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2SO4 ... Việc cân không thuận lợi, có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức V = M/d V: Thể tích chất lỏng; M: khối lượng chất lỏng cần cân; d: tỷ trọng chất lòng Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất mà là các dung dịch đậm đặc. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích và thay đổi tùy theo loại hóa chất. Ví dụ như H2SO4: 95-98%; HCl: 37%; H3PO4: 6585%; NH4OH: 25%. Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất này ta phải chú ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc. Ví dụ: Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml) Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4,4g Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4,4)/37 = 11,9g = 11,9/1,19 = 10 ml Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml Vậy, dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%, và 430ml nước cất ta được 440 ml HCl 1% Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thí nghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khối lượng - thể tích (w/v). e) Pha dung dịch nồng độ phân tử gam i) Chất tan là chất rắn khan Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó, ta tính khối lượng phân tử chất đó (hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan, qua phễu cho vào bình định mức có dung tích 1 lít. Cho vào từng lượng nước cất nhỏ, lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức. Chuyển dung dịch sang bình chứa, lắc để trộn đều đồng nhất. 11 Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức. Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch KOH 1M Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56 Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g Vậy, cân 56g KOH, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 1000. Đây là phản ứng tỏa nhiệt, cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít. Nếu muốn pha dung dịch 2M; 3M hay 0,1M; 0,05M ta cũng tiến hành tương tự với lượng cân tương ứng. Ví dụ: Pha 500ml dung dịch KCl 3M Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35,5 = 74,5 Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74,5 *3*500)/1000 = 111,75g Vậy, cân 111,75g KCl, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 500, định mức đến vạch. ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước: khi tính lượng chất tan cần cân phải tính luôn cả khối lượng các phân tử nước. iii) Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào nồng độ dung dịch đó. Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37% Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35,5 = 36,5 Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36,5*100)/37 = 98,65g Hay 98,65/1,19 = 83ml Vậy, đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước. Định mứ c thành 1 lít. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độc hại. f) Pha nồng độ đương lượng (N) Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách pha dung dịch nồng độ phân tử gam (M). 1.1.3. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch 12 Khi pha hóa chất, có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch không chính xác như việc cân đong không chính xác, các hóa chất không tinh khiết hay bị hút ẩm. Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa, bị oxy hóa, dung môi bay hơi, vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dung dịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal) a) Dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. Các chất dùng trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổi nhanh chóng theo thời gian. Pha dung dịch chuẩn, ta phải dùng ống chuẩn. Ống chuẩn là một ống ampun thủy tinh hay nhựa đóng kín. Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặc dung dịch chất tan. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống. Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn : - Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức. - Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl, AgNO3, acid oxalic, ... có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha, pha loãng và định mức tới thể tích đúng. - Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3, ... không thể pha ngay được dung dịch chuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ. Ví dụ: NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước, HCl dễ bay hơi, Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí. b) Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung dịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp. 13 Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0,1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N để chuẩn độ lại. Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Xét một phản ứng trung hòa acid - base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam OH-. Do đó: C1V1 = C2V2 Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta có hệ số hiệu chỉnh K: K= Cp/Ct = Vp/Vt Ví dụ: Dung dịch chuẩn là H2SO4 0,1N, dung dịch định pha là NaOH 0,1N. Lấy 10ml H2SO4 0,1N cho vào erlen, thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien, dùng burette chuẩn độ bằng NaOH được 11 ml NaOH Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0,1)/11 = 0,091 N Hệ số điều chỉnh K: K= 0,091/0,1 = 10/11 = 0,91 1.2. Dung dịch đệm: 1.2.1. Định nghĩa dung dịch đệm pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein vì một số amino acid có mạch nhánh phân ly (COO- và NH4+ tạo liên kết ion). Họat động tối ưu của protein phụ thuộc vào cấu trúc không gian nhất định trong môi trường, nghĩa là phụ thuộc vào tỉ lệ phân ly của mạch nhánh thành ion, hay nói tóm lại là phụ thuộc vào pH môi trường. Dung dịch đệm là dung dịch có pH không thay đổi nhiều lắm khi một lượng nhỏ acid (H+) hoặc base (OH-) được thêm vào. Như vậy, dung dịch đệm bao gồm một cặp acid base liên hợp (acid yếu và muối của acid yếu này hoặc base yếu và muối của base này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch. Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau. Thí dụ, để có đệm pH ở giá trị 4.75, chọn cặp acid - base CH3COOH (0,1M)/CH3COONa (0,1M). Nếu thêm vào dung dịch 0.001 mol HCl thì pH của hệ vẫn chỉ ở mức 4.748 gần bằng 4.75. Nghĩa là pH thay đổi rất ít. 14 Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng, ví dụ như ổn định pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate. Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1 dung dịch là không có vấn đề gì. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào ứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng có hại. Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử. Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Ví dụ: muối natri acetate), dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau: CH3COOH + H2O -----> CH3COO- + H3O+ Có dung dịch khác chẳng hạn, chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: ammoniac) với muối của nó (Ví dụ: muối amoni clorua),trong dung dịch cân bằng có dạng sau: NH3 + H2O ----------> NH4+ OH- + Dung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base. Khi thêm một lượng acid mạnh (H3O+), base liên hợp kết hợp với nó cho acid yếu (cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch)  pH của dung dịch giảm không đáng kể. Trái lại, khi thêm một lượng base mạnh (OH-), acid điện li cho H3O+ (cân bằng chuyển dịch theo chiều thuận), ion hidroni H3O+ trung hòa OH- cho base yếu H2O. Kết quả pH của dung dịch tăng không đáng kể. Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base liên hợp có trong hỗn hợp. 1.2.2. Cách pha một số dung dịch đệm thường dùng a) Dung dịch đệm borat: - Dung dịch acid boric (a): 12,404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch borat (b): 19,108 g Na2B4O7.10H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml Dung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và dung dịch (b) theo bảng dưới đây: A b pH a 15 b pH 9,80 0,2 6,60 6,50 3,50 8,20 9,70 0,6 6,77 6,00 4,00 8,31 9,40 0,6 7,09 5,50 4,50 8,41 9,00 1,0 7,36 5,00 5,00 8,51 8,75 1,25 7,50 4,50 5,50 8,60 8,50 1,50 7,60 4,00 6,00 8,69 8,00 2,0 7,78 3,00 7,00 8,84 7,70 2,30 7,88 2,00 8,00 8,98 7,50 2,50 7,94 1,00 9,00 9,11 7,00 3,00 8,08 0,00 10,0 9,24 b) Dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2) - Dung dịch acid citric 0,1M (a): 21,01 g C6H8O7.H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch trinatri citrate 0,1M (b): 29,41 g C6H5O7Na3.2H2O hòa tan và dẫn nước đến 1000 ml. Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau: A b pH A b pH 46,5 3,50 3,0 23,0 27,0 4,8 43,8 6,20 3,2 20,5 29,5 5,0 40,0 10,0 3,4 18,0 32,0 5,2 37,0 13,0 3,6 16,0 34,0 5,4 35,0 15,0 3,8 13,7 36,3 5,6 33,0 17,0 4,0 11,8 38,2 5,8 31,0 19,0 4,2 9,5 40,5 6,0 28,0 22,0 4,4 7,2 42,8 6,2 25,5 24,5 4,6 - - - 16 c) Dung dịch đệm phosphate (pH = 5,7 – 8,0) - Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O hoặc 71,7 g Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml. a b pH A b pH 93,5 6,50 5,6 45,0 55,0 6,9 92,0 8,00 5,8 39,0 61,0 7,0 90,0 10,0 5,9 33,0 67,0 7,1 87,7 12,3 6,0 28,0 72,0 7,2 85,0 15,0 6,1 23,0 77,0 7,3 81,5 18,5 6,2 19,0 81,0 7,4 77,5 22,5 6,3 16,0 84,0 7,5 73,5 26,5 6,4 13,0 87,0 7,6 68,5 31,5 6,5 10,5 89,5 7,7 62,5 37,5 6,6 8,50 91,5 7,8 56,5 53,5 6,7 7,00 93,0 7,9 51,0 49,0 6,8 5,30 94,7 8,0 d) Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5,0 – 8,0) - Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23,9 g Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9,07 g KH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b). 17 a b pH a b pH 10 990 5,0 372 628 6,6 18 982 5,2 492 508 6,8 30 970 5,4 612 388 7,0 49 951 5,6 726 274 7,2 79 921 5,8 818 182 7,4 121 879 6,0 885 115 7,6 184 816 6,2 936 64 7,8 264 736 6,4 969 31 8,0 e) Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6) - Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch HCl 0,2 M (b): 16,8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml. X pH X pH 5,0 3,6 16,8 2,8 6,4 3,4 24,2 2,6 8,2 3,2 32,4 2,4 11,4 3,0 44,0 2,2 f) Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6) - Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch NaOH 0,2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml. 18 X pH X pH 4,0 8,6 22,4 9,6 6,0 8,8 72,2 9,8 8,8 9,0 32,0 10,0 12,0 9,2 38,6 10,4 16,8 9,4 45,5 10,6 g) Dung dịch đệm acetate (pH = 3,6 – 5,6) - Dung dịch acid acetic 0,2M (a): 11,55 ml CH3COOH đặc và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4 g CH3COONa hoặc 27,2 g CH3COONa.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml dung dịch (b) và định mức đến 100 ml. a b pH A b pH 46,3 3,7 3,6 20,0 30,0 4,8 44,0 6,0 3,8 14,8 35,2 5,0 41,0 9,0 4,0 10,5 39,5 5,2 36,8 13,2 4,2 8,8 41,2 5,4 30,5 19,5 4,4 4,8 45,2 5,6 25,5 24,5 4,6 h)Dung dịch đệm vạn năng 0,1M - Dung dịch acid acetic 0,1M (a): 5,7 ml CH3COOH đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml. - Dung dịch acid phosphoric 0,1M (b): 6,45 ml H3PO4 đậm đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml. - Dung dịch acid ortho-boric 0,1M (c): hòa tan 6,18 g acid ortho-boric trong nước cất và định mức đến 1000 ml. 19 - Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH trong nước cất và định mức đến 1000 ml. Trộn lẫn các dung dịch (a), (b), (c) với thể tích bằng nhau nhận được dung dịch đệm 0,1M có pH = 1,8. Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trong khoảng pH = 1,8 đến pH = 12,0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d). Các dung dịch đệm vạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự. II. Thực hành Sinh viên pha dung dịch đệm và một số dung dịch sử dụng trong các bài thí nghiệm sau theo hướng dẫn của giảng viên. III. Bài nộp 1. Ghi chép phương pháp pha các dung dịch thực chuẩn bị. 2. Làm các bài tập sau: 1. Pha 1 L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân …..g NaOH khô 2. Pha 0,5 L dung dịch H2SO4 2M cần bao nhiêu ml H2SO4 đậm đặc, biết rằng H2SO4 đđ là acid 97% có M=98 g/mol, tỉ trọng d=1,84 g/ml. Nồng độ mol của H2SO4 đđ là: Thể tích H2SO4 cần sử dụng là: Lượng nước cần bổ sung là : 3. Pha 250 ml dung dịch CuSO 4 1 M, cân …….g CuSO4.5H2O 4. Pha 1 L dung dịch H2SO4 0.1N từ dung dịch H2SO4 2M: 5. Pha 500 g dung dịch NaOH 10% từ dung dịch NaOH 40% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X = Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y = Lượng nước cất thêm vào: 6. Pha 500 ml dung dịch HCl 2% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml) Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X= Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = Lượng nước cất thêm vào: 20