Tài liệu Bài giảng-thực hành công nghệ lên men

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương - 2009 - 1 - NỘI DUNG THỰC HÀNH Bài 1 : Lên men bia (25 tiết) Bài 2 : Sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men/ kết hợp hóa giải (20 tiết) Bài 3: Sản xuất yoghurt (15 tiết) 2 Bài 1: Lên men bia A. Lý thuyết I. Giới thiệu Bia là loại đồ uống có cồn và có gas đã có từ cổ xưa, thơm ngon và bổ dưỡng. Công nghệ sản xuất bia đã xuất hiện trên thế giới hàng ngàn năm vào được du nhập vào Việt Nam hơn một trăm năm nay. Bia là đồ uống bắt nguồn từ Ai Cập cổ đại Độ cồn trong bia thấp (3-8%) và nhờ có CO2, khi rót bia tạo nên nhiều bọt gây sảng khoái khi uống. Giá trị dinh dưỡng của bia khá cao, trong bia có nhiều vitamin nhóm B và các nguyên tố vi lượng. Vì vậy công nghệ sản xuất bia không ngừng phát triển và hoàn thiện trên thế giới. II. Nguyên liệu và thiết bị 3 1. Nguyên liệu: a) Có thể sản xuất bia thuần túy từ malt (đại mạch nảy mầm) hoặc có bổ sung thế liệu (gạo, đại mạch…) để giảm giá thành. Khi nấu malt ở nhiệt độ thích hợp, tinh bột malt sẽ được hệ enzyme amylase (alpha và beta amylase) gọi chung là diastase thủy phân thành đường maltose. Đại mạch (Hordeum distichum) Hạt đại mạch b) Hoa bia (hoa houblon): là nguyên liệu cơ bản thứ hai đứng sau malt trong công nghệ sản xuất bia. Hoa bia làm cho bia có vị đắng dịu, hương thơm đặc trưng và làm tăng khả năng tạo và giữ bọt. Thành phần chính của hoa bia mà ta quan tâm là các chất đắng gồm acid đắng và nhựa đắng; tannin; tinh dầu. Trong công nghệ sản xuất bia người ta sử dụng trực tiếp hoa bia hoặc chế phNm từ hoa bia bột hoa hay cao hoa bia. c) Nấm men Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces carlsbergensis là hai loại nấm men thường được sử dụng để lên men bia. Các loài nấm men lên men bia thuộc loại yếm khí tùy tiện. Khi có oxy chúng tăng sinh khối nhờ hô hấp tế bào, khi không có oxy chung lên men tạo thành ethanol và CO2 theo phương trình: 4 Đường + Nitơ amine tự do + Nấm men + Oxy → Ethanol + CO2 + Nấm men (150 g/l) + (150 mg/l) (1g/l) (25 mg/l) (45g/l) (42g/l) (5g/l) Đặc tính lên men của hai loài nấm men này có nhiều điểm khác nhau dùng để lên men các loại bia khác nhau Đặc tính Nhiệt độ lên men Cơ chất Nấm men nổi Saccharomyces cerevisiae Loại bia: Ale 10-25oC Nấm men chìm Saccharomyces carlsbergensis Loại bia: Lager 0-10oC Chủ yếu lên men đường đơn (glucose, fructose), đường đôi (saccharose, maltose), khó lên men đường tam (raffinose) Khả năng lên Lên men mạnh trên bề mặt môi men trường Khả năng tạo Kết bông trên bề mặt, bia khó bông, kết lắng trong tự nhiên Lên men tốt glucose, mannose, galactose, fructose, saccharose, maltose và cả raffinose. Lên men mạnh trong lòng môi trường Kết chùm lắng xuống đáy, bia trong tự nhiên Cấu tạo tế bào nấm men 5 Khun lạc nấm men (x 100) a) Nấm men lên men nổi b) Nấm men lên men chìm c) Nấm men dại d) Phụ gia Làm giảm độ cứng của nước: Al2(SO4)3, CaSO4; Điều chỉnh pH = H2SO4, acid lactic, CaCl2 Chất chống oxy hóa: acid ascorbic Chất tạo màu: caramen. III. Yêu cầu chất lượng (TCVN7042:2002) Bảng 1 – Yêu cầu cảm quan của bia hơi Tên chỉ tiêu Yêu cầu 1. Màu sắc Đặc trưng của từng loại sản phNm 2. Mùi Đặc trưng của bia sản xuất từ hoa houblon và malt đại mạch, không có mùi lạ 3. Vị Đặc trưng của bia sản xuất từ hoa houblon và malt đại mạch, không có vị lạ 4. Bọt Bọt trắng, mịn 5. Trạng thái Đặc trưng của từng loại sản phNm Bảng 2 – Yêu cầu đối với các chỉ tiêu hoá lý Tên chỉ tiêu Mức 1. Độ axit, số mililit NaOH 1 N trung hòa hết 100 ml bia hơi 1,8 đã đuổi 6 hết CO2, không lớn hơn 2. Hàm lượng diaxetyl, mg/l, không lớn hơn 3. Hàm lượng etanol (cồn), % (V/V) 0,2 Theo tiêu chuNn đã được công bố của nhà sản 4. Hàm lượng chất hoà tan ban đầu xuất Chỉ tiêu về kim loại nặng, vi sinh (xem TCVN7042:2002) IV. Sơ đồ công nghệ lên men bia malt thuần túy Các quá trình chính trong công nghệ lên men bia: 1. Nấu bia: tinh bột dưới tác dụng của enzyme amylase trong malt (hoạt lực diastase …). Khi nấu bia có thể liệu cần bổ sung enzyme để tăng vận tốc đường hóa. Enzyme thường sử dụng: Termamyl nguồn gốc vi khuNn, chịu nhiệt. Giản đồ nấu là đồ thị hướng dẫn quá trình nấu: sự thay đổi nhiệt độ theo thời gian. Các giai đoạn trong quá trình nấu bia: Malt: nước trộn theo tỉ lệ 1:4 rồi đưa nhiệt độ lên 38 – 40oC trong 30 min. Điều chỉnh pH về 5,5 bằng H2SO4. Khi này các enzyme hemicellulase, glucanase, protease được hoạt hóa thủy phân glucan hoặc protein phức tạp bao quanh hạt tinh bột tạo điều kiện cho enzyme amylase thủy phân tinh bột. Nâng nhiệt độ lên 52oC giữ 30 min: quá trình enzyme protease thủy phân protein thành amino acid và peptide tạo nguồn dinh dưỡng cho nấm men. Thành phần này c hiếm 5-7% chất hòa tan của dịch đường. Ngoài ra thành phần này còn giúp bia có hương vị đậm đà, có khả năng giữ bọt. 7 Nâng nhiệt độ lên 65oC giữ nhiệt độ trong 30 min để enzyme amylase hoạt động thủy phân tinh bột thành các đường có khả năng lên men. Nâng nhiệt độ lên 72oC giữ ở 20 min để enzyme amylase hoạt động Nâng nhiệt độ lên 78oC giữ 30 min rồi lọc. Điều kiện hoạt động của các enzyme trong malt: Đường hóa kết thúc khi p hản ứng giữa iod và tinh bột cho thấy màu iod không bị thay đổi. 2. Lọc rửa bã Rửa bã bằng nước nóng 76oC 3 lần Bảo đảm lượng nước trong dịch đường Rửa đến khi nồng độ chất hòa tan trong nước rửa bã còn 0,3-0,5% thì ngưng. 3. Nấu hoa: 8 Mục đích: Bất hoạt enzyme malt Thanh trùng dịch đường Trích ly hoa bia Đông tụ protein trong dịch đường Hình thành hương vị và màu Hình thành các chất khử chống oxy hóa trong giai đạon tiếp theo Giảm pH dịch đường Tiến hành: Nâng nhiệt lên 76 – 78oC giữ 10 min để đường hóa nốt phần tinh bột còn lại Đun sôi dịch đường 10 min thì cho ½ hoa bia vào tạo vị đắng. Trước khi kết thúc 10 min cho ½ hoa bia vào tạo hương. 3. Làm lạnh nhanh: đưa nhanh chóng dịch đường sau khi nấu hoa về nhiệt độ lên men 9 4. Nhân giống nấm men: Cần bổ sung Zn và N. Môi trường giống khởi động càng giống môi trường lên men chính càng tốt. Sục khí hoặc lắc đóng vai trò quan trọng. 10 Ống thạch nghiêng (rửa bằng môi trường vô trùng) 10 ml YEPG 24 h, 20oC 100 ml YEPG 3 ngày lắc 25oC 2 L YEPG 3 sục khí 25oC 20 L dịch đường 3 ngày lắc 25oC (Môi trường: YEPG: yeast extract 5g/l; peptone 10 g/ l; glucose 20 g/l) 5. Cấy giống Tỉ lệ cấy giống tối ưu là 6-10.106 tế bào/ml men nổi; 10-14.106 tế bào/ml men chìm. Dịch đường càng đậm đặc tỉ lệ cấy giống phải càng cao. 6. Lên men chính Hiện nay lên men theo mẻ vẫn là phương pháp thịnh hành. Sau đây là đồ thị tăng trưởng của nấm men trong lên men bia. 11 Số lượng tế bào Thời gian (giờ) I) Pha lag: Nấm men hấp thụ toàn bộ oxy có trong dịch đường, tổng hợp enzyme cần thiết, tổng hợp sterol. Pha lag xảy ra trong vòng một vài giờ sau khi cấy giống. Nếu môi trường giai đoạn nhân giống trước giống giai đoạn hiện tại pha lag sẽ ngắn. II) Pha tăng tốc: tế bào tăng trưởng và phân chia. ChuNn bị lên men. Tổng hợp glycogen. III) Pha lũy thừa: tế bào sinh sản và trao đổi chất cực đại. Chu kỳ phân chia 90-180 phút. Bắt đầu lên men. Số lượng nấm men có thể tăng 1000 lần trong vòng 24 giờ. Tỉ lệ cấy giống ảnh hưởng đến mức độ phân chia của tế bào. Nếu cấy giống ở tỉ lệ thích hợp 5-15. 106 tế bào/ml và phân chia 3 lần (số lượng tế bào tăng 8 lần) thì thu được 80-100.106 tế bào. 100.106 tế bào/ml là nồng độ nấm men cao nhất trong dịch đường lên men. Lên men cũng xảy ra rất mạnh và có hiện tượng trào bọt. IV) Pha giảm tốc: xảy ra 12-24 giờ sau khi cấy giống. Khi đó oxy đã hết, chỉ còn quá trình lên men sinh CO2. Bọt trào mạnh. Lên men cực đại xảy ra trong vòng 12-48 giờ, sinh nhiệt và CO2. 12 V) Pha cân bằng động: các chất dinh dưỡng lên men cạn kiệt. Nấm men không còn tăng trưởng mà bắt đầu kết bông. Sterol và glycogen được tổng hợp và dự trữ trong các pha trước đó bắt đầu được sử dụng. Kéo dài pha này dẫn đến tự phân nấm men. Thời gian Biến đổi sinh học Biến đổi sinh hóa Giai đoạn hiếu Nấm men tăng Thủy phân đường đôi khí: 3 h sau khi trưởng nảy chồi thành đường đơn cấy nhờ oxy còn lại Đường phân trong thiết bị, hô Tổng hợp glucogen hấp tỏa nhiệt đạt Tổng hợp acid béo và cực đại, xuất hiện sterol nhiều bóng khí to Sử dụng nguồn N Nồng độ đường hữu cơ vô cơ để tăng giảm nhanh trưởng Lên men Sinh C2H5OH và CO2 Áp suất tăng Giai đoạn kị khí : Biến đổi vật lý Nhiệt độ tăng và các sản phNm phụ trong đó ester đóng vai trò tạo hương Các thông số cần theo dõi trong quá trình lên men chính: - Hàm lượng đường oBr, pH - pH đầu là 5,2-5,6 - pH cuối lên men chính còn 4,4-4,5 do H2CO3 sinh ra - Nồng độ ethanol Nồng độ ethanol 2% nấm men phát triển bình thường Nồng độ ethanol 2% - 5%: nấm men giảm tăng trưởng Nồng độ ethanol > 5 % nấm men chấm dứt tăng trưởng nhưng vẫn lên men Nồng độ ethanol =12% nấm men chấm dứt lên men Thời gian lên men: 7 – 10 ngày phụ thuộc vào độ cồn và pH. 13 Kết thúc quá trình lên men chính ta thu được bia non, mùi vị còn nồng, cảm quan chưa đạt. 7. Quá trình lên men phụ: Quá trình lên men phụ là quá trình - các phản ứng enzyme và phi enzyme diễn ra dẫn đến ổn định chất lượng bia, - các hợp chất tạo hương quan trọng hình thành - diacetyl bị phân hủy xuống tới dưới mức quy định 0,2 mg/l là chỉ tiêu quyết định thời gian lên men phụ. - Bão hòa bia bằng CO2 để tăng vị và khả năng tạo bọt, ức chế sự phát triển của vi sinh vật có hại. Tiến hành: Sau khi tách men, hạ nhiệt đô dịch xuống 0-1oC, duy trì áp suất 0.9 – 1.2 mg/cm2, ngưng thu hồi CO2 khi quá trình lên men phụ diễn ra 15 ngày. Kết thúc quá trình lên men phụ nồng độ đường còn lại cỡ 1,9 oBr, tách nốt phần nấm men còn lại. Bia sau khi lên men được bơm qua thiết bị lọc. B. Thực hành I. Nguyên liệu: Malt nghiền : 5 kg Cao hoa : 1 g Nấm men Saccharomyces carlsbergensis (lên men chìm) II. Dụng cụ: a) Phòng thí nghiệm vi sinh đại cương: đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, máy lắc, buồng đếm hồng cầu, kính hiển vi… 14 Buồng đếm hồng cầu b) Phòng thí nghiệm m hóa sinh: Máy so màu c) Phòng thí nghiệm m công ngh nghệ: Dụng cụ đo hàm lượng ng chấ chất khô Phù kế (Tỉ trọng kế) Brix kế (khúc xạ kế) 15 Bộ chưng cất cồn Nồi nấu malt ổn nhiệt Bình lên men bia có khóa khí III. Nội dung thực hành 1. Chun bị men giống 16 Men chìm lấy từ bồn lên men chính của nhà máy bia Vinaken, cấy trên môi trường Hansen. Môi trường nhân giống YEPG hoặc dịch malt đường hóa Ống thạch nghiêng → ống nghiệm 10 ml YEPG → bình tam giác 100 ml dịch malt đường hóa. Giống phải đạt số lượng tế bào 15-20.107 tế bào/ml. 2. Chun bị nguyên liệu: Xay malt bằng máy xay phòng thí nghiệm. 3. Quy trình nấu: Malt : nước = 1: 4 nấu theo quy trình mô tả ở phần lý thuyết theo giản đồ sau: Đường hóa đến khi thử với iod không đổi màu. 4. Lọc qua vải lọc (lọc nóng) 5. Nấu hoa bia: Lượng cao hoa sử dụng: 0,02% 6. Làm lạnh nhanh về nhiệt độ lên men 8 oC 7. Cấy giống Bảo đảm cấy giống vô trùng Đếm tế bào cấy giống dùng buồng đếm hồng cầu <221> sao cho đạt 14.107 tế bào/ml 17 Xác định tỉ lệ sống của tế bào nấm men nếu sử dụng nấm men từ lần lên men trước bằng phương pháp nhuộm xanh methylen rồi đếm trong buồng đếm hồng cầu <223>. Tế bào sống không bắt màu, tế bào chết bắt màu. Nếu sử dụng nấm men từ đợt lên men trước phải sục khí dịch đường. Tỉ lệ cấy giống 1: 10. 8. Lên men chính Trong phòng thí nghiệm lên men trong bình tam giác 1 L miệng bình bao bằng quả bóng cao su. Để đạt nhiệt độ lên men 8oC, để bình lên men trong tủ lạnh (kiểm soát nhiệt độ). Kiểm tra dịch đường trong thời gian lên men Hàm lượng đường (độ Brix), pH. 9. Thu hoạch bia non Sau lên men chính hạ nhiệt độ xuống 2oC để lên men phụ và kết lắng nấm men. Nấm men kết lắng được thu hồi và bảo quản 8oC. Trước khi sử dụng phải kiểm tra tỉ lệ sống của nấm men. 10. Phân tích Tài liệu “Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men”, PGS.TS Lê Thanh Mai, NXBKHKT, Hà Nội 2007 a) Phân tích nguyên liệu Xác định độ m malt (%): mục 2.1 <19>. Sấy malt nghiền đến trọng lượng không đổi ở 105oC rồi cân Độ Nm W% = (mo-m)/mo x 100 % Xác định độ hòa tan của malt (%): (mục 2.4 <20>) Độ hòa tan của malt là lượng chất khô trong malt có thể hòa tan vào dung dịch trong điều kiện phòng thí nghiệm và biểu thị theo tỉ lệ phần trăm so với trọng lượng của malt. Đó là hàm lượng chất hòa tan của dịch đường sau khi đường hóa và lọc bã malt. 18 Độ hòa tan của malt: E1(%)= e(W+800)/(100-e) W = độ Nm malt, % e = hàm lượng chất hòa tan của dịch đường, % (theo khối lượng) 800 = lượng nước cất dùng để đường hóa 100 g malt, ml Độ hòa tan của malt tính theo chất khô tuyệt đối: E2(%)= E1x 100/(100-W) Xác định hàm lượng chất hòa tan của dịch đường (e) ở 20oC (% chất khô) Hàm lượng chất hòa tan của dịch đường được tính từ tỉ trọng của dịch đường đo ở 20oC dựa trên bảng Phụ lục 1 (<265>) b) Phân tích dịch đường trước, Xác định tỉ trọng của dịch đường (d2020) = Tỉ trọng của dịch đường so với nước ở 20oC Đo bằng tỉ trọng kế rồi tra Phụ lục 4 (<301>) hiệu chỉnh về 20oC, hoặc Đo bằng Brix kế (Hình) rồi tra Phụ lục 2 (<299>) hiệu chỉnh về 20oC, tra Phụ lục 8 (<306>) hiệu chỉnh về tỉ trọng. Xác định năng lực đường hóa của malt (hoạt tính diastase của malt): đo hoạt động tổng hợp của enzyme alpha và beta amylase (<27>) Các enzyme trong malt được chiết với nước ở 40oC và dùng để thủy phân dung dịch tinh bột chuNn. Lượng đường khử tạo thành nhờ hoạt động của enzyme amylase được tính theo phương pháp iod. Kết quả được tính bằng số g maltose tạo thành từ 100 g malt ở điều kiện chuNn. Hoạt tính diastase được tính theo đơn vị WK (Windish-Kolbach) Hoạt tính diastase của mẫu: DP1 = F(V -V ) VB = thể tích Na2S2O3 dùng để chuNn độ iod dư trong mẫu trắng (đối chứng) 19 VT = thể tích Na2S2O3 dùng để chuNn độ iod dư trong mẫu thực (thí nghiệm) F = hệ số chuyển đổi để tính kết quả theo 100 g malt dùng chiết enzyme. Xác định độ lên men biểu kiến của dịch đường Độ lên men biểu kiến là độ lên men khi đo hàm lượng chất hòa tan trong dịch lên men khi chưa đưổi rượu và CO2. Độ lên men biểu kiến = (E1-E2)/E1x100, trong đó: E1: lượng chất hòa tan (g) trong 100 ml dịch đường trước khi lên men; E2: lượng chất hòa tan biểu kiến (g) trong 100 ml dịch đường đã lên men. Độ lên men thực Độ lên men thực là độ lên men khi đo hàm lượng chất hòa tan trong dịch lên men khi đã đuổi hết rượu và CO2. Có thể tính độ lên men thực theo công thức sau: Độ lên men thực= độ lên men biểu kiến x 0,81. Phân tích nồng độ rượu Xác định nồng độ rượu của bia: chưng cất và sử dụng cồn kế đo nồng độ rượu Phương pháp chưng cất (chính xác nhất) <112>. Đo nồng độ rượu bằng cồn kế: sử dụng cồn kế (phù kế có thang nồng độ rượu) bia non sau khi đã chưng cất cồn. 11. Tính toán Ví dụ: Malt: độ Nm, ví dụ 6%, hệ số hòa tan, ví dụ 70% Tính lượng nước sử dụng để đường hóa nhằm đạt dịch đường 12oBr: Lượng chất khô của malt 5 kg x 0,94 = 4,7 kg Lượng chất chiết từ malt là: 5 kg x 0,94 x 0,70 = 3,29 kg 20