Tài liệu Bài giảng Chương 4: Các thử nghiệp Sinh Hóa

Chương 4 Các thử nghiệm sinh hóa GV: Nguyễn Văn Hạnh Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh VSV  Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa.  Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV:  ◦ Cách truyền thống ◦ Sử dụng các bộ KIT ◦ Sử dụng các thiết bị tự động Thử nghiệm khả năng lên men    Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn CH của các VSV Nguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid  giảm pH môi trường Các loại carbonhydrate ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose … Dicarbonhydrate: sucrose, lactose … Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO Các loại đường rượu: chứa chức -OH Phenol Red Carbohydrate Broth Trang 104 Trypticase 10g NaCl Cao thịt Phenol red (7,2ml của dung dịch phenol red 0,25%) 5g 1g Carbohydrate* 1g Hấp ở 115oC trong 15 phút 0,018g Thử nghiệm khả năng lên men  Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm  VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH  thay đổi màu chất chỉ thị phenolred  Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng  Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ Thử nghiệm Citrate Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy nhất.  Cở sở sinh hóa: ◦ VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm hóa MT ◦ VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT  Thử nghiệm Citrate Môi trường Simmon citrate agar (tr. 105) Ammonium dihydrogen phosphate Dipotassium hydrogen phosphate NaCl Sodium citrate MgSO4 Bromothymol blue Agar 1.0g 1.0g 5g 2g 0,2g 0,08g 13g Thử nghiệm Citrate  Chú ý - Cấy lượng sinh khối vừa đủ - Có đối chứng trắng đi kèm Đối chứng trắng Pứ âm tính Pứ dương tính Thử nghiệm Urease  Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease  Cơ sở sinh hoá: (NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2  tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng – đỏ)  Môi trường sử dụng: ◦ Urea Broth (Rustigian – Stuart) ◦ Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng) Môi trường Urea Broth Urea 20g Cao nấm mem 0,1g Na2HPO4 9,5g K2HPO4 9,1g Phenol red 0,01g Nước cất 1 lít Thử nghiệm Urease  Thực hiện ◦ Chuẩn bị môi trường ◦ Cấy VSV vào 5ml môi trường ◦ ủ 37oC/24 giờ ◦ Quan sát Thử nghiệm khả năng sinh H2S Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2S  Cơ sở sinh hóa:  Acid amin chứa S Thiosulfate desulfohydrase thiosulfate reductase H2S H2S  H2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS) Thử nghiệm khả năng sinh H2S Để phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae và giống Proteus  Môi trường sử dụng:  ◦ KIA, TSI (thạch nghiêng) ◦ SIM, PIA (thạch sâu) ◦ BSA (thạch đĩa) Cấy vsv lên môi trường Ủ (37oC, 24 – 48h) Thử nghiệm khả năng sinh H2S  (+) (-) Đọc kết quả: Xuất hiện màu đen trong môi trường Không xuất hiện màu đen trong môi trường ĐC (+) Thử nghiệm khả năng sinh H2S Pancreatic digest of casein (casitone) 20.0 g Peptic digest of animal tissue (beef extract) 6.1 g Ferrous ammonium sulfate 0.2 g Sodium thiosulfate 0.2 g Agar 3.5 g (-) (+) (+) Thử nghiệm khả năng sinh Indol  Mục đích Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các VSV có hệ emzym tryptophanase 37oC / 24h Thuốc thử Kovac’s Chủng VSV MT canh trypton Pứ dương tính Pứ âm tính Thử nghiệm khả năng sinh Indol  Là phản ứng giúp phân biệt ◦ E. coli (+) với Klebsiella (-) ◦ Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+) ◦ Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-) …  Đối chứng (+) Proteus rettgeri (-) Serratia marcescens Thử nghiệm KIA/TSI  KIA: Kligler iron agar (trang 99) Pepton Lactose Glucose NaCl Feric ammonium citrate Sodium thiosulphate Agar Phenol red Nước cất pH 7,4±0,2 20g 20g 1g 5g 0,5g 0,5g 15g 0,025g 1 lít Thử nghiệm KIA/TSI  TSI: Triple sugar iron agar (trang 106) Pepton Lactose Sucrose Glucose NaCl Feric ammonium sulphate Sodium thiosulphate Agar Phenol red Nước cất pH 7,4±0,2 20g 10g 10g 1g 5g o,2g 0,2g 13g 0,025g 1 lít