Tài liệu Ảnh hưởng của ph nước rửa tới chất lượng tiêu bản nhuộm pas

  • Số trang: 43 |
  • Loại file: DOC |
  • Lượt xem: 93 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 27125 tài liệu

Mô tả:

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển vượt bậc của nền Y học Thế giới nói chung và Y học Việt Nam nói riêng, hiện nay có rất nhiều phương pháp dùng để hỗ trợ chẩn đoán bệnh với độ chính xác cao như: các phương pháp chẩn đoán hình ảnh như CT-scan,PET/CT , chụp cộng hưởng từ MRI…hay các xét nghiệm cận lâm sàng như Hóa sinh, Vi sinh, Huyết học, Sinh học phân tử và Mô bệnh học… Là một bộ phận quan trọng của khoa học những tổn thương, xét nghiệm tế bào-mô bệnh học nghiên cứu những tính chất, đặc điểm của tổn thương, thuộc phạm vi tổ chức và tế bào. Nó còn cho phép tìm hiểu những nguyên nhân gây ra những tổn thương ấy, giải thích cho cơ chế sinh bệnh cũng như những quy luật phát sinh, phát triển của tổn thương, phục vụ cho bệnh nhân và công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học. Trong bệnh học, đây là xét nghiệm có độ tin cậy cao, độ chính xác lớn, nếu như kỹ thuật tiến hành đúng quy tắc và người đọc có kinh nghiệm nhất định. Trong chẩn đoán mô bệnh học, việc đánh giá các tổn thương trên tiêu bản nhuộm Hematoxylin-Eosin là nền tảng chẩn đoán. Bên cạnh đó, Bộ môn Giải Phẫu Bệnh trường Đại học Y Hà Nội vẫn xem kỹ thuật nhuộm Periodic Acid Shiff là một trong số những kỹ thuật nhuộm hàng ngày. Tuy nhiên kết quả nhuộm vẫn bị âm tính giả,dương tính giả nên ảnh hưởng tới chẩn đoán và chỉ định điều trị của bác sĩ. Là một sinh viên cử nhân kỹ thuật y học, em chọn đề tài: “Ảnh hưởng của pH nước rửa tới chất lượng tiêu bản nhuộm PAS” làm khóa luận với mục tiêu sau: 2 1. Thực hiện thành thạo kỹ thuật nhuộm Periodic Acid Shiff và các kỹ thuật nhuộm thường quy khác. 2. Bước đầu đánh giá được sự bắt màu của chất nhầy qua sự ảnh hưởng của pH nước rửa và một số yếu tố ảnh hưởng. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ POLYSACCHARIDE [4] Chất nhầy và glycogen được coi như là hai thành phần chính của carbohydrate có trong mô, trong đó chất nhầy là thành phần lớn nhất, bao gồm 'mucopolysaccharides', 'mucosubstances' và 'glyconjugates’. Thuật ngữ đầu tiên là 'mucin' đã được nói đến trong cuốn sách của một công dân người Mỹ tên là Carpenter từ năm 1846 ( Mercer 1978). Nhiều thuật ngữ sau thay đổi thành 'mucins' phụ hợp với tính chất phức tạp của các chất này bắt đầu xuất hiện. Vai trò chuyển hóa trong cơ thể được thực hiện bởi glycogen với tiền chất là glucose, nhưng các chức năng chính xác của chất nhầy vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ. Hầu hết các bề mặt tế bào được phủ một lớp chất nhày có chức năng chính là bôi trơn, nhưng có ý kiến cho rằng lớp chất nhầy phủ này cũng tạo ra một môi trường thuận lợi cho sự khuếch tán các phân tử ion. Bằng chứng đã được chứng minh bởi sự tăng kết dính của tế bào với sự tham gia của mucins đặc trưng được xác định trên bề mặt tế bào (Rambourg 1971). Các báo cáo khác được công nhận (Parsons & Mulholland 1978) đã chỉ ra rằng lớp màng chất nhầy biểu mô trong bàng quang có thể tác động chống dính trên vi khuẩn làm cho chúng bị cuốn trôi bởi dòng nước tiểu. Các chất bắt đầu được các tác giả tiến hành nghiên cứu từ giữa thế kỷ XIX, nghiên cứu glycogen của Bernard, và mucin từ sụn (sau này được gọi là "chondroitinsulphate ') được nghiên cứu bởi Fischer & Boedeker. Giữa thập niên 1930 'lyoglycogen' và 'desmoglycogen’, các hình thức hòa tan và không hòa tan tương ứng được mô tả đặc điểm bởi Willstatter & Raldenward, cũng 4 vào khoảng thời gian đó, axit hyaluronic được xác đinh bởi Palmer & Meyer. Những năm 1930 Blix đã được phân tách được chất nhầy biểu mô quan trọng là 'sialic' hoặc axit 'neuraminic' trong khi đó mặc dù cố gắng phân loại các chất nhầy của mô liên kết nhưng không thể tìm ra mãi cho tới cuối những năm 1950. Hầu hết các kỹ thuật trước đó sử dụng iode hoặc nhuộm lạc sắc phức tạp nhưng ngày nay các kỹ thuật đó đã dần được cải tiến thành những kỹ thuật chuẩn, chẳng hạn như Carmine của Best năm 1906, periodic acid Schiff (PAS) của McManus (1946), Alcian blue bởi Steedman và aldehyde fuchsin của Gomori đều vào năm 1950… Trong bệnh lý cũng vậy, những bất thường đặc biệt của quá trình chuyển hóa carbohydrate đã được nghiên cứu và phân loại; các mucopolysaccharidoses 'đầu tiên được mô tả bởi Hunter vào năm 1917 và "glycogenoses' bởi von Gierke trong năm 1929. Vào thời điểm đó, có nhiều kỹ thuật sử dụng gọi là "hóa mô” đã được so sánh với các phương pháp “kinh nghiệm”, mặc dù có tương đối ít thông tin về những gì sẽ xảy ra khi thuốc thử Schiff kết hợp với nhóm aldehyde. Sự kết hợp kỹ thuật xanh alcian-PAS bởi Mowry trong năm 1956, phân biệt các chất nhầy axit và trung tính đã được kiểm nghiệm và thể hiện như một kỹ thuật hữu ích để phát hiện dị sản ruột. Trong chẩn đoán u, kỹ thuật hóa mô và hóa mô miễn dịch có thể được sử dụng song song để xác định chính xác hơn loại khối u hay nguồn gốc của u, ví dụ như trong ung thư biểu mô tuyến. Gần đây, nhờ sự phát triển kỹ thuật nhân bản cDNA, đã cho kết quả phân lập được mười loại gen khác nhau, nâng cao được sự hiểu biết của chúng ta về một nửa số peptide của mucins. Những gen MUC nằm trên ít nhất là năm nhiễm sắc thể khác nhau, với một cụm trên nhiễm sắc thể 11, và mã hóa chủ yếu cho mucins tiết trong các lớp chất nhầy để bảo vệ biểu mô của đường hô hấp, vùng dạ dày - ruột và cơ quan sinh sản. Phương pháp hóa mô 5 miễn dịch và lai tại chỗ là hai kỹ thuật hữu ích mà có thể được sử dụng để cung cấp các dấu hiệu mới có giá trị trong chẩn đoán và tiên lượng. Các gen MUC quy định cho một số lượng lớn các glycoprotein liên quan tới sự bảo vệ và chức năng của mỗi một loại niêm mạc. MUC1 là mã hóa gen 'episialin', một chất nhầy màng thấy rõ trong tuyến vú, tuyến tụy và buồng trứng. MUC2 được bộc lộ mạnh trong ruột già, ruột non và MUC3 được thấy ở hỗng tràng. MUC4 được phân lập từ niêm mạc phế quản cũng như là các gen MUC5AC và MUC5B. MUC6 được phân lập từ niêm mạc dạ dày và MUC7 là một gen nhỏ được phân lập từ tuyến dưới hàm. Các nghiên cứu gần đây còn cho thấy, các chất nhầy rất quan trọng trong việc chẩn đoán nguồn gốc từ vị trí ung thư biểu mô và trình tự của các glycoprotein phức tạp giúp hé lộ thông tin mới nhằm giải thích các vai trò khác nhau của các chất nhầy trong các khối u xâm nhập. Vai trò bảo vệ của chất nhầy trong một loạt các bệnh nhiễm trùng mới đây cũng đã được nghiên cứu bao gồm các vị trí của niêm mạc dạ dày có Helicobacter pylori. 2.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT NHẦY: Chất nhầy (hay là mucins) là thành phần chủ yếu của carbonhydrat trong mô. Chất nhầy còn được gọi với những tên “Mucopolysaccharides”, “Glycosaminoglycans”(Jeanbz 1960) và “Mucosubstances”(Spicer 1965). Gần đây, tên “Glycoconjugat”(Glyco kết hợp) đã được gợi ý như một tên chung để thay thế những tên gọi trước(Reid & Clamp). Việc định nghĩa lại theo gợi ý của họ bởi glycoconjgat gồm proteoglycan và glycoprotein. Proteoglycan là những cấu trúc polypeptide cùng các nhánh bên carbohydrate không chia nhánh(glycosaminoglycan) bao gồm acid hexuronic xen kẽ với hexsoamin. 6 Glycoprotein là những cấu trúc polypeptide cùng nhánh bên carbohydrate chia nhánh, thường chứa acid sialic hoặc các gốc sulfate ở vị trí tận cùng. Các chất nhầy khác nhau có thể hiện diện một loại đơn giản trong một mô hoặc hay gặp hơn là hỗn hợp nhiều loại khác nhau. Đã có bằng chứng chỉ ra rằng chất nhầy được tổng hợp trong lưới nội bào có hạt và hoàn thành trong bộ Golgi. Sự sulfat các phân tử hexosamin cũng diễn ra ở bộ Golgi. Chất nhầy có thể phát hiện được dưới kính hiển vi điện tử và các phương pháp kỹ thuật kết hợp với các kim loại đậm điện tử hoặc ở dạng tự do hoặc một phần của các thuốc nhuộm được sử dụng như blue alcian, đỏ ruthenium và dialyzediron. Chức năng của chất nhầy còn chưa được tìm hiểu hết. Hầu hết bề mặt bên trong của cơ thể được phủ chất nhầy với chức năng bôi trơn, hình thành một môi trường thích hợp cho sự khuếch tán các phân tử và ion. Phân loại chất nhầy: Chất nhầy được phân thành hai nhóm chính: chất nhầy acid và chất nhầy trung tính - Chất nhầy acid: Gồm: Chất nhầy sulfated mạnh, chất nhầy sulfated yếu, carboxylated sialomucin, sulfated sialomucin. + Chất nhầy sulfated mạnh của mô liên kết(proteoglycans): Chất nhầy này phản ứng tại giá trị pH thấp với các thuốc nhuộm cation thích hợp và luôn luôn âm tính với PAS. Có nhiều tế bào sản xuất ra những chất nhầy sulfated này, là các nguyên bào sợi, tế bào nội mô, tế bào xương, tế bào sụn và các dưỡng bào, tế bào hình chén của đường ruột. + Chất nhầy biểu mô sulfated mạnh: 7 Loại này được phân biệt bởi nguồn gốc biểu mô. Chất nhày biểu mô sulfat mạnh được tìm thấy trong những tuyến thanh dịch của phế quản( Lamb & Reid 1970) và có thể có một phần nhỏ trong tế bào hình chén của đường ruột. Về mặt hóa mô, nó phản ứng ở nồng độ pH thấp với những thuốc nhuộm cation tương tự như những chất nhày sulfat của mô liên kết. + Chất nhầy biểu mô sulfated yếu: Chất nhầy này thuộc loại biểu mô, gồm các este sulfated polysaccharide, trong đó các gốc tự do sulfated được liên kết với những hexosamines khác nhau như glucosamine. Chúng được phân bố rộng trong mô, thường xuất hiện trong những tế bào hình chén của đại tràng. Chất nhầy sulfated yếu khác chất nhầy sulfated mạnh vì nó phản ứng với các thuốc nhuộm cation tại độ pH cao hơn một chút. + Chất nhày sulfat không điển hình về hóa mô. Là một chất nhày sulfat nhuộm dương tính với alcian blue nhưng âm tính với những kỹ thuật thông thường để phát hiện chất nhày sulfat. Chất nhày này có thể tìm thấy trong các tuyến chế nhày khí quản. + Chất nhày carboxylate (Sialomucin): Enzyme-labile: đây là một chất nhày có nguồn gốc biểu mô. Tên gọi ‘Enzyme-labile’ bởi thực tế N-acetyl sialomucins bị tiêu hóa bởi enzyme sialidase. Chúng được phân bố rộng trong cơ thể (như các tuyến dưới niêm mạc phế quản, tuyến nước bọt dưới hàm, các tế bào hình chén của ruột non) ở dạng đơn hoặc ở dạng hỗn hợp với các dạng chất nhầy khác ( bao gồm cả chất nhầy acid và trung tính). Emzym-resistant: enzyme này không bị tiêu hóa bởi enzyme sialidase và âm tính với PAS. Chúng được tìm thấy trong niêm mạc của ruột già, dạ dày và phế quản. 8 + Hyaluronic acid: đây là chất nhày gặp nhiều trong mô liên kết, được sản xuất bởi các nguyên bào sợi, chứa N-acetyl-D-glucosamine và acid Dglucuronic, không giống với các glycosaminoglycan được cho là không gắn với protein. Các gốc sulfate vắng mặt và những phản ứng kết hợp qua nhóm carboxyl trên acid glucuronic. Bởi vì acid hyaluronic và acid sialic nhuộm với các thuốc nhuộm cation ở độ pH tương tự nhau, nên phân biệt giữa chúng dựa vào phản ứng với enzyme hyaluronidase và enzyme sialidase. - Chất nhầy trung tính: Không có các nhóm phản ứng acid hiện diện trong chất nhầy trung tính. Nó gồm các hexosamin khác nhau liên kết cùng các nhóm hexo tự do. Đây là chất nhầy có nguồn gốc biểu mô và có nhiều nhất trong các tuyến Brunner và các biểu mô phủ của dạ dày. Ngoài ra nó cũng có mặt ở các tế bào hình chén của hệ hô hấp, tiêu hóa và tuyến tiền liệt. 2.3 ĐẠI CƯƠNG VỀ GLYCOGEN Glycogen là một polysaccharide đơn giản bao gồm các chuỗi phân nhánh hoặc chuỗi thẳng mà các đơn vị D-glucose, và có thể được nhìn thấy bằng kính hiển vi điện tử dưới hai hình thức chủ yếu: - Alpha: nhìn thấy như hình hoa thị hoặc cụm hạt beta đường kính khoảng 60-250nm. - Beta: nhìn thấy những hạt tự do hoặc là một phần của một hình hoa thị và có đường kính 20-40nm. Ngoài ra còn có loại thứ ba, hay gamma, hình thức đã được mô tả trong gan chuột (De Bruijn, 1973) và là một glycogen không hạt được tìm thấy giữa hạt beta trong hoa hồng alpha. Glycogen gamma chỉ nhìn thấy khi kali ferixianua được kết hợp vào một tetroxide cố định osmium, người ta cho rằng một hợp chất được hình thành là giảm phản ứng với các nhóm hydroxyl của glycogen. 9 Trong điều kiện bình thường, glycogen trong tế bào tìm thấy với số lượng lớn, nhất là trong gan, cơ tim và xương, trong nang lông (có số lượng đáng kể), các tuyến nội mạc tử cung, âm đạo và biểu mô vẩy cổ tử cung (số lượng thay đổi theo ảnh hưởng phụ thuộc hormon). Dây rốn, tế bào trung biểu mô, bạch cầu và bạch cầu trung tính, nguyên mẫu tiểu cầu cũng chứa glycogen. Đây được coi là glycogen tồn tại trong mô trong một môi trường protein, chứ không phải là liên kết hóa học với protein (Meyer & Jeanloz, 1943). 2.4 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF: Periodic acid Schiff là một phương pháp nhuộm được sử dụng khá phổ biến trong mô bệnh học để phát hiện polysaccharides như glycogen, mucosubstances, như glycoprotein, glycolipid và chất nhày trung tính, nấm trong mô. 1.4.1. Quy trình lấy, cố định,pha, chuyển, đúc bloc, cắt và dán mảnh cắt: - Lấy bệnh phẩm: hai yêu cầu cơ bản, trước tiên của việc lấy bệnh phẩm là lấy trúng và lấy đủ. + Lấy được bệnh phẩm trúng vùng tổn thương cần xét nghiệm là vấn đề không đơn giản và không phải bao giờ cũng thực hiện được. Vì vậy xác định được vùng tổn thương cần phải cân nhắc và ít nhiều đòi hỏi kinh nghiệm của bác sĩ lâm sàng. Nên lấy bệnh phẩm ở nhiều vị trí khác nhau và lặp lại xét nghiệm khi kết quả âm tính. + Lấy đủ chủ yếu là lấy đủ thành phần, đủ lượng mô tối thiểu cần cho việc chuẩn đoán. Vừa lấy được mô bình thường (hay tương đối bình thường) lẫn mô bệnh trên cùng một sinh thiết. Ngoài ra, đối vơi smootj số tổn thương có tình chất chuyển tiếp hoặc có những giai đoạn phát triển khác nhau, phải lấy bệnh phẩm vừa ở nhiều vị trí, vừa ở những thời điểm khác nhau. 10 - Cố định: là làm bất động những cấu trúc của mô cũng như tế bào nhưng vẫn tôn trọng tới mức tối đa hình thái của chúng. Nói khác đi, cố định một mô là làm giết chết những thành phần của mô đó nhưng vẫn bảo quản chúng trong một tình trạng gần với lúc sống nhất. Trừ một số trường hợp cần nhuộm tươi hay cần nghiên cứu về enzym, nuôi cấy tế bào thì nói chung, mọi bệnh phẩm cần cố định ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể.Cố định không tốt làm giảm hẳn chất lượng xét nghiệm và sự cố định hỏng là không thể sửa chữa được. - Pha bệnh phẩm: Không được làm giập nát bệnh phẩm: khi pha không được dùng kẹp có mấu, lưỡi dao pha phải sắc, mỏng và dài, cắt một chiều không được ray đi ray lại trên một vị trí của bệnh phẩm và bệnh phẩm khi pha phải được đặt trên một miếng lie, gỗ hoặc plastic. Các mẫu bệnh phẩm dùng trong kỹ thuật mô học thường được cắt dày từ 3 - 5 mm. Với bệnh phẩm mềm (não,…) có thể cố định vài giờ cho cứng sau đó mới pha lại. Trong trường hợp chuyển đúc bằng máy, bệnh phẩm không được cắt dày hơn chiều cao của lòng khuôn nhựa. - Chuyển bệnh phẩm: Cố định bệnh phẩm mới chỉ giết chết tế bào và giữ cho nó những thành phần bất động trong trạng thái tĩnh. Nhưng nếu đưa bệnh phẩm này cắt mỏng ngay thì mối liên quan giữa tế bào và tổ chức cũng như cấu trúc tế bào bị thay đổi do tác động của lưỡi dao vào bệnh phẩm. Để giải quyêt vấn đề này, người ta đưa ra một chất nền cho bệnh phẩm, chất đó vừa làm khuôn giữ bệnh phẩm vừa xâm nhập vảo trong tế bào giữ cho thành phần cũng như tổ chức được giữ nguyên vị trí khi cắt mảnh, đó là sự vùi. - Đúc block: có hai yêu cầu cơ bản là: bệnh phẩm định hướng mô học đúng và thao tác phải nhanh để bệnh phẩm, paraffin và cassette gắn kết vững chắc. 11 - Cắt và dán mảnh: Để quan sát được hình dạng, cấu trúc của mô hoặc tế bào dưới kính hiển vi thì sau khi trải qua các quy trình cố định, chuyển, đúc còn phải cắt thành những mảnh có độ dày một vài μm để ánh sáng có thể đi qua được. Một mảnh cắt được coi là đạt yêu cầu nếu mảnh cắt mỏng đều; không gấp, xước hoặc rách; còn nguyên khuôn paraffin quanh bệnh phẩm; kích thước của bệnh phẩm to gần bằng thật. trước khi nhuộm cần tãi mảnh cắt và dán mảnh cắt trên một nền trong suốt như phiến kính, phiến nhựa. muốn mảnh cắt dính vào nền có thể dùng một chất dính hoặc nước lã. Mảnh cắt được đặt ở 2/3 của lam kính từ dưới lên (1/3 của lam kính từ trên xuống dùng để ghi mã số bệnh nhân. Phía 2/3 dùng để dán nhãn sau khi nhuộm và lúc này bệnh phẩm nằm ở chính giữa lam kính. 2.4.1 Nguyên tắc của phương pháp nhuộm PAS: Dùng một tác nhân oxy hóa là acid periodic (HIO4) để phá vỡ mối liên kết của hai nguyên tử cacbon trong một số nhóm hóa học (các nhóm glycol 12, hydro-1, amino-2, hydroxy-1, alkylamino-2, hydroxyl-1, ceto-2,…) làm xuất hiện các nhóm aldehyde (-CHO). Các nhóm aldehyde này được nhìn thấy nhờ phản ứng với thuốc thử Schiff (fuchsin basic không màu bởi acid sulfureux) tạo thành hợp chất có màu đỏ.[1][4] - Sơ đồ phản ứng + HIO4 = Một mắt xích Dialdehyde 12  _ D _glucose 1-amino-2-hydroxy+ HIO4 = Dialdehyde Hình 1: Sơ đồ biểu diễn sự oxi hóa của acid periodic với một mắt xích α-Dglucose và một mắt xích 1-amino-2-hydroxy để tạo thành dialdehyde. Các aldehyde này được phát hiện bởi thuốc thử Schiff do Dialdehyde không bền vững, không màu được hình thành màu của sản phẩm cuối cùng bằng cách phục hồi các nhóm quinoid chromophoric và tạo thành màu đỏ tươi của sản phẩm cuối cùng [1] [4] 13 Hình 2: Cơ chế phản ứng của thuốc thử Schiff với các gốc dialdehyde tạo thành hợp chất có màu đỏ 2.4.2 Phương pháp nhuộm PAS và chẩn đoán lâm sàng: Phương pháp nhuộm PAS được sử dụng giúp cho việc chẩn đoán một số bệnh: - Bệnh dự trữ glycogen. - Ung thư tuyến thường tiết chất nhày trung tính. - Bênh Paget của vú. - Sarcoma phần mềm dạng nang. - Nhuộm các đại thực bào trong bệnh Whipple. - Nó có thể được sử dụng để chẩn đoán thiếu hụt α1-antitrypsin nếu xung quanh tĩnh mạch cửa của gan dương tính với phương pháp nhuộm này. - Tập hợp các lymphocytes có PAS dương tính với sự có mặt của Mycosis fungoidesand trong lớp biểu bì hội chứng Sezary còn được gọi là vi áp xe Pautrier ( tập hợp nhiều bạch cầu đơn nhân trong lớp biểu bì đặc trung u lympho ác tình ở da đặc biệt bệnh mycosis fungoides.) 14 - Erythroleukemia, bệnh bạch cầu non trong máu ngoại vi. Những tế bào này khi nhuộm fuchsia bắt màu sáng. - Phế nang phổi có protein ( tích tụ protein thừa). - Nhiễm nấm, thành tế bào của nấm có màu đỏ tươi, nó chỉ bắt màu những bào tử nấm còn sống. Ngược lại, phương pháp nhuộm ngấm bạc (methenamine silver) của Grocott nhuộm được cả nấm sống và nấm đã chết. - Còn được sử dụng để xác định glycogen trong mẫu sinh thiết phổi của trẻ sơ sinh trong bệnh glycogenosis phổi kẽ (PIG).[5] 15 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU: Đối tượng nghiên cứu: bao gồm các bệnh phẩm sau phẫu thuật của mô gan và mô dạ dày. Trong quá trình nghiên cứu , chúng tôi thu thập 35 mẫu bệnh phẩm, trong đó có 9 mẫu mô gan và 26 mẫu sinh thiết dạ dày. Tiêu chuẩn chọn mẫu: Các mô có chế nhày hoặc glycogen (sau khi đã nhuộm HE để kiểm tra). Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Giải Phẫu Bệnh, trường Đại Học Y Hà Nội 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Phương pháp mô tả cắt ngang 2.2.2 Tiến hành:  Cố định: bệnh phẩm cắt dày không quá 5mm và được cố định tối đa 24h ở nhiệt độ phòng trong dung dịch formaldehyde 10% được pha như sau: Formaldehyde 37-40% ……………………………….100ml Nước cất 2 lần………………………………………...900ml  Bệnh phẩm sau khi cố định được chuyển bằng máy chuyển STP 120  Đúc block bằng máy đúc Microm AP280-2  Cắt tiêu bản bằng máy cắt Microm HM315 Mỗi block bệnh phẩm cắt làm 6 mảnh cắt, mỗi mảnh dày 3 µm và được dán lên 6 lam kính sạch, 3 tiêu bản được nhuộm với thuốc thử Schiff pha theo hướng dẫn của tài liệu “ Kỹ thuật hiển vi học thông thường”, 3 tiêu bản được nhuộm với thuốc thử Schiff của hãng Sigma. Sau đó được mang nhuộm PAS với nước rửa sau bước phản ứng với thuốc thử Schiff có pH lần lượt là 16 pH1 = 4, pH2 = 7, pH3 = 10  Chuẩn bị thuốc nhuộm: + Pha thuốc thử Schiff theo hướng dẫn của tài liệu “ Kỹ thuật hiển vi học thông thường”: Hòa tan 1g fuchsin basic trong 200ml nước cất đun sôi( nước phải được đựng trong bình nón đun sôi trước khi cho thêm fuchsin vào), lắc mạnh cho tan hết. Để nguội tới 500C đem lọc. Thêm vào đó 2ml acid chlohydric nguyên chất. Tiếp tục để nguội đến 250C cho thêm 2g potassium metabisulfated và trộn đều. Để dung dịch 24 giờ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Dung dịch chuyển màu vàng rơm hoặc không màu thì sử dụng. Bảo quản trong lọ tối màu, kín khí ở 40C Cách kiểm tra thuốc thử Schiff mua của hãng cung như thuốc thử Schiff tự pha: Cho 10ml dung dịch formaldehyde trong ống đong, cho thêm vài giọt Schiff, nó sẽ chuyển sang màu đỏ tím ngay lập tức. bỏ thuốc thử Schiff nếu nó chuyển sang màu hồng khi bảo quản trong tủ lạnh. Kết tủa trắng ở dưới đáy của dung dịch Schiff có thể tan được bằng cách làm ấm nhẹ và khuấy đều dung dịch. Sử dụng thuốc thử Schiff phải hết sức cẩn trọng vì basic fuchsin được biết là một chất dễ gây ung thư. + Pha dung dịch acid periodic Acid periodic 1g Nước cất 200ml Hòa tan hoàn toàn thành dung dịch đồng nhất. Dán nhãn, viết tên dung dịch và ngày pha. 17 + Đo pH dung dịch nước rửa tiêu bản bằng máy đo pH HI 2211  Tiến hành kỹ thuật: + Tẩy parafill bằng xylen: 3 lần x 2 phút/lần. + Chuyển vào bể cồn 1000, 950, 850 mổi bể 2 phút + Rửa nước chảy 5 phút. (*) + Oxy hóa carbonhydrat trong dung dịch acid periodic 1% trong 10 phút làm xuất hiện các nhóm aldehyd. + Rửa nước chảy 5 phút. + Cho phản ứng với thuốc thử Schiff từ 2-5 phút. + Biệt hóa trong nước rửa có pH1=4, pH2=7, pH3=10 trong 15 phút. + Nhuộm nhân trong hematoxylin từ 30s- vài phút. + Rửa nước chảy 5 phút. + Tẩy trong cồn acid vài giây. + Rửa nước chảy 10 phút. + Loại nước bằng cồn 950,1000 + Làm trong qua 3 bể toluene. + Gắn bôm Canada. (Nếu muốn phát hiện glycogen thì sau bước (*) cần một tiêu bản làm chứng bằng cách cho tiêu bản chứng thủy phân 1h trong Diastase 1% ở 370C hoặc enzym amylase, còn tiêu bản kia làm song song với tiêu bản chứng, nhưng ngâm 1h trong nước cất ở 370C. sau đó nhuộm các bước tiếp theo của (*) bình thường. Kết quả: Nếu tiêu bản chứng (-) còn tiêu bản kia (+) thì chất cần tìm là glycogen. Nếu tiên bản chứng (+), tiêu bản kia (+) thì chất cần tìm không phải là glycogen.) 2.2.3 Đánh giá kết quả nhuộm PAS: Kết quả nhuộm: 18 Glycogen, màng đáy: màu đỏ tươi. Nhân tế bào: màu xanh xanh đen. Nấm,chất nhầy: màu hồng, đỏ thẫm. Chất nền: màu ve. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng tiêu bản nhuộm PAS như sau: - Dương tính: sản phẩm cuối cùng có màu đỏ tươi. - Dương tính yếu: Sản phẩm cuối cùng có màu đỏ yếu. - Âm tính: Sản phẩm cuối cùng không có màu. - Dương tính giả: Sản phẩm cuối cùng bào tương và những vùng xung quanh chất nhày, glycogen cũng bắt màu đỏ tươi. - Âm tính giả: Sản phẩm cuối cùng không bắt màu kể cả vùng chứa chất nhày trung tính hoặc glycogen. 2.1.4. Đánh giá chất lượng tiêu bản: theo ba mức độ.  Tiêu bản tốt: Tiêu bản có sự bắt màu tương phản rõ ràng. Tiêu bản quan sát rõ chất nhày trung tính, màng đáy, các hạt glycogen. Tiêu bản cắt mỏng, không gấp, xước, rách, tiêu bản sạch, trong, không có bọt khí,…  Tiêu bản đạt yêu cầu: Có thể quan sát được chấy nhày, màng đáy, hạt glycogen trên tiêu bản nhuộm. Tiêu bản chưa có tương phản màu sắc rõ ràng, còn có lỗi kỹ thuật như gấp, cước, rách, mất mô, tiêu bản bẩn, có bọt khí,…  Tiêu bản không đạt yêu cầu: Không hoặc khó quan sát thấy chất nhày, màng đáy và hạt glycogen. Không có sự tương phản màu sắc.  Tiêu bản gặp nhiều lỗi kỹ thuật: gấp, cước, rách, mất mô, tiêu bản bẩn, có bọt khí,… gây khó khăn cho việc đọc tiêu bản. 19 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đánh giá kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt bằng nước rửa sau bước nhỏ thuốc thử Schiff mua của hãng Sigma với pH1 = 4, pH2 = 7, pH3 = 10. Bảng 3.1. Đánh giá kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt bằng nước rửa sau bước nhỏ thuốc thử Schiff mua của hãng Sigma với pH1 = 4, pH2 = 7, pH3 = 10. Dương tính pH1 = 4 N % 33 94.29% pH2 = 7 N % 33 33 94.29 Dương tính yếu Dương tính giả Âm tính Âm tính giả Tổng số 0 2 0 0 35 0% 5.71% 0% 0% 100% % 0 2 0 0 35 pH3 = 10 N % 94.29 % 0% 5.71% 0% 0% 100% 0 2 0 0 35 0% 5.71% 0% 0% 100% Nhận xét: Kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt mô chế nhày hoặc chứa glycogen bằng nước rửa sau bước nhỏ thuốc thử Schiff mua của hãng Sigma với pH = 4. pH= 7, pH= 10 đều có kết quả giống nhau với 94.29% (33/35) tiêu bản dương tính, 5.71% (2/35) tiêu bản dương tính giả, không có tiêu bản dương tính giả, âm tính và âm tính giả. 20 3.2. Đánh giá kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt bằng nước rửa sau bước nhỏ thuốc thử Schiff pha theo hướng dẫn của tài liệu “ Kỹ thuật hiển vi học thông thường” trong vòng 1 tuần sau khi pha với pH 1 = 4, pH2 = 7, pH3 = 10. Bảng 3.2. Đánh giá kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt bằng nước rửa sau bước nhỏ thuốc thử Schiff pha theo hướng dẫn của tài liệu “ Kỹ thuật hiển vi học thông thường” trong vòng 1 tuần sau khi pha với pH1 = 4, pH2 = 7, pH3 = 10. Dương tính Dương tính yếu Dương tính giả Âm tính Âm tính giả Tổng số pH1 = 4 N % 30 85.71% 4 11.43% 0 0% 0 0% 1 2.86% 35 100% pH2 = 7 N % 27 77.15% 6 17.14% 0 0% 0 0% 2 5.71% 35 100% pH3 = 10 N % 27 77.15% 6 17.14% 0 0% 0 0% 2 5.71% 35 100% Nhận xét: Kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt mô chế nhày hoặc chứa glycogen bằng nước rửa sau bước nhỏ thuốc thử Schiff pha theo hướng dẫn của cuốn “Kỹ thuật hiển vi học thông thường” với pH = 4 có 85.71% (30/35) tiêu bản dương tính, 11.43% (4/35) tiêu bản dương tính yếu, 2.86% (1/35) tiêu bản âm tính; pH = 7 có 77.15% (27/35) tiêu bản dương tính, 17.14% (6/35) tiêu bản dương tính yếu, 5.71% (2/35) tiêu bản âm tính; pH = 10 có 77.15% (27/35) tiêu bản dương tính, 17.14% (6/35) tiêu bản dương tính yếu, 5.71% (2/35) tiêu bản âm tính. Ở cả 3 độ pH của nước rửa đều không có tiêu bản dương tính giả và âm tính. 3.3 Đánh giá chất lượng tiêu bản nhuộm: Bảng 3.3. Đánh giá chất lượng tiêu bản nhuộm
- Xem thêm -