Tài liệu Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố ciguatoxins trong chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ kép (lc ms ms)

Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Phương Nga LỜI CẢM ƠN Để luận văn này đạt kết quả tốt đẹp, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đào Việt Hà và TS. Phạm Đức Thịnh đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi chân thành cảm ơn đề tài Nghiên cứu độc tố của một số loài cá rạn và thân mềm có nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam (mã số: KHCBBI.02/18-20) của Viện Hải dương học đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực hiện Luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa Học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Phòng Quản lý Tổng hợp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết. Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của Lãnh đạo Viện Hải dương học cũng như các anh chị em trong phòng Hóa sinh trong quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Phương Nga Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt AcOH : Acetone ACN : Acetonitril ATTP : An toàn thực phẩm APCI : Atmospheric pressure chemical ionization CFP : Ciguatera Fish Poisoning CTX : Ciguatoxin CTXs : Ciguatoxins DW : Distilled water đvdt : Đơn vị diện tích ESI : Electrospray ionization EI : Electron ionization FAB : Fast-atom bombardment HR-FABMS : High-resolution fast atom bombardment mass spectrometry H-NMR : Proton NMR spectroscopy COSY : Correlated Spectroscopy GC : Gas chromatography HPLC : High-performance liquid chromatography HRMS : High Resolution Mass Spectrometry IP : Identification point IS : Ion spray LC : Liquid Chromatography LOD : Limit of Detection LOQ : Limit of Quantitation MeOH : Metanol MeCN : Acetonitrile MRM : Multi Reaction Monitoring MS : Mass spectrometry NĐTPB : Ngộ độc thực phẩm biển PTN : Phòng thí nghiệm RF : Radio frequency SIM : Selected Ion Monitoring SPE : solid phase extraction SRM : Selected Reaction Monitoring TFA : Trifluoroacetic acid TEM : Temperature Danh mục các bảng Bảng 1.1. Các độc tố ciguatoxins và ion phân tử tương ứng phân tích bằng sắc ký khối phổ………………………………………………...……………17 Bảng 2.1. Định danh và ký hiệu mẫu......................................................................................25 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện chiết rút đối với dịch chiết........…..36 Bảng 3.2. Thời gian lưu của mẫu trong phép phân tích với pha tĩnh là Agillent……………..………………………………………………….……41 Bảng 3.3. Thời gian lưu của mẫu trong phép phân tích với pha tĩnh là Wakosil………………………………………………………………………43 Bảng 3.4. Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Agilent Poroshell 120 ECC18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi)……………………………....45 Bảng 3.5. Hàm lượng CTXs trong các mẫu Chình biển ở Việt Nam và Nhật Bản………………………………………………………………………...…48 Bảng 3.6. Kết quả so sánh phương sai các mẫu cơ tại Việt Nam và Nhật Bản…………………………………………………………………………...50 Bảng 3.7. Kết quả so sánh phương sai các mẫu gan tại Việt Nam và Nhật Bản…………………………………………………………………………...50 Bảng 3.8. Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu cơ tại Việt Nam và Nhật Bản………………………………………………………………………….. 51 Bảng 3.9. Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu gan tại Việt Nam và Nhật Bản……………………………...………………………………. …….52 Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1.1. Một số cấu trúc của Ciguatoxin từ G. toxicus…………...……….10 Hình 1.2. Cấu trúc Pacific (P-CTX-1) và Caribbean (C-CTX-1) ciguatoxin…………………………………………………………………....11 Hình 1.3. Mô phỏng chuỗi thức ăn biển…………………………………… 12 Hình 1.4. Mô hình hệ thống LC-MS........................................................................................14 Hình 1.5. Khối phổ và thời gian lưu của 16 dẫn xuất CTXs ………...……..22 Hình 3.1. Sắc ký đồ CTX-1B chuẩn........................................................................................38 Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu cơ có cùng thời gian lưu so với mẫu chuẩn...............38 Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu gan có cùng thời gian lưu so với mẫu chuẩn............38 Hình 3.4. Sắc ký đồ một số mẫu dương tính khi phân tích CTXs bằng LC/MS-MS trên pha tĩnh Agilen. (A: C026; B: C029; C: C034; D: G035; E: G036)……………………………………..……………………….………...40 Hình 3.5. Sắc ký đồ một số mẫu dương tính khi phân tích CTXs bằng LC/MS-MS trên pha tĩnh Wakosil. (A: G028; B: G027; C: C026; D: C027; E: G030)………………………………………………………………………...42 Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu C034 khi phân tích CTXs trên 02 pha tĩnh (A: pha tĩnh Agilent; B: pha tĩnh Wakosil)……………………………… ………….43 Hình 3.7. Đánh giá độ đặc hiệu trên cột Agilent (A: sắc ký đồ mẫu cá chứa độc tố; B: sắc ký đồ Acetone; C: Sắc ký đồ chuẩn CTX-1B)………... …….44 1 MỤC LỤC MỤC LỤC........................................................................................................ 1 MỞ ĐẦU....................................................................................................... 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 7 1.1. NGỘ ĐỘC CIGUATERA ..................................................................... 7 1.1.1. Khái niệm .................................................................................... 7 1.1.2. Đối tượng gây ngộ độc ................................................................ 7 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng ................................................................. 7 1.2. ĐỘC TỐ CİGUATOXİNS .................................................................... 9 1.2.1. Bản chất, cấu trúc hoá học ......................................................... 9 1.2.2. Cơ chế hoạt động ...................................................................... 11 1.2.3. Nguồn gốc và sự tích luỹ sinh học ............................................ 11 1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ ..................................................................................................................... 12 1.3.1. Nguyên lý hoạt động ................................................................. 13 1.3.2. Sự kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ ................................. 16 1.3.3. Ứng dụng sắc ký khối phổ trong phân tích độc tố Ciguatoxins ..................................................................................................................... 16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 25 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU............................................................. 25 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM .................. 25 2.2.1. Nguyên liệu, thiết bị .................................................................. 25 2.2.1.1. Dung môi, hóa chất........................................................... 25 2.2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích ............................................... 26 2 2.2.2. Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ cơ và gan của Chình biển .............................................................................................................. 27 2.2.3. Xác định độc tố CTXs bằng phương pháp LC/MS-MS .......... 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 36 3.1. KẾT QUẢ CHİẾT RÚT VÀ TİNH SẠCH ĐỘC TỐ CTXS TỪ MỘT SỐ BỘ PHẬN CỦA CHÌNH BİỂN (CƠ, GAN) ....................................... 36 3.2. THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ CTXS TRONG CƠ, GAN, CHÌNH BİỂN................................................................................... 37 3.3. QUY TRÌNH THỰC NGHİỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ CTXS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC/MS-MS.................................................................... 46 3.4. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM (ĐỐI CHIẾU VỚI KẾT QUẢ KIỂM CHỨNG CỦA NHẬT BẢN).................. 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 56 3 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ciguatera (CFP) là dạng ngộ độc thực phẩm biển (NĐTPB) do ăn phải các loài cá rạn san hô vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt chứa độc tố ciguatoxin (CTX) và các dẫn xuất độc tố này. Độc tố CTXs được sản sinh ra do một loài vi tảo sống đáy là Gambierdiscus toxicus và được tích lũy qua chuỗi thức ăn biển. Đến nay đã phát hiện hơn 400 loài cá rạn có nguy cơ ngộ độc CFP. Mặc dù tỉ lệ tử vong thấp (0,1%), nhưng CFP hiện nay là một trong những mối lo ngại lớn của thế giới về mặt an toàn thực phẩm (ATTP), do độc tố có hiệu ứng dài hạn (vài tháng cho đến cả năm), là gánh nặng đối với dịch vụ y tế, chăm sóc sức khoẻ cộng đồng. CFP cũng gây nên tâm lý hoang mang, bất ổn cho người tiêu dùng, dẫn đến thiệt hại về kinh tế đối với ngành công nghiệp thuỷ hải sản nội địa và xuất khẩu của nhiều quốc gia. Trước đây, tình trạng ngộ độc CFP chỉ xảy ra ở Nam Thái bình dương, Caribbe và Ấn Độ, nhưng đến nay đã lan khắp châu A, châu u và Bắc My. My, từ thập niên 1970 đến nay, các vụ ngộ độc CFP đã tăng gấp 5 lần lên hơn 250 vụ mỗi năm. Trong khi đó, do nhập khẩu phần lớn hải sản, Hồng Kông mỗi năm xảy ra hàng trăm vụ ngộ độc CFP so với mức chưa đến 10 vụ vào những năm 1980. Tỷ lệ mắc và phân bố CFP trên thế giới ngày càng gia tăng, theo thống kê của FAO, hàng năm có khoảng 20,000 - 30,000 vụ ngộ độc CFP được ghi nhận, phần lớn tập trung tại các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, theo thông tin từ y tế địa phương, từ 2007 đến nay, hàng năm đều ghi nhận được rải rác các vụ ngộ độc nghi ngờ CFP, xảy ra chủ yếu ở các vùng ven biển Quảng Ngãi, Ninh Thuận, Bình Thuận,… Ở Năm 2012, hội thảo ATTP của EU đã báo cáo ghi nhận độc tố nghi ngờ CTXs trong cá Hồng nguồn gốc Việt Nam. Đến tháng 5/2017, EU chính thức cảnh báo về ATTP đối với mặt hàng cá Hồng xuất khẩu của Việt Nam. 4 Dù được rất nhiều sự quan tâm, hướng nghiên cứu về độc tố CTXs của thế giới vấp phải trở ngại lớn về phương pháp cũng như nguồn chất chuẩn rất quý hiếm. CTXs là những hợp chất polyete tan trong các dung môi hữu cơ, bền nhiệt (nhiệt độ cao và đóng băng) và bền pH (axit hay kiềm), không nhạy với ánh sáng tia cực tím, nên không thể phân biệt bằng trực quan. Gần đây, nhóm nhà khoa học Nhật Bản đã công bố về kết quả phát triển phương pháp mới phân tích độc tố CTXs trong mẫu thịt cá sử dụng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS). Tuy nhiên đến nay vẫn chưa có công bố về công trình nghiên cứu độc tố này tại Đông Nam A, gây khó khăn trong việc giám sát và cảnh báo vấn đề ATTP. Hơn nữa, quá trình nghiên cứu CFP tại Việt Nam gặp nhiều khó khăn như về đặc tính sinh học loài, nguồn gốc, cơ chế tích lũy và lan truyền độc tố trong chuỗi thức ăn biển rất phức tạp, đặc biệt là chưa có phương pháp phân tích phù hợp do thiếu trang thiết bị phân tích hiện đại chuyên sâu và chưa tiếp cận, cập nhật phương pháp phân tích của thế giới. Hiện nay, Viện Hải dương học đã xây dựng được quy trình phân tích độc tố trong cá Hồng nhưng chưa có quy trình phân tích đối với loài Chình biển, vì vậy, học viên chọn đề tài luận văn “Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố Ciguatoxins trong Chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ kép (LC/MS-MS).. Nội dung phân tích độc tố CTXs trong đề tài này sẽ sử dụng quy trình phân tích độc tố CTXs cập nhật mới nhất của Nhật Bản. Tuy nhiên, quy trình thực nghiệm trên cần được hiệu chỉnh phù hợp với điều kiện hệ thiết bị hiện có của Việt Nam cũng như thành phần hoá sinh của Chình biển để đảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của kết quả phân tích. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Dựa trên quy trình phân tích Ciguatoxins của Nhật Bản, tiến hành hiệu chỉnh để xây dựng được một quy trình thực nghiệm vừa phù hợp với điều kiện trang thiết bị tại Việt Nam vừa phù hợp với thành phần hóa sinh của Chình biển để đảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của kết quả phân tích. 5 3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu - 14 cá thể cá Chình, thuộc 4 loài Chình biển (cá Lịch vân vòng, cá Lịch vân sóng, cá Lịch chấm tia, cá Lịch mõm trắng) được thu mua tại đảo Lý Sơn (Quảng Ngãi), mỗi cá thể tách lấy 2 phần cơ và gan. 3.2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp chiết rút: dung môi Acetone được lựa chọn để hòa tan chất phân tích, tách chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu. - Phương pháp tinh sạch: thử nghiệm các điều kiện tinh sạch theo phương pháp chiết lỏng – lỏng và phương pháp chiết ly pha rắn SPE. - - Xác định độc tố CTX: phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS). Xử lý số liệu thực nghiệm, đánh giá hiệu quả của quy trình thực nghiệm bằng phương pháp thống kê F-test, T-test trong phần mềm Excel. - 4. Nội dung nghiên cứu Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ một số bộ phận của Chình biển (cơ, gan). - Lựa chọn pha tĩnh tối ưu để xác định độc tố CTX trong mẫu đã chiết bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS). - - Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố CTX bằng phương pháp LC/MS-MS. - Đánh giá kết quả của quy trình thực nghiệm trên cơ sở so sánh, đối chiếu với kết quả kiểm chứng tại PTN của Nhật Bản. 5. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu Trên cơ sở vận dụng những tiến bộ khoa học - ky thuật và công nghệ mới của thế giới, đây là hướng nghiên cứu mới, tiên phong tại Việt Nam. Mặt khác, kết quả của đề tài là dẫn liệu khoa học tin cậy phục vụ an toàn thực phẩm biển, và là tiền đề cần thiết để có những công trình công bố quốc tế về độc tố CTX trong sinh vật biển tại Việt Nam. 6 7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu Trước những năm 2010, ky thuật sắc ký lỏng đầu dò khối phổ đơn (single LC/MS) sử dụng chế độ quét ion chọn lọc (SIM) được áp dụng để phát hiện độc tố này. Sau đó, cùng với sự tiến bộ của khoa học ky thuật, sắc ký lỏng khối phổ sử dụng nguồn ion hóa phun mù điện tử (Electrospray ionization – ESI) được ứng dụng để định lượng độc tố CTXs với nguyên lý chọn lọc phân tử được proton hóa [M+NNH4]+N hoặc [M+NH]+N để cắt các phân tử nước trong bộ lọc khối tứ cực thứ 2 (Q2) của chế độ ghi phổ nhiều ion chọn lọc (Multi Reaction Monitoring, MRM). Tuy nhiên, các ion sau khi mất đi phân tử nước lại không đủ độ nhạy để phát hiện được ở nồng độ tương đương 0,01 ppb CTX-1B (giới hạn ATTP của US FDA). Khắc phục nhược điểm này, nhóm nghiên cứu của Yogi đã phát triển thành công phương pháp sử dụng LC/MS-MS với chế độ SIM và MRM có độ nhạy cao hơn, sử dụng cách bắt cặp phân tử CTX với một số ion dương hoặc âm (H+N, Na+N, K+N, NH4-, SO42-, OH-…). Phương pháp này được đánh giá có ưu thế về độ nhạy và tính ứng dụng trong phân tích định lượng độc tố CTXs, mặc dù đầu dò khối phổ độ phân giải cao (HRMS) ghép nối với hệ sắc ký đã được chứng minh được khả năng phát hiện các đồng phân của độc tố CTXs trong điều kiện thiếu vắng chất chuẩn. Tuy nhiên, tuỳ thuộc vào thông số ky thuật của từng hệ thống thiết bị LC/MS-MS, đòi hỏi quá trình thăm dò, thử nghiệm nhằm tối ưu hoá quy trình phân tích bao gồm công đoạn tách chiết, loại tạp chất trong mẫu, điều kiện phản ứng (nhiệt độ, áp suất…) và hệ dung môi pha động (đẳng dòng hay đổi dòng), cột sắc ký… phù hợp để có được LOD và LOQ tốt nhất đối với phân tích độc tố CTXs. Báo cáo này trình bày quy trình thực nghiệm tối ưu hoá phương pháp phân tích độc tố CTXs trong mẫu Chình biển sử dụng hệ thống sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ kép Shimadzu LCMS 8040 tại phòng thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về An toàn thực phẩm và môi trường (khu vực miền Trung) tại Viện Hải dương học. 7 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NGỘ ĐỘC CIGUATERA 1.1.1. Khái niệm Ciguatera Fish Poisoning (CFP) là một dạng ngộ độc thực phẩm biển ở người do tiêu thụ các loài cá rạn vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới đã tích lũy độc tố Ciguatoxin (CTX). Độc tố CTX được biết đến có nguồn gốc từ loài vi tảo giáp sống đáy Gambierdiscus toxicus [2]. Theo một bài báo cáo được FAO công bố năm 2004, hơn 400 loài cá được biết đến là nơi di truyền ngộ độc CFP. 1.1.2. Đối tượng gây ngộ độc Con người đều được cho là nhạy cảm với độc tố CTX [3]. Dân cư ở các vùng biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới có khả năng ảnh hưởng cao nhất do tần suất cao tiêu thụ các loài cá độc. Tuy nhiên, sự gia tăng mức tiêu thụ sản phẩm thủy sản cùng với sự gia tăng giao thông liên khu vực của các sản phẩm thủy sản đã mở rộng phạm vi địa lý của các vụ ngộ độc CFP [3]. 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng “Ciguatera. là một hội chứng lâm sàng với chuẩn đoán chủ yếu vẫn dựa trên tiền sử tiêu thụ cá rạn san hô và biểu hiện lâm sàng được xác định bởi cả triệu chứng tiêu hóa và thần kinh [2]. Sự khác biệt về địa lý cũng sẽ gây ra sự khác biệt về triệu chứng của các bệnh nhân. Khởi phát của triệu chứng CFP thường bắt đầu bằng các vấn đề của đường tiêu hóa như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau bụng trong vòng 12 giờ sau khi ăn phải cá có độc tố. Các triệu chứng thường thuyên giảm trong vòng 24 giờ [2]. Các vấn đề về tim mạch cũng có thể xuất hiện trong suốt giai đoạn cấp tính này, thường là nhịp tim chậm và hạ huyết áp. Từ vài giờ đến hai tuần sau khi ngộ độc cá ciguatera, những vấn đề về thần kinh như đau đầu, đau cơ, dị cảm (tê và ngứa ran ở vùng ngoại vi và tứ chi), rối loạn cảm giác nhiệt độ (sự đảo ngược cảm giác nhiệt độ với các vật 8 thể lạnh sẽ cảm thấy nóng và ngược lại),… có thể xuất hiện [2]. Các triệu chứng thần kinh chủ quan khác được báo cáo như vị kim loại, ngứa, đau khớp và đau cơ (đau cơ đặc biệt là ở chân) và cảm giác răng lung lay [2]. Có thể xuất hiện triệu chứng chấn động não đến 10 ngày sau khi bị ngộ độc. Đau đầu nhiều vị trí, đau dữ dội và kéo dài cũng là biểu hiện khi ngộ độc ciguatera. Những triệu chứng liên quan đến hệ thần kinh trung ương (tê liệt, mất điều hòa, choáng váng và nhầm lẫn) thường là dấu hiệu của các trường hợp nghiêm trọng nhất. Một loạt các triệu chứng rối loạn thần kinh đã được báo cáo sau khi ngộ độc ciguatera bao gồm mệt mỏi, lo lắng, trầm cảm, hysteria, rối loạn trí nhớ, thiếu hiệu quả về tinh thần. Vấn đề tiêu hóa cấp tính thường giải quyết trong vòng 1 hoặc 2 ngày và các rối loạn tim mạch đảo ngược trong vòng 48 – 72 giờ. Sự phục hồi từ các triệu chứng thần kinh là lâu hơn và ít dự đoán hơn, từ 1 tuần đến 6 tháng. Ngứa, đau khớp và mệt mỏi có thể kéo dài trong nhiều tháng hoặc nhiều năm. Sự mệt mỏi có thể dẫn đến suy nhược như một hội chứng mệt mỏi mãn tính. Mãn tính có thể phản ánh sự tồn tại lâu dài của ciguatoxins trong cơ thể. Sự tồn tại của các triệu chứng ở một số bệnh nhân trong vài năm đã được ghi nhận và không có gì bất thường. Khoảng 65% số bệnh nhân có triệu chứng từ 6 tháng hoặc lâu hơn với báo cáo tái phát lên đến 2 năm. Ở Thái bình dương, các báo cáo đã ghi nhận về sự tiến triển nhanh chóng của triệu chứng thần kinh khi ngộ độc CFP, dẫn đến suy hô hấp, hôn mê và đôi khi tử vong [2]. Trên cơ sở các quan sát cho thấy rằng việc tiếp xúc nhiều lần với độc tố ciguatera có liên quan đến một bệnh lâm sàng nặng hơn, người ta đã đưa ra giả thuyết rằng CTX tan trong chất béo có khả năng tích tụ trong cơ thể người và làm giảm ngưỡng chịu đựng của cơ thể. Tuổi thọ và cân nặng càng lớn càng làm tăng khả năng lưu giữ độc tố, cũng có liên quan đến thời gian và mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng nhiễm độc. Các hành vi về thể chất hoặc chế độ ăn uống (ví dụ: tập thể dục, uống rượu hoặc uống quá nhiều 9 caffein) hoặc tiếp xúc lại với độc tố CTX có thể gây tái phát lại các triệu chứng ngộ độc. 1.2. ĐỘC TỐ CİGUATOXİNS 1.2.1. Bản chất, cấu trúc hoá học Ciguatoxin là các polyether gồm 13 – 14 vòng liên kết với nhau bằng các liên kết ether tạo thành một cấu trúc bền vững. CTX tan trong lipid nên khi vào cơ thể dễ dàng tấn công vào các màng tế bào, gây ngộ độc nhanh chóng. Phân tử CTX tương đối bền nhiệt, không bị phá hủy hay biến tính khi chế biến thức ăn. Độc tố này không mùi, không vị và thường không thể phát hiện bằng các thử nghiệm đơn giản. CTX trong cá có nhiều đồng phân liên quan chặt chẽ với nhau. CTX phân lập từ vùng biển Pacific (P-CTX) được xác định các đặc trưng cấu trúc trước các CTX phân lập từ Caribbean (C-CTX). 02 dạng này có sự khác biệt tương đối cả về cấu trúc phân tử và độc tính [2]. P-CTX được Scheuer và cs. phân lập đầu tiên từ cá Chình năm 1967. Một thập kỉ sau, Yasumoto và cs.,1977 đã phát hiện ra nguồn gốc của CTX ở quần đảo Gambier và đặt tên cho sinh vật sản sinh độc tố là Gambierdiscus toxicus [2]. Cấu trúc chính của P-CTX phân lập từ cá Chình được mô tả hoàn chỉnh năm 1989 [2] và được gọi là Gambiertoxin 4B hoặc P-CTX-4B (Hình 1.1). 10 P-CTX 4B P-CTX-3C 51-Hydroxy P-CTX-3C Hình 1.1. Một số cấu trúc của Ciguatoxin từ G. toxicus [2] 11 P-CTX-1: R1 = CH2OHCHOH; R2 = OH C-CTX-1 Hình 1.2. Cấu trúc Pacific (P-CTX-1) và Caribbean (C-CTX-1) ciguatoxin [2] 1.2.2. Cơ chế hoạt động Do có thể hòa tan trong chất béo, nên khi hấp thu vào máu đến các tế bào, CTXs sẽ tấn công vào màng tế bào, khử cực màng tế bào, mở cực màng tế bào thần kinh cho ion Na+N vào bên trong tế bào tạo ra sự kích động thần kinh, làm hư hại sự tái tạo tế bào thần kinh. 1.2.3. Nguồn gốc và sự tích luỹ sinh học Những quan sát chi tiết của Randall (1958) về hành vi kiếm ăn của các loài cá ở Thái bình dương đã đưa ông đến giả thuyết rằng độc tố CTXs do vi 12 sinh vật sống đáy sản xuất, sau đó được tiêu thụ bởi các loài cá bé và chuyển qua các loài cá lớn hơn theo chuỗi thức ăn. Bọn vi tảo giáp sống đáy thuộc chi Gambierdiscus xuất hiện ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Loài tảo này sản sinh CTX và/hoặc tiền chất của CTX (Gambiertoxin). G. toxicus là trọng tâm chính của các nghiên cứu độc tính của CTX trong nhiều năm, tuy nhiên sau đó, có thêm các nghiên cứu về một số loài Gambierdiscus mới như G. belizeanus [4], G.yasumotoi [5], G. pacificus, G. australes, G. polynesiensis [6]. Ngoài sự khác biệt về mức độ độc tính của loài, độc tính của từng chủng Gambierdiscus có thể rất khác nhau và phụ thuộc vào một số yếu tố môi trường [2]. Tảo giáp dinoflagellate thuộc chi Gambierdiscus xuất hiện ở vùng biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới trên thế giới. Loài tảo này sản sinh ciguatoxin và/hoặc tiền chất của ciguatoxin (gambiertoxin) [3]. Các gambiertoxin được chuyển từ sinh vật đáy sang các loài ăn thực vật (cá, động vật không xương sống…) và sau đó đến cá ăn thịt thông qua chuỗi thức ăn biển. Độc tố sẽ lớn dần theo chuỗi thức ăn. Con người khi ăn phải cá ăn thực vật hoặc cá ăn thịt bị ô nhiễm sẽ gây ra triệu chứng ngộ độc CFP. Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ CTX tích lũy trong cá bao gồm tốc độ ăn vào, hiệu quả của quá trình đồng hóa, mức độ và tính chất của bất kỳ biến đổi sinh học độc tố, tốc độ suy giảm và tốc độ tăng trưởng của cá [7]. Hình 1.3. Mô phỏng chuỗi thức ăn biển [7] 1.3. PHƯƠNG PHAP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ Hiện nay sắc ký lỏng ghép cặp khối phổ LC-MS được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, môi trường, thực phẩm, vật liệu công nghiệp và một số mảng khác. 13 1.3.1. Nguyên lý hoạt động Nhìn chung, sắc ký lỏng LC cho phép tách các thành phần khác nhau trong cùng một mẫu dựa vào sự khác biệt về tính ái lực (lực lưu giữ chất) đối với pha tĩnh của cột và với pha động, và tùy thuộc vào tính chất của từng thành phần mà phát hiện chúng bởi đầu dò UV, huỳnh quang, độ dẫn điện... Bằng cách sử dụng những đầu dò này, việc tiến hành phân tích định tính các hợp chất chủ yếu dựa trên thời gian lưu, phân tích định lượng dựa vào chiều cao và diện tích đỉnh. Phương pháp sắc ký có thể cho phép phân tách xuất sắc các chất; tuy nhiên, việc định danh và định lượng một cách đáng tin cậy sẽ gặp khó khăn trong trường hợp có nhiều thành phần rửa giải cùng lúc từ cột sắc ký cũng như khi phải tiến hành phân tích đồng thời tất cả các chất có mặt trong mẫu. Mặt khác, khối phổ MS là phương pháp phát hiện có độ nhạy cao; đầu tiên các loại chất phân tích được ion hóa bằng nhiều ky thuật khác nhau, sau đó trong chân không các ion phát sinh này được phân loại dựa trên cơ sở tỉ lệ khối lượng trên điện tích của mỗi ion (tỉ lệ m/z) và sau cùng tiến hành đo cường độ của chúng. Phổ khối lượng thu được cho thấy một mức độ xuất hiện các ion sao cho mỗi ion đi kèm với một số khối, do đó, MS hỗ trợ rất lớn trong việc phân tích định lượng. Số khối thu được trực tiếp từ khối phổ, là một thông tin đặc trưng cho (từng) phân tử. Tuy nhiên, đó là khi các thành phần trong mẫu được phân tích độc lập với nhau. Nếu nhiều chất phân tích đồng thời được tiêm vào thì việc giải phổ trở nên cực kì khó khăn. LC-MS là một hệ thống thiết bị tập hợp vừa khả năng phân tách chất xuất sắc của LC và vừa khả năng định lượng xuất sắc của MS. Một phổ khối thu được bằng cách sử dụng chế độ quét (scan analysis) sẽ cho biết khối lượng phân tử và thông tin về cấu trúc, trong khi thời gian lưu được cung cấp bởi các đầu dò LC nhằm thực hiện phân tích định tính. Ngoài ra, chế độ quét ion chọn lọc SIM (Selected Ion Monitoring) sẽ căn cứ vào số khối – là một thông số cung cấp độ chọn lọc cao. Ngay cả trong trường hợp sự phân tách bằng sắc ký lỏng không đáp ứng đủ, có thể tiến hành phân tích định lượng nhằm tránh ảnh hưởng của tạp chất. MS tổng hợp giữa khả năng phân tích đa 14 dạng các chất cùng với tính chọn lọc nên được đánh giá là đầu dò rất hiệu quả trong sắc ký lỏng. Hệ thống phân tích khối phổ kế gồm có bộ phận đưa mẫu vào (như hệ thống HPLC, GC…), bộ phận ghép nối giữa bộ phận tiêm mẫu và những bộ phận của hệ thống MS, nguồn ion hóa mẫu, các thấu kính tĩnh điện giúp tạo ion một cách hiệu quả, khối phổ kế phân tách ion theo tỉ lệ m/z và các ion sau lọc sẽ đi vào đầu dò. Căn cứ phương pháp phân tách ion, có nhiều loại khối phổ kế khác nhau. Hệ thống khối phổ có chế độ ion hóa ở áp suất khí quyển kèm với sử dụng bộ phân tích khối tứ cực (còn gọi là bộ lọc khối tứ cực) thường được dùng như một đầu dò trong sắc ký lỏng ghép cặp khối phổ LCMS. Một số ky thuật ion hóa ở áp suất khí quyển như ion hóa đầu phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI),…; và chúng được dùng vừa như bộ phận ghép nối với HPLC và vừa như nguồn cung ion. Sau khi desolvat hóa, tại đây các ion tạo thành được điều hướng bởi bát cực để di chuyển bộ phân tích khối tứ cực. Trong bộ phân tích khối tứ cực, điện thế một chiều và xoay chiều RF (radio frequency - tần số vô tuyến) được xen kẽ vào trên đường di chuyển của các ion, do đó chỉ các ion đáp ứng đúng tỉ lệ m/z lựa chọn trước mới có thể đi qua các cặp đối diện của các thanh này. Số lượng ion đi đến đầu dò sẽ được chuyển đổi thành tín hiệu và được ghi nhận bởi máy vi tính. Hình 1.4. Mô hình hệ thống LC-MS